8 Anhang
8.2 Probenbearbeitung
8.2.4 Puffer und Lösungen Immunhistochemie
Hämatoxylin-Stammlösung B
5,5 g Eisen(III)chlorid, wasserfrei ad 456 ml Aqua dest
4,6 ml konzentrierte Salzäure Gebrauchslösung
25 ml Biebrich-Scharlachrot 112,5 ml Hämatoxylinlösung A 112,5 ml Hämatoxylinlösung B
Die Gebrauchslösung muss täglich frisch angesetzt werden.
0,5 %iges Lithium-Karbonat
5 g Lithium-Karbonat ad 1000 ml Aqua dest
1 % Säurealkohol
32 ml rauchende Salzsäure (37 %ig) ad 1000 ml 100 %igem Ethanol
8.2.4 Puffer und Lösungen Immunhistochemie
BSA-Lösung (1 %ig)
50 ml PBS-Puffer 0,5 g BSA
BSA-Lösung (3 %ig)
50 ml PBS-Puffer 1,5 g BSA
10 mM Citrat-Puffer (ph=6,0) Stammlösung A: 0,1 M
Zitronensäure
21 g C6H8O7 x H2O2 (Zitronensäure) ad 1000 ml Aqua dest
Stammlösung B: 0,1 M
Natriumcitrat
29,41 g C6H5O7Na3 x H2O (Natriumcitrat) ad 1000 ml Aqua dest
Gebrauchslösung
18 ml Stammlösung A 82 ml Stammlösung B ad 1000 ml Auqa dest
ph-Wert von 6,0 einstellen
EDTA-Puffer
1,2 g mM Tris/HCl 0,372 g mM EDTA 1000 ml Aqua dest
ph-Wert von 9,0 einstellen
Ethanolreihe Ethanol (80 %)
800 ml Ethanol reinst (100 %) 200 ml Aqua dest
Ethanol (70 %)
700 ml Ethanol reinst (100 %) 300 ml Aqua dest
H2O2-Lösung
4 ml H2O2 30 %ig ad 200 ml Ethanol (80 %)
1 M NaOH-Lösung
40 g NaOH-Pellets ad 1000 ml Aqua dest
PBS-Puffer
7,8 g NaH2PO4 (Natriumdihydrogenphosphat) 40 g NaCl (Natriumchlorid)
ad 5000 ml Aqua dest.
ph-Wert von 7,2 einstellen 8.2.5 Stoffe und Reagenzien
Aqua dest
Biebricher Scharlach E. Merck Diagnostica, Darmstadt
Borsäure Riedel-de Häen AG, Seelze Hannover
BSA Sigma Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Chloroform stabilisiert in Ethanol E. Merck KGaA, Darmstadt Citronensäure-Monohydrat E. Merck KGaA, Darmstadt
DAB DAKO, Hamburg
EDTA-Dinatriumsalz Dihydrat Carl Roth GmbH + CoKG, Karlsruhe
Eisen(III)chlorid, wasserfrei Merck-Schuchardt, Hohenbrunn b. München
Eisessig 100 % E. Merck KGaA, Darmstadt
Eosin G E. Merck KGaA, Darmstadt
Ethanol 99 %, vollständig vergällt SAV-Liquid Production GmbH, Flintsbach Envision Rabbit DAKO North America, Kalifornien, USA
Eukitt® O. Kindler GmbH, Freiburg
Formalin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Glycin Pufferan Carl Roth GmbH + CoKG, Karlsruhe
Glyzerin Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Hämatoxylin Merck KGaA, Darmstadt
Haematoxylin, puriss Waldeck GmbH&Co Kg, Division Chroma, Münster Hydrogenperoxid, 30 % E. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Isopropanol SAV-Liquid Production GmbH, Flintsbach Lithiumcarbonat E. Merck Diagnostica, Darmstadt
Magnesiumchlorid Promega, Madison, USA
Methanol SAV-Liquid Production GmbH, Flintsbach
Natrium-Citrat / Tri-Natriumcitrat-2-hydrat
Riedel-de-Haen, RdH Laborchemikalien GmbH und Co. KG, Seelze
Natriumchlorid Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Natriumdihydrogenphosphat-Mono-hydrat
E. Merck KGaA, Darmstadt
Natronlauge E. Merck KGaA, Darmstadt
Paraformaldehyd E. Merck KGaA, Darmstadt
Proteinase K Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Pikrinsäure Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Salzsäure, konzentriert, 37 % Merck KGaA, Darmstadt
SDS Pellets (Natriumdodecylsulfat) Carl Roth GmbH + CoKG, Karlsruhe Sekundärantikörper Envision Rabbit, DAKO, Hamburg Säurefuchsin (Rubin S) E. Merck Diagnostica, Darmstadt TRIS-hydrochlorid Pufferan® Carl Roth GmbH + CoKG, Karlsruhe TRIS Pufferan® Carl Roth GmbH + CoKG, Karlsruhe
Xylol Riedel-de-Haen, RdH Laborchemikalien GmbH und Co. KG,
Seelze, Deutschland
Ziegenserum eigene Gewinnung, 30 min bei 56 °C inaktiviert, danach bei 21 °C eingefroren
8.2.6 Antikörper
Primärantikörper Immunhistochemie Herkunft
MAC 387 (Calprotectin) DCS Diagnostik Systeme, Hamburg
COX-1 Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreireich
COX-2 Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreireich
Sekundärantikörper Immunhisto-chemie
Envision Mouse DAKO, Hamburg
Envision Rabbit DAKO, Hamburg
8.2.7 Geräte
AusgießstationLeica EG 1150 Leica Micorsystems GmbH, Wetzlar Axioskop-Mikroskop Carl Zeiss Jena GmbH, Jena
Einbettgerät TP 1050 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar Labor-ph-Meter 766 Calimatic® Knick GmbH & CoKG
Gefrierschrank -20 °C Liebheer Gewebeinfiltrationsautomat Leica
ASP300S
Leica
Image Pro Express 6.3 Media Cybernetics, Bethesda, Maryland, USA Mikroskop Kamera DP-70 mit
Soft-ware DP-Soft
Olympus Europa GmbH, Hamburg
Kühlschrank AEG
Magnetrührer RH basic 2 IKAMAG®
(S1 Labor)
IKA®-Werke GmbH & CoKG, Staufen
Magnetrührer (Färbelabor) Heidolph
Paraffin-Streckbad GFL Gesellschaft für Labortechnik GmbH, Burgwedel Pipetten
Eppendorf Research Plus 0,1 – 2,5 µl
0,5 – 10 µl 2 – 20 µl 10 – 100 µl 20 – 200 µl
100–1000 µl Eppendorf AG, Hamburg
Schlittenmikrotom Jung AG, Heidelberg
Schüttler VXR basic Vibrax® IKA®-Werke GmbH & CoKG, Staufen Waage (Färbelabor) Ohaus Corporation, New Jersy, USA Waage (IHC-Labor)
Waage (S1-Labor)
Waage Sartorius TE 412 (S-1 Labor) Sartorius
Wärmeschrank Heraeus
Wasserbad Memmert GmbH & CoKG, Schwabach
8.2.8 Verbrauchsmaterialien
Aufbewahrungsboxen für Paraffinblöcke Medite Medizinprodukte, Burgdorf
Deckgläschen, 24 x 50 mm Knittel Glasbearbeitungs GmbH, Braunschweig Einbettungskapseln Jet AktivFloTM Leica Biosystems GmbH, Illinois, USA
Feeling Kosmetiktücher Netto Markendiscount, Maxdorf-Haidhof Handschuhe Nobaglove Nitril® puderfrei NOBA Verbandmaterial Danz GmbH, Wetter Objektträger Histobond® (silanbeschichtet) Marienfeld GmbH und Co. KG, Laud-Königshofen
Parafilm Bemis Company, Inc., Neenah, WI, USA
Pipettenspitzen Eppendorf AG, Hamburg
Brand GmbH + CoKG, Wertheim
8.3 Tabellarische Auswertung Calprotectin 8.3.1 Probe Kontrolle
Neutrophile Granulozyten Spalte1Spalte2Spalte3Spalte4Spalte5Spalte6Spalte7Spalte8Spalte9Spalte10Spalte11Spalte12Spalte13Spalte14Spalte15Spalte16Spalte17Spalte18 Probe 1: Jejunum Kontrollprobe PferdFOVTunica muscularisTunica serosa Zirkulärmuskulatur (ZM)intermuskuläre Schicht(IM)Längsmuskulatur(LM)Serosa (S) ZellzahlMwZellen/mm²ZellzahlMwFläche (µm²)MwZellen/mm²ZellzahlMwZellen/mm²ZellzahlMwFläche (µm²)MwZellen/mm² FOV 140021333850 1FOV 2023,5555555600000124,44444444441183008255835 FOV 300021177820 FOV 1000000 2FOV 2000000000000000 FOV 3000000 FOV 1000000 3FOV 2000000000000000 FOV 3000000 FOV 10048246000 4FOV 200000,5459904194311,920000000 FOV 30135640000 FOV 1000000 5FOV 2000000000000000 FOV 300000 FOV 100000230370 6FOV 2403,555555560000000001569895372351 FOV 300002514332 FOV 1403745010264682 7FOV 2035,3333333300,552411519539,6200,50,88888888900,5315570235130 FOV 3216645601205578 FOV 11386956000 8FOV 2011,7777777801,51256258704017,2300,50,8888888890000 FOV 31087124100 FOV 1100000 9FOV 200,50,88888889000000000000 FOV 3000000 FOV 1033213000340032 10FOV 200001,5373924855335,2500020264455329928 FOV 3006497600319824 FOV 1000000 11FOV 2000000000000000 FOV 3000000 FOV 1000100 12FOV 20000000010,51,7777777780000 FOV 3000000
8.3.2 Probe Ischämie
Probe 2Jejunum nach 90 minütiger Ischämie PferdFOVTunica muscularisTunica serosa Zirkulärmuskulatur (ZM)intermuskuläre Schicht(IM)Längsmuskulatur(LM)Serosa (S) ZellzahlMwZellen/mm²ZellzahlMwFläche (µm²)MwZellen/mm²ZellzahlMwZellen/mm²ZellzahlMwFläche (µm²)MwZellen/mm² FOV 11001011330844 1FOV 2023,5555555600000126,522,222222221110,5309993294552,5 FOV 3300310258261 FOV 130084340018 2FOV 20200000047,111111111142310758273590,5 FOV 310000207163 FOV 110079177017495075 3FOV 246,515,1111111093992567960000517443462449767,5 FOV 331856743017404460 FOV 1005229000330165 4FOV 200020600591702120002110318720350421 FOV 300288134020370677 FOV 1000000 5FOV 200000000000000 FOV 3000000 FOV 14000495535 6FOV 2248,88888889000021,54,44444444454268681152905,5 FOV 340034210276 FOV 1006630712400770 7FOV 200,50,8888888930653106236633821461214389790 FOV 3105842550378810 FOV 154260291925624645 8FOV 204,582322,5630138280308,515,111111113533,5518511708686 FOV 343105315842792727 FOV 14010961058453744 9FOV 2248,8888888900,5163240180308,502,54,444444444610484051414551 FOV 341251007012375358 FOV 1000000 10FOV 200,50,8888888900000000000 FOV 3100000 FOV 1000000 11FOV 200000000000000 FOV 3000000 FOV 10142869691249261294 12FOV 2136,2222222207297501768273816,88888889327,5333060243327 FOV 3606668546225360
8.3.3 Probe Ischämie-Reperfusion
Probe 3: Jejunum nach 30 minütiger Reperfusion PferdFOVTunica muscularisTunica serosa Zirkulärmuskulatur (ZM)intermuskuläre Schicht(IM)Längsmuskulatur(LM)Serosa (S) ZellzahlMwZellen/mm²ZellzahlMwFläche (µm²)MwZellen/mm²ZellzahlMwZellen/mm²ZellzahlMwFläche (µm²)MwZellen/mm² FOV 19001222205585 1FOV 234,510,666666700001420483325,596300198615,5 FOV 30002829191646 FOV 1100311454176 2FOV 200,50,88888889000016319,555555569637502014341654 FOV 3000363229132 FOV 111682681919416362 3FOV 2161235,555555609,57892369446191238,222222229322,5410294436725 FOV 31313562111526457088 FOV 1252061770359632 4FOV 2011,7777777802,5534093804503,56,22222222207,5307746354025 FOV 30055473015348418 FOV 13091924132331191 5FOV 2124,4444444420285366604731,55,3333333334943,5359014261533 FOV 31040170255191875 FOV 100061579600 6FOV 20000000136,2222222221216,5417333469991 FOV 3000032360382 FOV 1208905918150553212 7FOV 2213,555555560107062170809,52044,596,88888889128167114762481252,5 FOV 30205256071184409293 FOV 12002194461010 8FOV 2011,7777777800003011,547,1111111119109275338414408 FOV 30002124367806 FOV 107839368042321429 9FOV 2225,333333331345742504561625022,222222229650344226324776 FOV 341251864058328123 FOV 15428224518891954 10FOV 24410,666666784975173482772754,22222222159153,5185370111394,5 FOV 334414303219130835 FOV 100365312949215484 11FOV 200,50,88888889604159148640,5914,533,777777783836317985224917 FOV 31060750023234350 FOV 100002279227 12FOV 20000000213,55555555601382453268190 FOV 300020257153
8.3.4 Probe- Plica duodenocolica
Probe 4: Jejunum aboral der Plica duodenocilica PferdFOVTunica muscularisTunica serosa Zirkulärmuskulatur (ZM)intermuskuläre Schicht(IM)Längsmuskulatur(LM)Serosa (S) ZellzahlMwZellen/mm²ZellzahlMwFläche (µm²)MwZellen/mm²ZellzahlMwZellen/mm²ZellzahlMwFläche (µm²)MwZellen/mm² FOV 1220109224119155167412 1FOV 2612,333333332,88888896220,666666712052854686,55381216126116,3333333407987241116 FOV 390804097168314820 FOV 11057105011508492 2FOV 200,666666671,77777778021645828627004932,33333333375648370886 FOV 31629883037233280 FOV 10062012650338035 3FOV 200,3333333332,888888920,6666666721116531080,5025,3333333332243427350348625,5 FOV 31023569057359216 FOV 10626611043452400 4FOV 20032,8888889025153513380000618,66666667501676449712 FOV 3004739407447024 FOV 1014880001106095 5FOV 20032,888888900,333333334166824474,50001215441180204825 FOV 30084866032303555 FOV 1104898213160387353 6FOV 27332,8888889219,333333331420024565,5512874,66666667206165436653344214 FOV 3176321420129301075 FOV 1000164305457 7FOV 201,6666666732,8888889000000,3333333330,88888888984110,6666667180606322703,5 FOV 35000184339950 FOV 1000070148249 8FOV 200,6666666732,8888889000004,66666666712,4444444414599,66666667106950155199,5 FOV 32001484162150 FOV 11035445578 9FOV 210,6666666732,888888900,333333337116217797025,333333333181121,6666667 FOV 301698611106 FOV 100004 10FOV 20032,8888889000000042,666666667 FOV 300000 FOV 120000217980 11FOV 200,6666666732,8888889000000065,666666667179822226227,5 FOV 3000011234475 FOV 126595702064252954 12FOV 200,6666666732,888888908,3333333311886829859,53821,33333333188132169506265324,5 FOV 3019245631144277695
8.3.5 Probe-Ileum
Probe 6: Ileum nach IR PferdFOVTunica muscularisTunica serosa Zirkulärmuskulatur (ZM)intermuskuläre Schicht(IM)Längsmuskulatur(LM)Serosa(S) ZellzahlMwZellen/mm²ZellzahlMwFläche (µm²)MwZellen/mm²ZellzahlMwZellen/mm²ZellzahlMwFläche (µm²)MwZellen/mm² FOV 11234102210038271125 1FOV 21716,333333343,5555556755313944951105000034,66666667273465203350,5 FOV 320500066135576 FOV 1108891402447556 2FOV 210,666666671,7777777882,66666667833127684342,3333333336,22222222222331224365114 FOV 3006477232282672 FOV 134587930442987 3FOV 2114,6666666712,444444401,333333337716968474012,66666666706,3333333330130149,5 FOV 30078155315217312 FOV 100006267512 4FOV 20000000000106,333333333224220267197,5 FOV 300003266883 FOV 10004178754429 5FOV 2000000001,3333333333,555555556153110,3333333461463377214,5 FOV 3000000 FOV 100013160451878 6FOV 2312,666666670000512874,66666667206165608691428482 FOV 300020129405086 FOV 1000238403656 7FOV 231,333333333,55555556000000,6666666671,7777777783868,33333333375760328629 FOV 3100052253602 FOV 1000188294035 8FOV 2000000000,3333333330,8888888897578367843245909,5 FOV 3000071197784 FOV 10360183092474284 9FOV 2012,6666666701030091,5000110112,3333333352787391628,5 FOV 33000135308973 FOV 100004157382 10FOV 2000000000005,333333333246387212140 FOV 3000012266898 FOV 1 11FOV 2Fehlt!! FOV 3 FOV 1100017400972 12FOV 200,333333330,888888890000000138,66666667173597305069 FOV 3000098209166
8.3.6 Probe-Plica ileocaecalis
Probe 6 : Oral Plica ileocaecalis nach IR PferdFOVTunica muscularisTunica serosa Zirkulärmuskulatur (ZM)intermuskuläre Schicht(IM)Längsmuskulatur(LM)Serosa (S) ZellzahlMwZellen/mm²ZellzahlMwFläche (µm²)MwZellen/mm²ZellzahlMwZellen/mm²ZellzahlMwFläche (µm²)MwZellen/mm² FOV 14000140347694 1FOV 242,666666677,11111111000000009578,33333333504987173847 FOV 3000000 FOV 1000114275865 2FOV 2312,666666670000000,3333333330,8888888894521,66666667462915260754 FOV 300006245643 FOV 1100310204750 3FOV 210,666666671,7777777800000012,66666666779177165196275 FOV 3000010187800 FOV 1000000 4FOV 200000000000000 FOV 30000000 FOV 1000028406204 5FOV 200000000312,666666667511311363374597 FOV 300000342990 FOV 10423562413251199 6FOV 200001,33333333739663535622,6666666677,111111111910,33333333335192294405 FOV 3004715029337611 FOV 12951998017372860 7FOV 2156165522,66666678706255983,50004437,66666667171928301997,5 FOV 31459969052231135 FOV 1705909532877763 8FOV 25410,666666751,666666677583929547,5012,66666666721010304438881,5 FOV 3000000 FOV 11004136223634 9FOV 222,333333336,22222222000095,66666666715,111111112573,33333333129413219184,5 FOV 3400459214735 FOV 182271745475948177 10FOV 264,6666666712,44444441311,66666675795035872,5718481207047824088,5 FOV 3000000 FOV 1Fehlt!! 11FOV 2 FOV 3 FOV 100010212336 12FOV 20000000000,3333333330,88888888920,666666667158760184665 FOV 300000156994
8.3.7 Probe-Caecum
Probe 7: Caecum nach IR PferdFOVTunica muscularisTunica serosa Zirkulärmuskulatur (ZM)intermuskuläre Schicht (IM)Längsmuskulatur(LM)Serosa (S) ZellzahlMwZellen/mm²ZellzahlMwFläche (µm²)MwZellen/mm²ZellzahlMwZellen/mm²ZellzahlMwFläche (µm²)MwZellen/mm² FOV 123006836262252 1FOV 2272669,333333300004672,66666667193,77777785265,33333333394800174944,5 FOV 3280010410887637 FOV 178177342014235768 2FOV 23410,666666754,3333333310434313518800046,666666667282116210807,5 FOV 3209303402185847 FOV 151319016213145320 3FOV 2338488576037195,5106,33333333316,888888892722,66666667175867117293,5 FOV 3175537572889267 FOV 100152960171247237 4FOV 212410,666666704,6666666780716109654212,666666667116100,3333333266371288084,5 FOV 3014663480114328932 FOV 127998310098525 5FOV 265,6666666715,111111143,6666666782790264828,520,6666666671,77777777802,666666667285863180748 FOV 39042982608262971 FOV 10753015213675146 6FOV 200003624039539821129,333333331222,33333333104091145731,5 FOV 3021377811019216317 FOV 126000063147 7FOV 261129,333333371729822436222,5301232014672531573,5 FOV 314472445630 FOV 10661230244989160270 8FOV 241,333333333,555555568067,66666671065601549552425,6666666768,444444447080,33333333209805167915 FOV 3057186886482175560 FOV 1041522691386278 9FOV 220,666666671,77777778020,3333333124026134015,5212,666666667115,66666666785997120293 FOV 30611576203154308 FOV 102785150390187 10FOV 200021,6666666713610990206,500023,6666666677477489628 FOV 3011018980689069 FOV 1000000 11FOV 220,666666671,7777777800000000000 FOV 3000000 FOV 11026044524158647 12FOV 221,333333333,5555555672,3333333312293118600000,6666666671,77777777811,666666667193693165151 FOV 31011155500171655
8.3.8 Probe-Beckenflexur
Probe 8: Beckenflexur nach IR PferdFOVTunica muscularisTunica serosa Zirkulärmuskulatur (ZM)intermuskuläre Schicht(IM)Längsmuskulatur(LM)Serosa (S) ZellzahlMwZellen/mm²ZellzahlMwFläche (µm²)MwZellen/mm²ZellzahlMwZellen/mm²ZellzahlMwFläche (µm²)MwZellen/mm² FOV 1110327526254127048 1FOV 21410,333333327,55555562513,666666731054390466059,66666667159,11111118164,33333333222611152015 FOV 3616453405758176982 FOV 1136350001428578 2FOV 2212,666666670158610262657,500,6666666671,77777777831,666666667252782445196,5 FOV 30046181521461815 FOV 153222388870109290 3FOV 23410,66666672020,333333317243423105065,66666666715,1111111131,33333333388900130556,5 FOV 34923821241151823 FOV 122099271321117008 4FOV 201,333333333,5555555649,666666678151061307411,6666666731,111111111630204290178040 FOV 325233432853239072 FOV 100000175192 5FOV 2000000000020,666666667164169253830,5 FOV 300000332469 FOV 100004187400 6FOV 210,666666671,77777778000000,3333333330,88888888942,666666667260100233220 FOV 310010279040 FOV 101167780200204937 7FOV 20000161396907406,500031231165208068,5 FOV 30213701100211200 FOV 1300010319614 8FOV 232,666666677,11111111000011,3333333333,55555555603,333333333302394159807 FOV 3200300 FOV 12093700094201600 9FOV 2012,6666666710,3333333314647584143,50005987,33333333207888198213,5 FOV 310745870109194827 FOV 1006308322288225 10FOV 200000,333333334323069451,522,3333333336,22222222263,666666667130832245243 FOV 3017582033202261 FOV 110000391090 11FOV 200,333333330,88888889000000000270015220368,333 FOV 3000000 FOV 123102930265227981 12FOV 2012,66666667116,6666666711968211117300,6666666671,7777777789561169889252381,5 FOV 316119416023276782