Tierärztliche Hochschule Hannover
Effekt selektiver und nicht selektiver nicht steroidaler Antiphlogistika auf die Entzündungsreaktion von durch Ischämie und Reperfusion
geschädigtem equinem Jejunum in vivo
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
– Doctor medicinae veterinariae – (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Anna Wagner
aus Köln
Hannover 2017
Wissenschaftliche Betreuung:
1. Prof. Dr. Karsten Feige Klinik für Pferde 2. Prof. Dr. Ralph Brehm
Anatomisches Institut
1. Gutachter: Prof. Dr. Karsten Feige
2. Gutachter: Prof: Dr. Marion Hewicker-Trautwein
Tag der mündlichen Prüfung: 09.05.2017
Meinen lieben Eltern
und Hannes
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 3
2.1 Histologischer Aufbau der Darmwand ... 3
2.2 Darmstrangulationen ... 3
2.3 Postoperativer paralytischer Ileus (POI) ... 4
2.3.1 Postoperativer Ileus (POI) – Pathogenese ... 4
2.4 Intestinale Ischämie und Reperfusion ... 5
2.4.1 Makroskopische und histologische Charakterisierung ... 6
2.4.2 Biochemische Kaskade ... 7
2.5 Zelluläre Veränderung während der intestinalen Entzündung ... 8
2.5.1 Neutrophile Granulozyten ... 8
2.5.1.1 Rekrutierung neutrophiler Granulozyten ... 8
2.5.1.2 Nachweisverfahren ... 9
2.5.1.3 Infiltration neutrophiler Granulozyten im geschädigten Dünndarm ... 9
2.5.2 Eosinophile Granulozyten ... 10
2.5.2.1 Nachweis eosinophiler Granulozyten... 11
2.5.2.2 Eosinophile Granulozyten im geschädigten Dünndarm ... 11
2.6 Cyclooxygenasen... 11
2.6.1 Cyclooxygenase-1 ... 12
2.6.1.1 Cyclooxygenase-1-Aktivierung ... 13
2.6.2 Cyclooxygenase-2 ... 14
2.6.2.1 Induzierbarkeit der Cyclooxygenase-2 ... 15
2.6.2.2 Funktion der Cyclooxygenase-2 ... 16
2.7 Entzündungsmediatoren ... 16
2.7.1 Prostaglandine ... 16
2.7.1.1 Prostaglandine im Gastrointestinaltrakt ... 17
2.7.1.2 Effekt der Prostaglandine auf die Schleimhautbarriere von ischämisch geschädigtem Dünndarm ... 17
2.8 Nicht steroidale Antiphlogistika ... 17
2.9 Einzelwirkstoffe ... 18
2.9.1 Flunixin-Meglumin ... 18
2.9.1.1 Pharmakokinetik ... 18
2.9.2 Firocoxib ... 20
2.9.2.1 Pharmakokinetik ... 20
2.9.3 Nebenwirkungen der NSAIDs ... 20
2.9.4 Effekt von NSAIDs auf die Darmregeneration ... 21
2.9.5 Effekt von NSAIDs auf die Darmkontraktilität ... 22
2.9.6 Schmerzmanagement mit NSAID ... 22
3 Material und Methoden ... 24
3.1 Probanden ... 24
3.2 Methoden ... 25
3.2.1 Vorbereitung der Probanden ... 25
3.2.1.1 Lagerung und sterile Vorbereitung des Pferdes ... 26
3.2.1.2 In-vivo-Modell ... 26
3.2.1.3 Oxygentosee-Gerät ... 26
3.2.2 Ischämie und Reperfusion ... 28
3.2.2.1 Probenentnahme ... 28
3.2.2.2 Probenfixierung ... 30
3.3 Labordiagnostik ... 31
3.3.1 Probenaufbereitung ... 31
3.3.2 Vorbehandlung für histologische Färbungen und Immunhistochemie ... 32
3.3.3 Histologische Färbung ... 32
3.3.3.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung – Übersichtsfärbung ... 32
3.3.3.2 Luna-Färbung – Darstellung eosinophiler Granulozyten ... 33
3.3.4 Immunhistochemie ... 34
3.3.4.1 Immunhistochemie – Calprotectin ... 34
3.3.4.2 Immunhistochemie – Darstellung der Cyclooxygenase-1 ... 35
3.3.4.3 Immunhistochemie – Darstellung der Cyclooxygenase-2 ... 35
3.4 Auswertung ... 36
3.4.1 Lichtmikroskopische Untersuchung ... 36
3.4.2 Luna-Färbung und Calprotectin-Immunhistochemie ... 36
3.4.2.1 Tunica muscularis ... 36
3.4.2.2 Tunica serosa ... 37
3.4.3 Statistische Auswertung ... 38
3.4.3.1 Quantifizierung der eosinophilen Granulozyten ... 38
3.4.3.2 Quantifizierung der neutrophilen Granulozyten ... 38
3.4.4 Deskriptive Beurteilung der COX-1- und COX-2-Darstellungen ... 38
4 Ergebnisse ... 41
4.1 Deskription der eosinophilen Granulozyten ... 41
4.2 Quantifizierung der eosinophile Granulozyten ... 43
4.2.1 Tunica muscularis ... 43
4.2.1.1 Zirkulärmuskelschicht ... 43
4.2.1.2 Longitudinalmuskelschicht ... 43
4.2.2 Tunica serosa ... 43
4.3 Deskription der neutrophilen Granulozyten ... 44
4.3.1 Kontroll-Probe Jejunum – ungeschädigtes Darmgewebe – Pferde mit NSAID behandelt ... 44
4.3.2 Jejunum nach Ischämie – Pferde mit NSAID behandelt ... 45
4.3.3 Jejunum nach Reperfusion – Pferde mit NSAID behandelt ... 48
4.3.4 Weitere ungeschädigte Jejunumlokalisationen und Ileum – Pferde mit NSAID behandelt ... 50
4.3.5 Ungeschädigter Dickdarm (Beckenflexur, Caecum) – Pferde mit NSAID behandelt ... 51
4.3.6 Negativkontrolle ... 53
4.3.7 Zusammenfassung der Deskription der neutrophilen Granulozyten ... 53
4.3.7.1 K-, I- und IRProben –mit NSAID: ... 53
4.3.7.2 Weitere Jejunum-, Ileum- und Kolonlokalisationen ... 54
4.4 Quantifizierung der neutrophilen Granulozyten ... 55
4.4.1 Tunica muscularis ... 55
4.4.1.1 Zirkulärmuskulatur ... 55
4.4.1.2 Longitudinalmuskulatur ... 55
4.4.2 Tunica serosa ... 56
4.4.3 Weitere Jejunum-, Ileum- und Dickdarmlokalisationen ... 57
4.4.3.1 Tunica muscularis ... 57
4.4.3.2 Tunica serosa ... 57
4.5 Deskription der COX-1-Expression ... 58
4.5.1 Kontroll-Probe Jejunum – Nachweis der COX-1-Expression ... 58
4.5.2 Ischämiegeschädigtes Jejunum – Nachweis der COX-1-Expression ... 60
4.5.3 Ischämiegeschädigtes Jejunum nach Reperfusion – Nachweis der COX-1- Expression... 63
4.5.4 ngeschädigte Jejunumokalisationen und Ileum – Nachweis der COX- 1Expression ... 65
4.5.5 Ungeschädigter Dickdarm (Beckenflexur, Caecum) – Nachweis der COX- 1-Expression ... 67
4.5.6 Negativkontrolle ... 69
4.5.7 Zusammenfassung der Deskription der COX-1-Expression ... 69
4.5.7.1 K-, I- und IR-geschädigte Proben mit NSAID ... 69
4.5.7.2 Weitere Jejunum-und Ileumlokalisationen ungeschädigt mit NSAID ... 69
4.5.7.3 Dickdarmproben ungeschädigt mit NSAID ... 70
4.6 Deskription der COX-2-Expression ... 70
4.6.1 Kontroll-Probe Jejunum – Nachweis der COX-2-Expression ... 70
4.6.2 Ischämiegeschädigtes Jejunum – Nachweis der COX-2-Expression ... 71
4.6.3 Ischämiegeschädigtes Jejunum nach Reperfusion – Nachweis der COX-2- Expression... 74
4.6.4 ngeschädigte Jejunumokalisationen– Nachweis der COX-2Expression .. 75
4.6.5 Ungeschädigter Dickdarm (Beckenflexur, Caecum) – Nachweis der COX- 2-Expression ... 78
4.6.6 COX-2-Negativkontrollen ... 80
4.6.7 Zusammenfassung der COX-2-Ergebnisse ... 80
4.6.7.1 K-, I- und IR-geschädigte Proben mit NSAID ... 80
4.6.7.2 Weitere Jejunum- und Ileumlokalisationen ungeschädigt mit NSAID ... 80
4.6.7.3 Dickdarmproben ungeschädigtmit NSAID ... 81
5 Diskussion ... 83
5.1 Methodik – Versuchaufbau ... 83
5.1.1 Probanden ... 83
5.1.2 Versuchsaufbau ... 84
5.1.2.1 Auswahl der nicht steroidalen Antiphlogistika ... 84
5.1.2.2 Applikationszeitpunkt der nicht steroidalen Antiphlogistika ... 85
5.1.2.3 Anlegen der Ischämie ... 85
5.1.2.4 Kontrolle des ischämischen Zustands ... 86
5.1.2.5 Reperfusion ... 87
5.1.2.6 Probenabstände ... 87
5.1.3 Methodik/histologische Auswertung ... 88
5.1.3.1 Luna-Färbung ... 88
5.1.3.2 ImmunhistochemieCalprotectin ... 88
5.1.3.3 ImmunhistochemieCOX-1 und COX-2 ... 89
5.2 Ergebnisse ... 90
5.2.1 Eosinophile Granulozyten ... 90
5.2.2 Neutrophile Granulozyten ... 91
5.2.2.1 Allgemein ... 91
5.2.2.2 Gegenüberstellung der NeutrophilenInfiltration in der Zirkulär- und
Longitudinalmuskulatur ... 93
5.2.2.3 Effekt der nichtsteroidalen Antiphlogistika ... 94
5.2.2.4 Klinische Relevanz – Postoperativer Ileus ... 95
5.2.3 Cyclooxygenase-1 ... 97
5.2.3.1 Konstitutive Expression ... 97
5.2.3.2 COX-1-Expression bei ischämischer Schädigung und Reperfusion ... 97
5.2.3.3 COX-1Expression innerhalb der Muskelschichten ... 98
5.2.3.4 COX-1-Expression in den Muskelzellen der Tunica muscularis ... 100
5.2.3.5 COX-1Expression in weiteren Zellpopulationen der Tunica muscularis und Tunica serosa ... 101
5.2.4 Cyclooxygenase-2 ... 102
5.2.4.1 COX-2-Expression ... 102
5.2.4.2 Expression nach Ischämie und Reperfusion ... 103
5.2.4.3 COX-2-Expression innerhalb der Muskelschichten ... 104
5.2.4.4 COX-2-Expression innerhalb der Muskelzellen der Tunica muscularis ... 106
5.2.4.5 COX-2 in weiteren Zellpopulationen der Tunica muscularis und Tunica serosa ... 106
5.2.4.6 COX-2-Expression in den Endothelzellen ... 107
5.2.5 Effekt der NSAIDs auf die Expression von COX-1 und COX-2 in der Tunica muscularis und Tunica serosa ... 108
5.3 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick ... 109
6 Zusammenfassung/Summary ... 113
7 Literatur ... 117
8 Anhang ... 135
8.1 Versuch ... 135
8.1.1 Medikamente ... 135
8.1.2 Geräte ... 135
8.1.3 Verbrauchsmaterialien ... 136
8.2 Probenbearbeitung ... 136
8.2.1 Fixierlösung ... 136
8.2.2 Lösungen Hämatoxylin-Eosin-Färbung ... 136
8.2.3 Lösungen Luna-Färbung ... 137
8.2.4 Puffer und Lösungen Immunhistochemie ... 137
8.2.5 Stoffe und Reagenzien ... 139
8.2.6 Antikörper ... 140
8.2.7 Geräte ... 140
8.2.8 Verbrauchsmaterialien ... 141
8.3 Tabellarische Auswertung Calprotectin ... 143
8.3.1 Probe Kontrolle ... 143
8.3.2 Probe Ischämie ... 144
8.3.3 Probe Ischämie-Reperfusion ... 145
8.3.4 Probe Plica duodenocolica ... 146
8.3.5 ProbeIleum ... 147
8.3.6 ProbePlica ileocaecalis ... 148
8.3.7 ProbeCaecum... 149
8.3.8 ProbeBeckenflexur ... 150
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Histologischer Aufbau der Darmwand ... 3 Abb. 2: Mechanismus der Xanthinoxidase während Ischämie und Reperfusion
modifiziert nach GRANGER et al. (1988) ... 8 Abb. 3: Monitordarstellung einer Messung des O2C-Gerätes ... 28 Abb. 4: Versuchsaufbau und Zeitpunkte der Probenentnahmen, modifiziert nach
FRANZ (2013) ... 29 Abb. 5: Mittleres equines Jejunum ... 30 Abb. 6: Tunica muscularis und Tunica serosa – schematische Darstellung der
Auswertung ... 37 Abb. 7: Luna-Färbung – Repräsentative Darstellung der eosinophilen Granulozyten
in der Tunica muscularis und Tunica serosa ... 42 Abb. 8: Anzahl eosinophiler Granulozyten pro Quadratmillimeter in der
Longitudinalmuskulatur (LM) nach der Behandlung mit einem nicht
steroidalen Antiphlogistikum (NSAID) ... 44 Abb. 9: Immunhistochemische Darstellung der neutrophilen Granulozyten am
equinen Jejunum in den ungeschädigten Kontroll-Proben ... 45 Abb. 10: Immunhistochemische Darstellung der neutrophilen Granulozyten am
equinen Jejunum nach Ischämie ... 47 Abb. 11: Immunhistochemische Darstellung der neutrophilen Granulozyten am
equinen Jejunum nach Ischämie und Reperfusion ... 49 Abb. 12: Immunhistochemische Darstellung der neutrophilen Granulozyten am
ungeschädigtem equinen Jejunum und Ileum nach Ischämie und
Reperfusion... 51 Abb. 13: Immunhistochemische Darstellung der neutrophilen Granulozyten im
ungeschädigten Dickdarm nach Ischämie und Reperfusion ... 52 Abb. 14: Repräsentative Negativkontrollen des MAC-387(Calprotectin)-Antikörpers
in den Reperfusionsproben ... 53 Abb. 15: Neutrophile Granulozyten pro Quadratmillimeter (mm²) in der
Zirkulärmuskulatur ... 55 Abb. 16: Neutrophile Granulozyten pro Quadratmillimeter (mm²) in der
Longitudinalmuskulatur ... 56 Abb. 17: Neutrophile Granulozyten pro Quadratmillimeter (mm²) in der Tunica
serosa ... 57 Abb. 18: Immunhistochemische Darstellung der COX-1 Expression am
ungeschädigten equinen Jejunum ... 60 Abb. 19: Immunhistochemische Darstellung der COX-1 Expression am equinen
Jejunum nach Ischämie... 62 Abb. 20: Immunhistochemische Darstellung der COX-1 Expression am equinen
Jejunum nach Ischämie und Reperfusion ... 64 Abb. 21: Immunhistochemische Darstellung der COX-1 Expression am
ungeschädigten equinen Jejunum und Ileum... 66 Abb. 22: Immunhistochemische Darstellung der COX-1 Expression am
ungeschädigten equinen Dickdarm ... 68 Abb. 23: Repräsentative Negativkontrollen des COX-1 Antikörpers in den
Reperfusionsproben ... 69 Abb. 24: Immunhistochemische Darstellung der COX-2 Expression am
ungeschädigten equinen Jejunum vor Anlegen der Ischämie ... 71 Abb. 25: Immunhistochemische Darstellung der COX-2 Expression am equinen
Jejunum nach Ischämie... 73
Abb. 26: Immunhistochemische Darstellung der COX-2 Expression am equinen Jejunum nach Ischämie und Reperfusion ...75 Abb. 27: Immunhistochemische Darstellung der COX-2 Expression am
ungeschädigten equinen Jejunum und Ileum nach Ischämie und
Reperfusion ...77 Abb. 28: Immunhistochemische Darstellung der COX-2 Expression am
ungeschädigten equinen Dickdarm nach Ischämie und Reperfusion ...79 Abb. 29: Repräsentative Negativkontrollen des COX-2 Antikörpers in den
Reperfusionsproben ...80
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Überblick der Probanden ...25 Tabelle 2: Eosinophile Granulozyten pro Quadratmillimeter ...43 Tabelle 3: Neutrophile Granulozyten pro Quadratmillimeter in den ungeschädigten
Jejunum-, Ileum- und Dickdarmproben sowie der Kontroll- und
Reperfusions-Proben ...58 Tabelle 4: Übersicht der quantitativen und deskriptiven positiven Zellreaktionen in
der Tunica muscularis und Tunica serosa ...82
Abkürzungsverzeichnis
AMP Adenosinmonophosphat
ATP Adenosintriphosphat
BSA bovines Serumalbumin
COX Cyclooxygenase
DMSO Dimethylsulfoxid
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ER endoplasmatisches Retikulum
et al.
FC FM
et alii (und andere) Firocoxib
Flunixin Meglumin
GE Gesamteiweiß
Hkt Hämatokrit
HE Hämatoxylin-Eosin
HUVEC human umbilical vein endothelial cells (humane Endothelzellen der Nabelvene)
IFEE I-Probe IM IR-Probe
Idiopathic eosinophilic enteritis
(idiopathische fokale eosinophile Enteritis) Ischämie-Probe
Intermuskuläre Schicht Ischämie-Reperfusionsprobe KGW
K-Probe LM
Körpergewicht Kontroll-Probe
Longitudinalmuskulatur
LPS Lipopolysaccharide
NSAID Nicht steroidales Antiphlogistikum
NO Stickstoffmonoxid
NOS Stickstoff-Synthase
PCR Polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion)
PBS Phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
PGD2 Prostaglandin D2
PGE2 Prostaglandin E2
PGF2α Prostaglandin F2α
PGI2 Prostaglandin I2
PMN Polymorphkernige Zellen
POI Postoperativer Ileus
ROS S
Reactive oxygen species (Reaktive Sauerstoff spezies) Tunica Serosa
SOD Superoxiddismutase
TEC Tris-EDTA-Citrat
TEER Transepithelialer Widerstand
TXA2 Thromboxan A2
TXB2 Thromboxan B2
WBC White blood cells XO
ZM
Xanthinoxidase Zirkulärmuskulatur
1 Einleitung
Kolik stellt beim Pferd nach dem Alter die zweithäufigste Todesursache dar (TINKER et al. 1997).
Ein postoperativer Ileus (POI) entwickelt sich bei Obstruktionen und Strangulationen des Dünndarms signifikant häufiger als bei Pferden mit Kolonobstruktionen (ROUSSEL et al. 2001;
MAIR u. SMITH 2005).
Eine wichtige Rolle für die Entstehung eines Ischämie-Reperfusions-Schadens scheinen neutrophile Granulozyten einzunehmen. Bisher gibt es nur wenige Studien, die sich mit der Entzündungsreaktion in der Tunica muscularis von durch Ischämie und Reperfusion geschädigtem equinem Jejunum beschäftigt haben (LITTLE et al. 2005; VENTE 2011; FRANZ 2013). Dabei infiltrierten innerhalb der Tunica muscularis signifikant mehr neutrophile Granulozyten die Longitudinalmuskulatur als die Zirkulärmuskulatur in den ischämie- und reperfusionsgeschädigten Jejunumproben (LITTLE et al. 2005; FRANZ 2013). Erstmalig wurden in der Studie von FRANZ (2013) in benachbarten, nicht direkt geschädigten Jejunumabschnitten signifikante Zunahmen an Granulozyten im Anschluss an die Ischämie und Reperfusion beobachtet.
In Untersuchungen an Ratten wurde festgestellt, dass allein die Manipulation des Darms zu einer Leukozyteninfiltration in die glatte Muskulatur führte und einen In-vitro-Abfall der Kontraktilität bedingte (KALFF et al. 1998; SCHWARZ et al. 2004). Die Verabreichung eines nicht selektiven nicht steroidalen Antiphlogistikums (NSAID) (Wirkstoff: Flunixin-Meglumin) führte beim Pferd in vitro zu einer gesteigerten Kontraktilität der Zirkulärmuskulatur nach Ischämie und anschließender Reperfusion, während die Applikation eines selektiven NSAID (Wirkstoff:
Firocoxib) keinen kontraktionssteigernden Effekt auf die Zirkulärmuskulatur besaß (WOGATZKI 2015).
Ob NSAIDs einen Effekt auf die Entzündungsreaktion in der Tunica muscularis besitzen und ob Unterschiede nach der Behandlung mit einem selektiven oder nicht selektiven NSAID beobachtet werden können, wurde bisher nur in der Studie von FRANZ (2013) untersucht.
Einen Einfluss des eingesetzten nicht selektiven NSAID Flunixin-Meglumin und des selektiven NSAID Firocoxib auf die Entzündungsreaktion in der Tunica muscularis konnte in der Unter- suchung von FRANZ (2013) nicht festgestellt werden. Die vorliegende Studie wurde als deren Folgestudie durchgeführt, mit dem Unterschied das der Applikationszeitpunkt der NSAIDs verändert wurde. Die Pferde erhielten 60 Minuten vor anlegen der Ischämie das jeweilige NSAID, somit- bezogen auf klinische Bedingungen-vor dem Auftreten klinischer Symptome.
Ziel der aktuellen Studie war es zunächst, wie auch bereits in der Studie von FRANZ (2013), die Entzündungsreaktion in der Tunica muscularis und Tunica serosa von ischämisch geschädigtem Jejunum unter dem Einfluss des selektiven NSAID Firocoxib und des nicht selektiven NSAID Flunixin-Meglumin zu charakterisieren und mit den Ergebnissen der Studie von FRANZ (2013) zu vergleichen. Die vorliegende Studie befasste sich außerdem zum einen mit der Frage, ob die von FRANZ (2013) beobachtete Entzündungsreaktion, die im Anschluss an die Reperfusion in direkt
benachbarten ungeschädigten Jejunumabschnitten festgestellt wurde, auch in Jejunum- abschnitten, die in größerem Abstand (proximales und distales Jejunum) und in anderen Darmabschnitten (Ileum, Caecum und Beckenflexur) entnommen wurden, zu beobachten ist.
Zum anderen sollte der Applikationszeitpunkt der NSAIDs modifiziert werden, um zu über- prüfen, ob dieser die Entzündungsreaktion in den geschädigten und ungeschädigten Darm- abschnitten beeinflusst. Die NSAIDs wurden in der vorliegenden Arbeit 60 Minuten vor Anlegen der Ischämie appliziert. Begründet wurde dies damit, dass FRANZ (2013) vermutete, dass der Effekt der NSAIDs auf die Entzündungsreaktion des ischämie- und reperfusionsgeschädigten Jejunums nicht richtig beurteilt werden konnte, da bereits vor Applikation der NSAIDs eine signifikante neutrophile Entzündungszellinfiltration in den ungeschädigten Jejunumabschnitten vorlag.
Im Rahmen der vorliegenden experimentellen Studie wurde eine neunzigminütige sogenannte partielle Ischämie, gefolgt von einer dreißigminütigen Reperfusion, im mittleren Jejunum- abschnitt des Pferdes induziert. Von 12 Warmblutpferden erhielten jeweils 6 zufällig aus- gewählte Pferde 60 Minuten vor Anlegen der warmen Ischämie entweder Flunixin-Meglumin oder Firocoxib intravenös appliziert. Die Kontroll-, Ischämie-, und Reperfusions-Proben wurden zu denselben Zeitpunkten wie in der Studie von FRANZ (2013) entnommen. Im Anschluss an die Reperfusion wurden Proben des proximalen und distalen Jejunums, des Ileums, des Caecums und der Beckenflexur entnommen. Die Beurteilung der Tunica muscularis und der Tunica serosa erfolgte histologisch mit Hilfe der Luna-Färbung zur Darstellung der eosinophilen Granulozyten, immunhistologisch mit Hilfe der Calprotectin-Immunhistochemie zur Darstellung der neutrophilen Granulozyten sowie ebenfalls immunhistochemisch zur Darstellung der Cyclooxygenase-1- und Cyclooxygenase-2-Expression.
2 Literaturübersicht
2.1 Histologischer Aufbau der Darmwand
Der histologische Aufbau der Darmwand gliedert sich von innen beginnend in die Tunica mucosa (Schleimhautschicht), die Tela submucosa (Unterschleimhaut) sowie die Tunica muscularis (Muskelschicht), die sich wiederum zusammensetzt aus der Zirkulärmuskulatur und der Longitudinalmuskulatur. Der Tunica muscularis schließt sich die Tunica serosa (Serosaschicht) an, welche sich aus der bindegewebigen Lamina propria serosae und dem oberflächlichen einschichtigen Plattenepithel, dem Mesothelium serosae, zusammensetzt (KÖNIG et al. 1999;
LIEBICH 2010) (Abb. 1). Der Dickdarm weist in Bezug auf den Aufbau der Tunica muscularis etwas andere Merkmale auf. Die Zirkulärmuskulatur bildet eine geschlossene Schicht und die Längsmuskellagen sind zu Bandstreifen (Taenien) differenziert (KÖNIG et al. 1999; LIEBICH 2010). Im Caecum liegen vier Bandstreifen (Taenien) vor, in der Beckenflexur ist es eine Taenie (KÖNIG et al. 1999; LIEBICH 2010).
Abb. 1: Histologischer Aufbau der Darmwand
2.2 Darmstrangulationen
Strangulierende Obstruktionen des equinen Jejunums bedingen einen simultanen Verschluss des Darmlumens und der mesenterialen Gefäße (MORTON u. BLIKSLAGER 2002). Nicht strangulierende Obstruktionen des equinen Jejunums wurden hingegen als eine Behinderung der Darmpassage ohne Beeinträchtigung der mesenterialen Gefäße definiert (WHITE et al. 1980;
MAIR 2003). Eine durch einen Volvulus, durch Hernien oder durch Lipoma pendulans bedingte Strangulation des Dünn- oder Dickdarms führte zu einem Verschluss oder einer Verlegung des Darmlumens mit partieller oder vollständiger Unterbrechung der zu- und abführenden mesenterialen Blutgefäße (WHITE et al. 1980; MAIR 2003). Strangulationen des equinen Jejunums waren trotz chirurgischer Intervention häufig Todesursachen beim Pferd (MACDONALD et al. 1989). Die betroffenen Pferde zeigten dabei eine akute, teils schwere Koliksymptomatik mit nur bedingter Reaktion auf Analgetika (MAIR 2003).
2.3 Postoperativer paralytischer Ileus (POI)
Der postoperative paralytische Ileus (POI) wurde beim Pferd unter anderem im Zusammenhang mit Darmstrangulationen und medialer Laparotomie beschrieben (HUNT et al. 1986).
Prädisponierende Faktoren für die Entstehung eines POI beim Pferd waren ein erhöhter Hämatokrit (ROUSSEL et al. 2001; FRENCH et al. 2002; COHEN et al. 2004), eine Anästhesiedauer von über 2,5 Stunden und eine Operationszeit von über 2 Stunden (ROUSSEL et al. 2001). Die Prävalenz eines POI nach chirurgischen Eingriffen am Jejunum beim Pferd lag zwischen 30 % (PROUDMAN et al. 2002), 10 % (FREEMAN et al. 2000), 14 % (HUNT et al. 1986) bzw. 16 % (MACDONALD et al. 1989). Pferde mit einer strangulierenden Obstruktion des Jejunums ent- wickelten postoperativ signifikant häufiger einen Ileus als Pferde mit einer Kolonobstruktion (ROUSSEL et al. 2001). Das Risiko eines POI war bei Strangulationen des equinen Jejunums durch ein gestieltes Lipoma pendulans im Vergleich zu anderen postoperativen Komplikationen wie Relaparotomie, iatrogene Hernien oder Thrombose der Vena jugularis dreifach erhöht (FRENCH et al. 2002).
Klinisch war der POI durch eine zunächst milde, mit fortschreitendem Verlauf heftiger werdende Koliksymptomatik gekennzeichnet. Rektal ließen sich bei den betroffenen Pferden mehrere flüssigkeitsgefüllte Dünndarmschlingen palpieren und transabdominal ultrasonographisch darstellen (MERRITT u. BLIKSLAGER 2008). Der POI trat meist in den ersten Tagen nach der Operation auf (FRENCH et al. 2002), im Durchschnitt nach 13 Stunden (0,5 +/- 120 Stunden), und dauerte 1 Tag (bis zu 7 Tage) lang an (BLIKSLAGER et al. 1994). Aufgrund des fehlenden Weitertransports der Flüssigkeit kam es zum Reflux vom Darm in den Magen, was eine sekundäre Magenüberladung bedingte. Ein Refluxvolumen von mehr als 20 Litern über einen Zeitraum von 24 Stunden bzw. von 8 Litern bei jeder Magensondierung sind laut ROUSSEL et al.
(2001) und COHEN et al. (2004) für das Vorliegen eines POI definiert.
2.3.1 Postoperativer Ileus (POI) – Pathogenese
Sowohl nicht strangulierende als auch strangulierende Obstruktionen konnten nach chirurgischer Korrektur in einen POI mit Inhibition der tonischen und phasischen Kontraktilität des Intestitiumss resultieren (LUCKEY et al. 2003; HOLCOMBE et al. 2009). In der Literatur wurden diesbezüglich unterschiedliche Zusammenhänge diskutiert. Die Entwicklung eines POI wurde beim Menschen in eine frühe, neuronal bedingte, und in eine späte, durch inflammatorische Zellinfiltrationen bedingte Phase unterteilt. Die frühe Phase schloss die ersten
3 postoperativen Stunden ein. Auf neuronaler Ebene wurde zum einen über eine Hemmung der autonomen und enterischen Nervensysteme diskutiert (TACHE et al. 1993; KALFF et al. 1999).
Zum anderen spielte der Sympathikus eine zentrale Rolle, da der Abbau adrenerger Rezeptoren die Unterbrechung der gastrointestinalen Motilität verhinderte (PLOURDE et al. 1993; ZITTEL et al. 1993). Eine vagale Beteiligung wurde ebenfalls nicht ausgeschlossen (ZITTEL et al. 1993;
BOECKXSTAENS et al. 1999). Die späte inflammatorische Phase begann 3 bis 4 Stunden nach der Operation (BOECKXSTAENS u. DE JONGE 2009), wobei dieser in Bezug auf die Inhibition der gastrointestinalen Motilität eine höhere klinische Relevanz zukam (BOECKXSTAENS u. DE JONGE 2009). Bei Ratten wurden lokale inflammatorische Infiltrationen in den Muskelschichten des Jejunums als Risikofaktor für die Entstehung eines POI diskutiert (DE WINTER et al. 1997; KALFF et al. 1998). Ein Zusammenhang zwischen der inflammatorischen Infiltration mit polymorphkernigen Zellen (PMN: polymorphkernige neutrophile Granulozyten) und der reduzierten Funktionalität der Zirkulärmuskulatur des Dünndarms konnte bei Ratten in den Studien von KALFF et al. (1999) und SCHWARZ et al. (2004) beobachtet werden. Die von PMNs und Monozyten generierte Superoxiddismutase (SOD) und generierten schädlichen Hydroxylradikale (ROS: Reaktive Sauerstoffspezies) spielten in der Hemmung der glatten Muskulatur ebenfalls eine signifikante Rolle (KALFF et al. 1999).
2.4 Intestinale Ischämie und Reperfusion
Der Terminus Ischämie beschreibt den partiellen „low flow“ oder die vollständige Reduktion des Blutflusses, bedingt durch eine partielle oder totale Unterbrechung der zu- und abführenden Gefäße (SNYDER 1989; MEURER u. WOLF 2006).
Bei der sogenannten warmen oder auch partiellen Low-flow-Ischämie wurden zunächst die Venen aufgrund ihrer dünnen Wanddicke und des niedrigeren Blutdrucks okkludiert, während die arterielle Blutversorgung weiter bestehen blieb. Die Darmwand infarzierte nachfolgend hämorrhagisch, was als hämorrhagische Strangulation bezeichnet wird (MOORE et al. 1986). Der vollständige Verschluss der arteriellen und der venösen Gefäße wurde von MOORE und Kollegen (1986) hingegen als kalte Ischämie bzw. ischämische Strangulation definiert. Die zelluläre Schädigung nach einer partiellen Ischämie des Gewebes ist laut PARK et al. (1990) stärker als nach einer vollständigen Ischämie des Gewebes. So konnten bei Ratten nach partieller einstündiger Ischämie des Darms signifikante Zunahmen der zellulären Schädigung innerhalb der Tunica mucosa während der Reperfusion beobachtet werden. Nach erfolgter vollständiger Ischämie hingegen potenzierte sich die zelluläre Schädigung innerhalb der Tunica mucosa während der Reperfusion nicht (PARK et al. 1990).
Die chirurgische Korrektur von stranguliertem, ischämischem Dünndarm und die damit ver- bundene Reoxygenierung, führen zur weiteren Schädigung des Gewebes (PARKS u. GRANGER 1986). Die biochemischen, hämodynamischen und pathohistologischen Konsequenzen dieser Reoxygenierung wurden bereits in diversen Studien untersucht und diskutiert. So bezeichneten Autoren einiger Publikationen die Reperfusionsschädigung als eine direkte Folge der vorangegangenen Ischämie (PRICHARD et al. 1991; MOORE et al. 1994), während die Verfasser
anderer Veröffentlichungen die Schädigungen als eine fortlaufende ischämische Beein- trächtigung des Gewebes interpretierten (LAWS u.FREEMAN 1995; MCANULTY et al. 1997).
Entscheidende Faktoren für die Regenerationsfähigkeit des Darmgewebes während der Reperfusion, sowohl in der Human- als auch in der Tiermedizin, schienen der Grad und die Dauer einer bestehenden Ischämiephase zu sein. So wurde in einem Ischämie-Reperfusionsmodell im rechten dorsalen Kolon bei Ratten kein signifikanter Unterschied bezüglich der zellulären Schädigung in der Tunica mucosa festgestellt, egal, ob die vollständige Ischämie 45 oder 90 Minuten dauerte. Nach partieller Ischämie über dieselben Zeiträume hingegen kam es signifikant zu einer Zunahme der Schädigung der Mukosa während der Reperfusion (PARK et al.
1990).
2.4.1 Makroskopische und histologische Charakterisierung
In der Studie von SNYDER et al. (1990) kam es beim Vorliegen einer partiellen Ischämie zu einer makroskopisch hochgradigen hämorrhagischen Infarzierung des betroffenen Darmabschnittes.
Es kam zur Ödematisierung sowie zur blauvioletten Verfärbung der Darmwand. Beim Vorliegen einer kompletten Ischämie färbte sich die Darmwand blaugrau (SNYDER et al. 1990).
Aufgrund einer vollständigen ischämischen Obstruktion hingegen kam es auf histologischer Ebene vor allem in der Tunica mucosa bereits nach wenigen Minuten zu massiven hypoxischen Schädigungen der Villi. Beginnend an der Villispitze und im weiteren Verlauf bis zur Villibasis fortschreitend kam es innerhalb von 4 bis 5 Stunden zur vollständigen Nekrose (WHITE et al.
1980). Des Weiteren konnten im equinen Kolon bereits nach einstündiger vollständiger Ischämie Hinweise auf pathologische Zellveränderungen in Form von Epithelzell- und Kernschwellungen, Ablösung der oberflächlichen Epithelschicht und subepithelialen Zusammenhangstrennungen der Tunica mucosa beobachtet werden (GRAHAM et al. 2011; GROSCHE et al. 2011). Nach 6 bis 7 Stunden hatten sich die degenerativen Prozesse bis zur Tunica muscularis ausgeweitet (MAIR 2003). TOMLINSON et al. (2004) fanden in diesem Zusammenhang heraus, dass eine vollständige Regeneration der Tunica mucosa im equinen Jejunum nach zweistündiger kompletter Ischämie und anschließender achtzehnstündiger Reperfusion erfolgte.
Nach intraluminaler Distension des equinen Jejunums mit Hilfe von steriler Ringer-Lösung mit einem Druck von 25 cm H2O mmHg für 120 Minuten und nachfolgender Dekompression für 60 Minuten wurde an der serosalen Basalmembran eine Migration degranulierter neutrophiler Granulozyten in die Tunica serosa und in die Longitudinalmuskulatur der Tunica muscularis beobachtet (DABAREINER et al. 2001). Im equinen Jejunum wurden nach neunzigminütiger Ischämie und dreißigminütiger Reperfusion signifikant höhere Zahlen neutrophiler Granulozyten in der Longitudinalmuskulatur der Tunica muscularis festgestellt (VENTE 2011; FRANZ 2013). In einem Ischämie-Reperfusionsmodell am equinen Kolon kam es nach einstündiger Ischämie und anschließender zweistündiger Reperfusion zu einem deutlichen Anstieg neutrophiler Granulozyten in der Tunica mucosa (GROSCHE et al. 2011). HOPSTER-IVERSEN et al. (2011) zeigten darüber hinaus, dass es im equinen Kolon und im Jejunum nach zehnminütiger mechanischer Manipulation zu einer erhöhten Infiltration neutrophiler Granulozyten in der
Tunica mucosa, Tela submucosa, der Zirkulärmuskulatur der Tunica muscularis und in der Tunica serosa kam.
2.4.2 Biochemische Kaskade
Im Verlauf der fortschreitenden Ischämie wird das Enzym Xanthindehydrogenase zu Xanthin- oxidase (XO) umgewandelt (PARKS et al. 1988). Das für die Stoffwechselvorgänge der Zelle benötigte Adenosintriphosphat (ATP) wandelt sich unter hypoxischen Bedingungen in Adenosinmonophosphat (AMP), Adenosin, Inosin und schließlich in Hypoxanthin um und akkumuliert im Gewebe (Abb. 2) (GRANGER 1988). Der Hypoxanthin-Gehalt in normal oxy- geniertem Darmgewebe liegt bei 20 µM und steigt im ischämischen Gewebe auf 200 µM an (SCHOENBERG et al. 1985).
Die Reperfusion und die damit verbundene Reoxygenierung des Gewebes aktiviert die Xanthinoxidase und bereits zehn Minuten nach Beginn der Reperfusion sinkt der während der Ischämie angestiegene AMP- und Hypoxanthingehalt wieder signifikant (GRANGER 1988). Die XO baut das Hypoxanthin zu den Hydroxylradikalen (ROS: reactive oxygen species) Superoxid (O2) und Wasserstoffperoxid (H2O2) ab (Abb. 2) (GRISHAM et al. 1986). Neutrophile Granulozyten werden unter anderem während der Reperfusion durch XO und ROS chemotaktisch angelockt und binden an die Liganden der Gefäßendothelzellen der mikrovaskulären Gefäße des mukosalen Gefäßsystems und induzierten so die weitere Extravasion neutrophiler Granulozyten ins Gewebe (LEWIS et al. 1988).
Nachdem die Reserven des körpereigenen Abwehrsystems, bestehend aus enzymatischen (Superoxiddismutase, Katalase und Glutathionperoxidase) und nicht enzymatischen Anti- oxidantien (α-Tocopherol, Ascorbinsäure und β-Carotin), erschöpft sind, entstehen durch die sogenannte Haber-Weiss-Reaktion ungehindert weitere ROS (FLAHERTY u. WEISFELDT 1988).
Extern zugeführte Antioxidantien und Radikalhemmer wie Allopurinol wurden aufgrund ihrer hemmenden Wirkung auf die Aktivität der XO untersucht und deren Applikation als mögliche prophylaktische Maßnahme zur Reduktion von Ischämie- und Reperfusionsschäden genannt.
Bei Verabreichung vor der Reperfusion besaßen sie eine protektive Wirkung auf die Tunica mucosa (GRANGER 1988). Die Zugabe monoklonaler Antikörper gegen neutrophile Granulozyten bewirkte ebenfalls eine Verbesserung der biochemischen und morphologischen Parameter (NILSSON et al. 1989). Ähnliche Ergebnisse wurden mit Dimethylsulfoxid (DMSO:
Dimethylsulfoxid) einem Hydroxyl-Radikalfänger, und Superoxiddismutase (SOD:
Superoxiddismutase) beobachtet. Durch die SOD- und DMSO-Applikation konnte laut GRANGER (1988) der „oxidative Stress“ durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) auf die Zelle reduziert werden.
Abb. 2: Mechanismus der Xanthinoxidase während Ischämie und Reperfusion modifiziert nach GRANGER et al. (1988)
2.5 Zelluläre Veränderung während der intestinalen Entzündung
Die dominierenden Entzündungszellen während des Ischämie-Reperfusions-Geschehens sind neutrophile Granulozyten, Lymphozyten und Makrophagen (MOORE et al. 1994; KALFF et al.
1998, 1999). Neutrophile Granulozyten machen beim Pferd 50 % der Blutleukozyten aus (TIZARD 2004). Die eosinophilen Granulozyten gehören zu den stationären Zellen des Gastrointestinaltrakts (MCEWEN 1992), wobei ihre Funktion während der Ischämie und Reperfusion bisher nicht vollständig geklärt ist.
2.5.1 Neutrophile Granulozyten
2.5.1.1 Rekrutierung neutrophiler Granulozyten
Die zu den polymorphkernigen Zellen zuzuordnenden neutrophilen Granulozyten spielen ins- besondere in der frühen Phase der ischämischen Entzündungsreaktion eine zentrale Rolle (GRISHAM et al. 1986; LITTLE et al. 2005).
Neutrophile Granulozyten sind Entzündungszellen der akuten Entzündungsreaktion. Sie werden im Knochenmark gebildet und in die Blutbahn abgegeben, von wo aus sie innerhalb von 12 Stunden ins Gewebe wandern (TIZARD 2004). Die Aktivierung dieses Vorgangs erfolgt mit Hilfe eines inflammatorischen Stimulus. Kapilläre Endothelzellen werden, z. B. durch von Bakterien freigesetzte Lipopolysaccaride (LPS: Lipopolysaccharide), von Histamin oder Thrombin stimuliert, die von geschädigtem Gewebe sezerniert werden, und sezernieren ihrerseits das Glykoprotein P-Selektin. Dieses bindet über Carboxylketten an das von neutrophilen Granulozyten exprimierte L-Selektin. Diese Bindung induziert die Verlangsamung der neutro- philen Granulozyten im Blutstrom und ein „Rolling“ entlang der Gefäßwand (TIZARD 2004). Die so verlangsamte Zelle wird durch den Lipid Platelet Activating Factor (PAF) aktiviert und
O2 ATP
AMP
Adenosin
Iosin
Hypoxanthin
Xanthin- dehydrogenase
Xanthinoxidase
Reperfusion
Urat + O2- + H2O2
Fe+3 LH OH LOOH Granulozyten
Proteasen Oxidantien
Mikrovaskuläre Schädigung
Ischämie
exprimiert ein Integrin (CD11a/CD18), das sich an das Glykoprotein Intercellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1) der inflammatorischen Endothelzellen bindet. Dieser Mechanismus wird als „adherence“ bezeichnet (TIZARD 2004).
Die Einwanderung ins entzündete Gewebe, „emigration“, bildet die letzte Phase der Aktivierung.
Hierfür wandert der fixierte neutrophile Granulozyt zwischen den Endothelzellen und der Basalmembran hindurch ins Gewebe (TIZARD 2004).
2.5.1.2 Nachweisverfahren
Zur Erhebung der Granulozytenakkumulation im Gewebe wurden in der Literatur verschiedene Nachweismethoden, die sich in Spezifität, Selektivität und Aufwand unterscheiden, beschrieben.
Die klassische histomorphometrische Auszählung aufgrund der morphologisch gut differenzierbaren Eigenschaften neutrophiler Granulozyten in der HE-Färbung (HE: Hämatoxilin- Eosin) barg laut MOORE et al. (1994) einige Nachteile, wie einen hohen Zeitaufwand und eine stark subjektive Beurteilung der Schnitte, insbesondere bei hohen Zellzahlen nach Ischämie und Reperfusion.
Der immunhistochemische Nachweis von Calprotectin im Zytoplasma neutrophiler Granulozyten ist eine weitere Methode zur Detektion neutrophiler Granulozyten. Calprotectin macht ca. 30–50 % des Gesamtproteins im Zytoplasma neutrophiler Granulozyten aus (SORENSEN u. BORREGAARD 1999; YUI et al. 2003). Zudem wird Calprotectin in akuten inflammatorischen Prozessen auch in Makrophagen und Monozyten exprimiert (YUI et al. 2003).
In Lymphozyten konnte hingegen kein Calprotectin nachgewiesen werden (YUI et al. 2003). Mit Studien am Jejunum und Kolon von Pferden konnte eine signifikante Korrelation zwischen Calprotectin positiven Zellen und neutrophilen Granulozyten in der HE-Färbung nachgewiesen werden (LITTLE et al. 2005; GROSCHE et al. 2008). Die bessere Differenzierbarkeit neutrophiler Granulozyten aufgrund der Darstellung des Calprotectins in ihrem Zytoplasma ermöglicht eine objektive Beurteilung der neutrophilen Zellzahlen insbesondere in ischämie- und reperfusionsgeschädigten Proben mit hohen Zellzahlen.
2.5.1.3 Infiltration neutrophiler Granulozyten im geschädigten Dünndarm
Neutrophile Granulozyten stellen bei Ischämie- und Reperfusionsbedingter Schädigung des Dünndarms eine wichtige Zellfraktion dar. Die möglichen Zusammenhänge zwischen der Akkumulation neutrophiler Granulozyten im Gewebe und der Regeneration des geschädigten Dünndarms wurden in diversen Studien untersucht.
Die Dauer der Ischämie scheint für die Intensität der Infiltration mit neutrophilen Granulozyten, sowohl in der Tunica mucosa (TOMLINSON et al. 2004; LITTLE et al. 2005) als auch in der Tunica muscularis und der Tunica serosa (LITTLE et al. 2005), eine entscheidende Rolle zu spielen. In der Tunica muscularis des equinen Jejunums war nach einstündiger Ischämie und 18 Stunden andauernder Reperfusion eine deutliche Zunahme der neutrophilen Granulozyten Perimysium sowohl in der Zirkulär- als auch in der Longitudinalmuskulatur zu beobachten (LITTLE et al. 2005).
So kam es zu einem signifikanten Anstieg der Infiltration an neutrophilen Granulozyten in der
Longitudinalmuskulatur sowohl nach einstündiger als auch nach zweistündiger Ischämiephase im Vergleich zur ungeschädigten Kontrollprobe (LITTLE et al. 2005). In einer weiteren Studie wurde nach neunzigminütiger Ischämie zu den erfassten Reperfusionszeitpunkten (zwischen 5 und 120 Minuten) eine stärkere Infiltration neutrophiler Granulozyten in der Longitudinalmuskulatur im Vergleich zur Zirkulärmuskulatur beobachtet (VENTE 2011). FRANZ (2013) kam zu einem ähnlichen Ergebnis: Nach neunzigminütiger Ischämie- und drei- ßigminütiger Reperfusionsphase am equinen Jejunum wurde auch hier eine deutlichere Zunahme an neutrophilen Granulozyten in der Longitudinalmuskulatur im Vergleich zur Zirkulärmuskulatur der Tunica muscularis beobachtet (FRANZ 2013).
Die Hypothese einer generalisierten neutrophilen Entzündungsreaktion im equinen Jejunum ergab sich aus den weiteren Ergebnissen der Studie von FRANZ (2013). Hier wurde in ungeschädigten Jejunumabschnitten, die in einem Meter Abstand zum ischämie- und reperfusionsgeschädigten Jejunum entnommen wurden, signifikant erhöhte neutrophile Zell- zahlen in der Longitudinalmuskulatur im Vergleich zur Kontrollprobe beobachtet (FRANZ 2013).
2.5.2 Eosinophile Granulozyten
Eosinophile Granulozyten gehören zu den polymorphnukleären Zellen der Leukozytenfraktion und sind etwas größer als neutrophile Granulozyten. Unter physiologischen Bedingungen sind eosinophile Granulozyten überwiegend gewebsständige Zellen (STRAUMANN u. SIMON 2004).
Eosinophile Granulozyten wurden bei Ratten in der Haut, im Gastrointestinaltrakt, in der Lunge und im Uterus als gewebsständige Zellen nachgewiesen (MCEWEN 1992). Im Blut zirkulierende eosinophile Granulozyten machen etwa 1–10 % der Leukozyten bei Haustieren aus (MCEWEN et al. 1992; DUNCAN et al. 1994). Bei Pferden variiert diese Zellzahl über den Tag verteilt.
Morgens und abends waren sie am zahlreichsten im Blut nachweisbar (KOTTMANN-JÜTTER 1975; MCEWEN et al. 1992). Eosinophile Granulozyten sind laut MOQBEL et al. (1994) sogenannte Endzellen im Blut und Gewebe und besitzen dementsprechend nur eine limitierte Kapazität zur Transkription und Translation neuer Proteine.
Im Gastrointestinaltrakt gesunder Pferde liegen eosinophile Granulozyten inhomogen verteilt in der Tunica mucosa und in der Tela submucosa vor. Die niedrigste Zelldichte wurde im Magen beobachtet, während im Caecum die höchste Zelldichte festgestellt wurde (RÖTTING et al.
2008a). Im Colon ascendens und Colon transversum wurden des Weiteren mehr eosinophile Granulozyten in der Tunica mucosa und Tela submucosa nachgewiesen als im Duodenum und Jejunum (RÖTTING et al. 2008a).
Auch die Zellverteilung innerhalb der Darmwand ist inhomogen. Die in der Tunica mucosa und Tela submucosa befindlichen eosinophilen Granulozyten orientieren sich überwiegend entlang der Lamina muscularis mucosae des Kolons (HOPSTER-IVERSEN et al. 2011) und des Jejunums (VENTE 2011). RÖTTING et al. (2008a) zeigten, dass sich die eosinophilen Granulozyten innerhalb der Tunica mucosa zu 80 % in der Lamina propia mucosa befanden und keine in der Angrenzung zum Lumen beobachtet wurden. Innerhalb der Tunica muscularis und der Tunica serosa wurden
sowohl im Kolon (HOPSTER-IVERSEN et al. 2011) als auch im Jejunum (VENTE 2011; FRANZ 2013) nur vereinzelte eosinophile Granulozyten beobachtet. Unter pathologischen Bedingungen erfolgt die Rekrutierung eosinophiler Granulozyten primär durch die Freisetzung des Zytokins Interleukin-5 (IL-5) (TIZARD 2004). WARREN und MOORE (1988) fanden heraus, dass das von T- Helfer-Zellen freigesetzte IL-5 die Differenzierung und die Proliferation der Vorläuferzellen im Knochenmark zu eosinophilen Granulozyten stimulierte.
2.5.2.1 Nachweis eosinophiler Granulozyten
Zur Darstellung eosinophiler Granulozyten in histologischen Präparaten eignet sich die Färbung nach LUNA (1992). Die eosinophilen Granula der Zellen werden bei diesem Verfahren leuchtend rot gefärbt, während die Erythrozyten orange und die restlichen Zellen blau erscheinen. Somit ist eine objektive Darstellung und Beurteilung der Verteilung und der Akkumulation eosinophiler Granulozyten möglich. Das Färbeprotokoll hat sich bereits in vorangegangenen Studien bewährt (RÖTTING et al. 2008a, b; HOPSTER-IVERSEN et al. 2011; VENTE 2011; FRANZ 2013).
2.5.2.2 Eosinophile Granulozyten im geschädigten Dünndarm
Der Einfluss von mechanischer Irritation, chemischen Substanzen und Ischämie-Reperfusion auf die Akkumulation eosinophiler Granulozyten in den Darmschichten des Jejunums von Pferden wurde in verschiedenen Studien untersucht. In der Tunica mucosa des equinen Kolons kam es infolge einer Laparotomie und mechanischer Manipulation des Jejunums zu erhöhten Zahlen eosinophiler Granulozyten (HOPSTER-IVERSEN et al. 2011). Die Akkumulation dieses Zelltyps in der Tunica muscularis und in der Tunica serosa des equinen Jejunums wurde in den Studien von VENTE (2011) und FRANZ (2013) untersucht. In der von VENTE (2011) konnten in der Zirkulärmuskulatur, in der intermuskulären Schicht und in der Longitudinalmuskulatur keine Unterschiede bezüglich der Akkumulation dieser Zellen über den gesamten Messzeitraum (90 Minuten Ischämie und 5–120 Minuten Reperfusion) im Vergleich zur Kontrollprobe festgestellt werden. In der Tunica serosa wurde hingegen in der frühen Reperfusionsphase nach 5, 10, 15, 20, 30 und 90 Minuten eine signifikant erhöhte Akkumulation von eosinophilen Granulozyten im Vergleich zur Kontrollprobe beobachtet. Im Vergleich zur Ischämieprobe war die Akkumulation nach 15, 20 und 90 Minuten der Reperfusion signifikant erhöht. Dabei waren die Zellen sowohl intravasal als auch gewebsständig fokal verteilt (VENTE 2011). In der Studie von FRANZ et al. (2013) konnten im equinen Jejunum zu keinem Probezeitpunkt (Kontrolle, 90 Minuten Ischämie, 30 Minuten Reperfusion) signifikant erhöhte Zellzahlen pro Quadratmillimeter in der Zirkulär- und Longitudinalmuskulatur der Tunica muscularis sowie der Tunica serosa im Vergleich zur Kontrollprobe festgestellt werden.
2.6 Cyclooxygenasen
Prostaglandin-H2-Synthasen oder auch Cyclooxygenasen (COX) sind bifunktionale, membran- gebundene Synthasen (GARAVITO u. MULICHAK 2003). Sie katalysieren die oxidative Zyklierung ungesättigter Fettsäuren aus Arachidonsäure in Prostaglandin G2 und die anschließende Reduktion zu Prostaglandin H2 (VANE et al. 1998).
Die erste Cyclooxygenase wurde 1976 entdeckt (HEMLER u. LANDS 1976) und aufgrund dessen als COX-1 bezeichnet. Die zweite Cyclooxygenase wurde 1991 als weitere Isoform identifiziert und COX-2 genannt (KUJUBU et al. 1991; XIE et al. 1991). Für beide Cyclooxygenasen wurden weitere Unterformen („splice variants“) identifiziert (QIN et al. 2005). Die dritte Isoform COX-3 wurde der COX-1 (CHANDRASEKHARAN et al. 2002) und der COX-2 (WILLOUGHBY et al. 2000) als Unterform zugeordnet. Die Cycolooxygenasen-1 und -2 sind in der Zelle im endo- plasmatischen Retikulum und in der Kernhülle lokalisiert (OTTO u. SMITH 1994; MORITA et al.
1995). Die primäre Struktur der Cyclooxygenasen ist zusammengesetzt aus 600 bis 602 Amino- säuren und wird durch die Abtrennung von Signalpeptiden in die funktionelle Form umgewandelt (SMITH et al. 2000). In der Studie von SMITH et al. (2000) bestand eine hohe Übereinstimmung zwischen den Aminosäuresequenzen der beiden Cyclooxygenasen, wodurch speziesübergreifende Beschreibungen und Vergleiche der Synthasen möglich wurden. COX-1 und COX-2 bestehen beide aus identischen Untereinheiten, unterscheiden sich aber aufgrund zweier Mutationen, die zu strukturellen Abweichungen führen (WONG et al. 1997; VANE et al.
1998). Die COX-1 besitzt an den Aminosäurepositionen 434 und 523 einen Isoleucinrest und an der Aminosäureposition 513 einen Histidinrest. Die COX-2 hingegen weist an diesen Amino- säurepositionen einen Valin- bzw. Argininrest auf. Aufgrund dessen ist die aktive Seite der COX- 2 größer und für Inhibitoren und Substrate somit gut zugänglich (WONG et al. 1997).
Die unterschiedliche Funktionalität der beiden Cyclooxygenasen innerhalb der Zelle war laut SMITH et al. (2000) darauf zurückzuführen, dass die COX-2 negativ allosterisch von COX-1 inhibiert wurde. Somit war die Umwandlung der innerhalb der Zelle frei verfügbaren Arachidonsäure für COX-2 verringert. Gleichzeitig war diese Umwandlung durch COX-2 aber viermal effektiver als die durch COX-1.
Des Weiteren war in der Studie von SMITH et al. (2000) eine zeitabhängige Aktivität beider Synthasen nach Stimulation mit LPS, Zytokinen und Growth Factor beschrieben, wonach COX-1 in der frühen Phase, 10 bis 30 Minuten nach Stimulation, hochreguliert wurde. In der Spätphase, 2 bis 12 Stunden nach der Stimulierung, verringerte sich die Prostanoid-Produktion, wahrscheinlich aufgrund der erschöpften Arachidonsäurevorräte der Zelle, und COX-2 dominierte. Die Autoren dieser Publikation spekulierten, dass die individuelle Aktivierung der Cyclooxygenasen zwar ein zeitabhängiger Prozess war, aber auch von der Arachidonsäurekonzentration abhängig sein konnte (SMITH et al. 2000).
2.6.1 Cyclooxygenase-1
Die Cyclooxygenase-1 (COX-1) ist ein konstitutiv exprimiertes Enzym, das unter physiologischen Bedingungen in den meisten Geweben in hohen Konzentrationen exprimiert wird (LÖSCHER 2010). Sie katalysiert die physiologische Prostaglandinsynthese aus Arachidonsäure (TOMLINSON et al. 2004). COX-1 ist unter physiologischen Bedingungen die dominierende Isoform im Gastrointestinaltrakt von Nagern, Menschen und anderen Primaten (KARGMAN et al. 1996; SEIBERT et al. 1997; KOKI et al. 2002). Eine Untersuchung des Gastrointestinaltrakts gesunder Ratten zeigte, dass COX-1 vor allem in den Zellen der Tunica mucosa, der Lamina
muscularis mucosae und im Endothel von Gefäßen der Tela submucosa des Dünndarms und im Caecum exprimiert wurde (HAWORTH et al. 2005). Die geringste Expression wurde im Dickdarm festgestellt (HAWORTH et al. 2005). Beim Menschen wurde COX-1 vor allem in der Magenmukosa, in der Lamina muscularis mucosae sowie im Endothel und in den glatten Muskelzellen der Arterien und Venen beobachtet (ZIMMERMANN et al. 1998). Bei Mäusen konnte COX-1 in den glatten Muskelzellen der Tunica muscularis des Kolons nachgewiesen werden (PORCHER et al. 2004). Bei Ratten wiederum wurden COX-1 exprimierende Zellen nur in der Tela submucosa des Kolons und nicht in den Muskel- und Endothelzellen beobachtet (REUTER et al. 1996).
Die unterschiedlichen Ergebnisse der Studien zeigen, dass die Lokaliationen der COX-1- Expression innerhalb der Darmwand von der Spezies abhängt. Beim Pferd wurde konstitutiv exprimierte COX-1 sowohl in den Zellen der Tela submucosa und der Tunica mucosa (MATYJASZEK et al. 2009; MORTON et al. 2009; GROSCHE et al. 2011) als auch in den Zellen der Tunica muscularis des Jejunums (FRANZ 2013) beobachtet.
2.6.1.1 Cyclooxygenase-1-Aktivierung
COX-1 wird unter physiologischen Bedingungen exprimiert. Über den Mechanismus und die Voraussetzungen der Aktivierung ist bisher wenig bekannt (CRONSTEIN 2002; LITTLE et al.
2007a). In mehreren Studien konnte ein Anstieg der COX-1-Expression durch einen patho- logischen Stimulus induziert werden. So führten z. B. Stresssituationen zu einer gesteigerten COX-1-Expression im Gewebe (HOFFMANN et al. 2006). Beim Menschen konnte infolge einer akuten Organabstoßung einer transplantierten Niere eine signifikante Erhöhung der COX-1- Expression in Blutgefäßen und in infiltrierten Zellen beobachtet werden. Im Vergleich dazu lag bei komplikationsloser Toleranz des Organs kein signifikant erhöhter COX-1-Gehalt vor (HOFFMANN et al. 2006). In einer weiteren Studie beim Menschen zu Magenulzerationen konnte ein Anstieg der COX-1-Expression im Zusammenhang mit einer zunehmenden Mukosa- schädigung beobachtet werden (BHANDARI et al. 2005). Bei der Ratte hingegen wurde kein Anstieg der COX-1-Expression in der einem Magenulkus benachbarten Magenmukosa beobachtet (SCHMASSMANN et al. 1998). In einer anderen Untersuchung an Ratten wurde nach induzierter Kolitis keine signifikante Hochregulierung der COX-1-Expression im Vergleich zur Kontrollprobe beobachtet (REUTER et al. 1996). Auch in einem Ischämie- und Reperfusions- Modell im Gehirn des Schweins (DOMOKI et al. 1999) sowie in den Nieren von Ratten (MATSUYAMA et al. 2004) konnte keine gesteigerten COX-1-Expression in den Endothelzellen venöser und arterieller Gefäße nachgewiesen werden.
Ischämie-Reperfusions-Studien am equinen Jejunum bzw. Kolon zeigten, dass innerhalb einer Spezies Unterschiede in der COX-1-Expression vorlagen. So konnte in ausschließlichen Unter- suchungen der Tunica mucosa und der Tela submucosa ein Anstieg der COX-1-Expression in ischämisch geschädigtem Jejunum (LITTLE et al. 2007b; COOK et al. 2009) und Kolon (MATYJASZEK et al. 2009) beobachtet werden. In drei weiteren Studien hingegen lag keine
Erhöhung der COX-1-Expression in der Tunica mucosa nach Ischämie im Vergleich zur Kontroll- probe vor (MORTON et al. 2009; GROSCHE et al. 2011; MARSHALL et al. 2011).
COX-1 exprimierende Muskelzellen konnten in dem Ischämie-Reperfusionsmodell von FRANZ (2013) am equinen Jejunum bereits in der Kontrollprobe vor Anlegen der Ischämie nachgewiesen werden. Hierbei handelte es sich um eine deskriptive immunhistochemische Untersuchung der COX-1-Expression innerhalb der Schichten der Tunica muscularis und in der Tunica serosa (FRANZ 2013). Insbesondere in der Zirkulärmuskulatur der Tunica muscularis exprimierten Muskelzellen COX-1 homogen (FRANZ 2013). In der Longitudinalmuskulatur wurden dagegen nur vereinzelte COX-1 exprimierende Muskelzellen beobachtet, die sich vor allem im Endomysium befanden. Des Weiteren fiel auf, dass im Vergleich zur ungeschädigten Kontrollprobe des Jejunums nach neunzigminütiger Ischämie- und dreißigminütiger Reperfusion kein Anstieg der COX-1 Expression in den Muskelzellen zu beobachten war (FRANZ 2013).
2.6.2 Cyclooxygenase-2
Die Cyclooxygenase-2 (COX-2) ist die zweite Isoform der Cyclooxygenasen, die ebenfalls die Umwandlung von Arachidonsäure zu Prostanoiden katalysiert. Anders als die konstitutiv exprimierte COX-1 wird die Expression der COX-2 durch inflammatorische Stimuli wie Interleukin-1 (IL-1), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) oder LPS stimuliert (SMITH et al. 2000).
Demzufolge wird eine Hochregulierung der COX-2 in der Literatur überwiegend in Zusammen- hang mit entzündlichen Vorgängen im Organismus beschrieben.
Eine konstitutive Expression von COX-2 wurde bisher nicht einheitlich dargelegt. Im Gegensatz zu COX-1 wurde COX-2 unter physiologischen Bedingungen in Studien in nur sehr geringen Mengen im Dickdarm von Nagern, Menschen und anderen Primaten konstitutiv exprimiert (KARGMAN et al. 1996; SEIBERT et al. 1997; KOKI et al. 2002). In Untersuchungen an Schweinen und Ratten wurde in gesundem Kolon keine COX-2 nachgewiesen (REUTER et al. 1996; CHO u.
CHAE 2004). Eine andere Studie an Ratten wies hingegen COX-2 im gesamten Gastrointestinaltrakt in unterschiedlich starker Expression nach (HAWORTH et al. 2005). COX-2 wird am stärksten in der Tunica mucosa der Ileocaecalklappe exprimiert, gefolgt vom Jejunum und Dickdarm, postulierten HAWORTH et al. (2005). Die geringste Expression wurde in der Tunica mucosa von Duodenum, Pylorus und Magenfundus beobachtet (HAWORTH et al. 2005).
Beim Menschen und Kaninchen wurde in der ungeschädigten Magenmukosa konstitutiv exprimierte COX-2-mRNA nachgewiesen (ZIMMERMANN et al. 1998). Als Grund hierfür sahen die Autoren das die von COX-2 katalysierte Synthese von Prostaglandinen zum Schutz der Magenmukosa notwendig ist (ZIMMERMANN et al. 1998). Des Weiteren wurde in der Tunica muscularis des proximalen Kolons bei Mäusen ebenfalls konstitutiv exprimierte COX-2 beobachtet (PORCHER et al. 2004). Diese Beobachtungen lassen vermuten das COX-2 auch unter physiologischen Bedingungen exprimiert wird.
Wie auch für COX-1 beobachtet scheinen Unterschiede auch hier bezüglich der Expression von COX-2 zwischen den Tierarten zu bestehen. Mit Hilfe von Studien beim Pferd konnten in den
Epithelzellen, den Krypten sowie der Lamina propia mucosae der Tunica mucosa und in der Tela submucosa des gesunden Kolons eine physiologische Expression von COX-2 festgestellt werden (MATYJASZEK et al. 2009; MORTON et al. 2009; GROSCHE et al. 2011). Gleiches wurde in der Tunica mucosa und in der Tela submucosa des equinen Jejunums beobachtet (TOMLINSON et al. 2004; COOK et al. 2009; MARSHALL et al. 2011). Innerhalb der Tunica muscularis des ungeschädigten equinen Jejunums hat bisher nur FRANZ (2013) die konstitutive COX-2- Expression untersucht. Hier konnte keine konstitutive Expression des Enzyms festgestellt werden (FRANZ 2013).
2.6.2.1 Induzierbarkeit der Cyclooxygenase-2
Die COX-2 ist ein induzierbares Enzym (SCHMASSMANN et al. 1998; KAINULAINEN et al. 2002;
MATSUYAMA et al. 2004). Bei der Induktion des Enzyms handelt es sich um einen zeitabhängigen Prozess (MATSUYAMA et al. 2004). So konnte in den Endothelzellen der Niere bei Ratten ein kontinuierlicher Anstieg der COX-2-Expression nach neunzigminütiger Ischämie und bis zu fünf Stunden nach Einleitung der Reperfusion beobachtet werden. Danach wurde mit zunehmendem zeitlichem Abstand zum inflammatorischen Stimulus eine Abnahme der COX-2-Konzentration beobachtet (MATSUYAMA et al. 2004). Ebenfalls bei der Ratte konnte bei experimentell induzierten Magenulzerationen eine deutliche Hochregulierung der COX-2-Expression in Monozyten, Makrophagen und Fibroblasten im Vergleich zu ungeschädigten Magenwandproben beobachtet werden (SCHMASSMANN et al. 1998).
In der Dünndarmschleimhaut wurde in der Lamina propria mucosae von an Zöliakie erkrankten Menschen im abgelösten und geschädigten Epithel eine deutliche COX-2-Expression beobachtet (KAINULAINEN et al. 2002). Ebenfalls in der Lamina propria und in der Tunica muscularis wurde sowohl 24 Stunden als auch eine Woche nach induzierter Kolitis bei Ratten ein drei- bis sechsfacher Anstieg der COX-2-Konzentration festgestellt (REUTER et al. 1996). Beim Schwein kam es im Zusammenhang mit ulzerativer Kolitis ebenfalls zum deutlichen Anstieg der COX-2 Expression (CHO u. CHAE 2004).
Beim Pferd wurde in der Tunica mucosa und in der Tela submucosa ein Anstieg der COX-2- Expression nach ischämischer Schädigung im Jejunum beobachtet (COOK et al. 2009; MARSHALL et al. 2011). In der Tunica mucosa des equinen Kolons kam es nach ischämischer Schädigung ebenfalls zu einem deutlichen Anstieg der COX-2-Expression (MATYJASZEK et al. 2009; MORTON et al. 2009; GROSCHE et al. 2011). Eine deskriptive Untersuchung der Tunica muscularis zur Expression von COX-2 in einem neunzigminütigen Ischämie- und dreißigminütigen Reper- fusionsmodell am mittleren Abschnitt des equinen Jejunums ergab, dass COX-2 vor allem in der Longitudinalmuskulatur exprimiert wurde (FRANZ 2013). Dieser Vorgang wurde sowohl während der Ischämie als auch nach der Reperfusion nachgewiesen. Auffällig war, dass es zu keiner Zunahme der COX-2-Expression nach der Reperfusion im Vergleich zu den Ischämie- Proben kam (FRANZ 2013). Diese Beobachtung entspricht der Untersuchung von MATSUYAMA et al. (2004) bei Ratten. Mit zunehmendem zeitlichem Abstand zur inflammatorischen COX-2-
Induktion verringert sich die Intensität der COX-2-Expression im Gewebe (MATSUYAMA et al.
2004).
2.6.2.2 Funktion der Cyclooxygenase-2
Die COX-2 wird im Gegensatz zu COX-1 als induzierbares Enzym im entzündeten Gewebe bezeichnet (SCHMASSMANN et al. 1998; KAINULAINEN et al. 2002; MATSUYAMA et al. 2004). In mehreren Untersuchungen wurde jedoch klar, dass COX-2 sowohl im gesunden als auch im erkrankten Gastrointestinaltrakt eine entscheidende Rolle spielt. Im gesunden Magendarmtrakt von Ratten wurde eine Entwicklung von hämorrhagischen Erosionen im Magen (WALLACE u.
MILLER 2000; GRETZER et al. 2001) und Dünndarm (TANAKA et al. 2002a, b) durch gleichzeitige Hemmung der COX-1- und COX-2-Expression beobachtet. Die alleinige Hemmung von COX-1 bzw. COX-2 führte hingegen nicht zu hämorrhagischen Erosionen. In einer anderen Studie an Ratten führte die selektive Hemmung der COX-2 sogar zur deutlichen Heilungsverzögerung von Magenläsionen (SCHMASSMANN et al. 1998). Der Einsatz selektiver COX-2-Inhibitoren führte bei Ratten mit induzierter Kolitis zu einer deutlichen Verschlechterung der Kolitis und zum Durchbruch des Darms nach einer Woche (REUTER et al. 1996). Die Ergebnisse der Studien lassen vermuten, dass die von COX-2 synthetisierten Prostaglandine eine wichtige Rolle bei der Regeneration von geschädigtem Gewebe einnehmen.
Die Bedeutung der COX-2 wird bei der selektiven Inhibition der COX-1 deutlich. Gleichzeitig führt die Hemmung der COX-1 durch einen selektiven COX-1-Hemmer bzw. ein nicht selektives NSAID zu einem Anstieg der COX-2-mRNA-Expression in der Tunica mucosa des Magens und des Dünndarms bei Ratten (TANAKA et al. 2001, 2002b). Möglicherweise dient die Hochregulierung der COX-2 in diesem Fall dem Ausgleich des Prostaglandindefizits aufgrund der COX-1-Inhibition (TANAKA et al. 2001). Beim Pferd wurde der Effekt selektiver COX-2-Hemmer und nicht selektiver COX-1- und COX-2-Hemmer auf die Entzündungsreaktion von ischämisch geschädigtem Jejunum untersucht (FRANZ 2013). In Bezug auf die Infiltration der Tunica muscularis mit neutrophilen Granulozyten wurden keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf die selektive oder nicht selektive Hemmung der Cyclooxygenase beobachtet (FRANZ 2013).
2.7 Entzündungsmediatoren
2.7.1 Prostaglandine
Cyclooxygenasen katalysieren die Synthese von Prostaglandinen aus Arachidonsäure.
Prostaglandine sind kurzkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäuren und gehören neben Leukotrienen und Thromboxan zu den Eikosanoiden mit kurzer Halbwertszeit von einigen Sekunden bis Minuten. Sie haben eine autokrine bzw. parakrine Wirkungsweise (MARTIN u.
WALLACE 2006). Ihre Serumkonzentration variiert zwischen den Spezies. Daher lagen in einer Studie von BRIDEAU et al. (2001) für Katze, Hund und Pferd unterschiedliche Konzentrationen an Thromboxan B2 (TXB2) und Prostaglandin E2 (PGE2) vor. Prostaglandin H2 (PGH2) ist die Grund- lage zur enzymatischen Umwandlung in die primären Prostanoide Prostaglandin E2 (PGE2),
Prostaglandin F2α (PGF2α), Prostaglandin D2 (PGD2), Prostaglandin I2 (PGI2) und Thromboxan A2
(TXA2),fanden VANE et al. (1998) heraus.
2.7.1.1 Prostaglandine im Gastrointestinaltrakt
Zu den Funktionen der PGE2 und PGI2 zählen die Reduktion der Magensäureproduktion, die vermehrte Produktion des protektiven Mukus, die Vasodilatation der mukosalen Blutgefäße und die vermehrte Sekretion von Bicarbonat zur pH-Stabilisierung beim Menschen (MARTIN u.
WALLACE 2006). Des Weiteren hemmen sie die Rekrutierung von Leukozyten in die Tunica mucosa und die Expression anderer Entzündungsmediatoren wie IL-1 und TNF-α durch Makrophagen und Interleukin-8 (IL-8) durch neutrophile Granulozyten bei Ratten (ASAKO et al.
1992a, b).
2.7.1.2 Effekt der Prostaglandine auf die Schleimhautbarriere von ischämisch geschädigtem Dünndarm
Die Schleimhautbarriere bietet in Ihrer Gesamtheit einen spezifischen und unspezifischen Schutz gegen die Reabsorbtion von antigenem Material (KÖNIG et al. 1999; LIEBICH 2010). Die Prostaglandine PGE2 und PGI2 nehmen im Hinblick auf die Regeneration von ischämisch geschädigtem Ileum beim Schwein eine synergistische Funktion zur Wiederherstellung der Schleimhautbarriere ein (BLIKSLAGER et al. 1997). Wurden die Prostaglandine einzeln verabreicht, konnte nur ein geringer Effekt auf die Regeneration der Schleimhautbarriere beobachtet werden (BLIKSLAGER et al. 1997).
Die intravenöse (i. v.) Gabe des nicht selektiven NSAID Flunixin-Meglumin verzögerte in einer Studie die Regeneration des equinen Jejunums nach ischämischer Schädigung. Vermutlich lag das an der verringerten Prostaglandinfreisetzung, bedingt durch die COX-1-Inhibition (CAMPBELL et al. 2000).
2.8 Nicht steroidale Antiphlogistika
Nicht steroidale Antiphlogistika (NSAIDs) sind häufig in der Tiermedizin eingesetzte Antiphlogistika (RADI u. KHAN 2006). Sie gehören zur Gruppe der schwachen Analgetika mit überwiegend peripherer Wirkung und besitzen analgetische, antiphlogistische, antipyretische und antiinflammatorische Eigenschaften (RADI u. KHAN 2006). Der Wirkmechanismus von NSAIDs beruht auf der reversiblen oder irreversiblen Hemmung der Cyclooxygenasen (Löscher 2010). Sowohl die selektiven als auch die nicht selektiven NSAIDs liegen nach ihrer Absorption größtenteils proteingebunden vor (UNGEMACH 2010).
Bezüglich der Hemmung der Cyclooxygenasen durch selektive und nicht selektive NSAIDs sind verschiedene Mechanismen beschrieben:
a) Die Acetylierung von Serin 530 der COX-1 bzw. von Serin 516 der COX-2 durch Acetylsalicyl- säure führt zu einer irreversiblen Blockierung des hydrophoben Kanals (FITZGERALD u. LOLL 2001).
b) Besitzen die NSAIDs eine Carboxylatgruppe, verbindet sich diese mit dem Argininrest an Aminosäureposition 120 im hydrophoben Kanal und blockiert ihn (MANCINI et al. 1995;
BHATTACHARYYA et al. 1996).
c) COX-1 und COX-2 unterscheiden sich aufgrund ihrer Aminosäurenanordnung. Dieser Unter- schied ist wichtig für selektive NSAIDs (LITTLE et al. 2007a). COX-1 besitzt an Amino- säureposition 434 und 523 Isoleucinreste. COX-2 hingegen besitzt an diesen Aminosäure- positionen nur einen schmalen Valinrest und es entsteht somit eine Seitentasche, an die die Liganden der selektiven NSAIDs binden (KURUMBAIL et al. 1996; WONG et al. 1997;
BERTOLINI et al. 2001). Des Weiteren besitzt COX-2 an der Aminosäureposition 513 einen Argininrest. Dieser reagiert mit Sulfonamidgruppen, die viele selektive NSAIDs aufweisen (KURUMBAIL et al. 1996). Durch diese beiden Mechanismen wird wiederum der hydro- phobe Kanal der COX-2 blockiert. Aufgrund dessen hemmen selektive NSAIDs vor allem die COX-2 und weniger die COX-1, was zu weniger unerwünschten Nebenwirkungen wie z. B.
Magenulzerationen (Kapitel 2.9.4) führt (WARNER et al. 1999; RADI u. KHAN et al. 2006).
Die Ausprägung der COX-Selektivität der verschiedenen COX-Inhibitoren ist des Weiteren davon abhängig, welcher Spezies sie appliziert werden (BRIDEAU et al. 2001). In einer In-vivo- Untersuchung von ischämie- und reperfusionsgeschädigtem equinem Jejunum konnten in Bezug auf die Infiltration der Tunica muscularis mit neutrophilen Granulozyten nach der Behandlung mit dem nicht selektiven NSAID Flunixin-Meglumin bzw. mit dem selektiven NSAID Firocoxib keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Des Weiteren wurde kein Effekt der beiden NSAIDs auf den signifikanten Anstieg der neutrophilen Granulozyten beobachtet (FRANZ 2013).
2.9 Einzelwirkstoffe 2.9.1 Flunixin-Meglumin
2.9.1.1 Pharmakokinetik
Das zu den Fenaminsäurederivaten gehörige Flunixin-Meglumin (FM) ist ein potenter, für die Tiermedizin zugelassener, nicht selektiver COX-Hemmer (PLUMB 2002). Flunixin-Meglumin wird aufgrund seiner guten analgetischen und antiphlogistischen Eigenschaften bei viszeralen und muskuloskeletalen Schmerzen routinemäßig eingesetzt (IONITA u. BREHM 2010). Die intravenöse Applikation von FM in der empfohlenen maximalen Dosierung (1,1 mg/kg KGW i. v.) zeigte im postoperativen Management von Kolikpatienten eine Verbesserung des All- gemeinbefindens (GERDEMANN et al. 1997). FM besaß zudem bei unterschiedlichen Operationen, im Vergleich zu Phenylbutazon und Carprofen, die längste postoperative analgetische Wirkung beim Pferd (JOHNSON et al.1993).
