Zinkfinger-Nukleasen

Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) sind keine natürlich vorkommenden Enzyme, sondern bestehen aus zwei miteinander fusionierten funktionalen Einheiten. Die erste Einheit ist eine DNA-Bindedomäne, welche als Zinkfingerdomäne bezeichnet wird. Der Name resultiert aus der koordinativen Bindung eines Zn²⁺-Ions zwischen einer α-Helix und einem Anti-parallelen β-Faltblatt. Dabei wird das Zn²⁺-Ion von zwei Histidinen und zwei Cysteinen koordinativ gebunden (Abbildung 12 A). Die Aminosäuren -1–6 der α-Helix erkennen ein DNA-Triplett durch eine basenspezifische Bindung in der großen Furche der DNA-Doppelhelix. In einem ZFN-Protein werden 3–4 dieser Domänen hintereinander angeordnet. Am C-Terminus wird die zweite funktionale Einheit, eine DNA-Restriktionsdomäne, fusioniert. Diese entstammt einem natürlich vorkommenden DNA-Restriktionsenzym, dem FokI, welches aus Flavobacterium okeanokoites isoliert wurde. Für die Anwendung in Zinkfinger-Nukleasen wird nur die C-terminale DNA-Restriktionsdomäne des FokI-Enzyms verwendet. Zinkfinger-Nukleasen bestehen also aus 3–4 N-terminalen Zinkfingerdomänen und einer C-N-terminalen DNA-Restriktionsdomäne (Abbildung 12 A).

Abbildung 12 Zinkfinger-Nukleasen

(A) Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) binden mittels einer α-Helix in der großen Furche der DNA. Ein Zink-Ion wird durch Seitenketten

Würde mit der Zinkfinger-Technologie eine ZFN mit 3–4 Zinkfingerdomänen verwendet werden, ergibt sich eine Zielsequenz von 9-12 Basenpaaren (bp). Statistisch gesehen kommt eine 12 bp lange Sequenz einmal alle 1,6 x10⁷ bp (4¹²) vor. Das humane Genom umfasst jedoch z.B. 3 x10⁹ bp, wodurch nicht gewährleistet ist, dass eine ZFN nur einmalig innerhalb des Genoms schneidet.

Der erste Schritt, um dies zu ändern, war die Konstruktion einer FokI-Restriktionsdomäne, die nur als Heterodimer einen DSB verursachen kann (Miller et al., 2007). Dadurch wird die Verwendung zweier ZFN-Proteine und eine Erweiterung der Zielfrequenz auf 18-24 bp ermöglicht.

Somit kommt die gewählte Basenpaar-Abfolge nur noch einmal innerhalb von ~7x10¹⁰ bp (4¹⁸) vor, was für eine einmalige Bindung innerhalb des Genoms ausreichend ist.

Eine weitere Herausforderung bestand darin, dass nicht für alle 64 Codons (4³) eine entsprechende Zinkfingerdomäne vorhanden war. Aus diesem Grund wurden in aufwendigen Permutationsexperimenten (Segal et al., 1999; Dreier et al., 2001) die sieben Aminosäuren der α-Helix (Abbildung 12 A), welche die Bindung an die DNA ermöglichen, systematisch ausgetauscht, um neue DNA-Bindeeigenschaften zu generieren. Dies konnte erfolgreich durchgeführt werden.

Da sich aber die DNA-Bindeeigenschaft der einzelnen Zinkfingerdomänen ändert, sobald sie in einem drei- oder vierfinger Modul integriert werden, wurden verschiedene Evaluierungsmethoden angewandt, um die Eigenschaften von neu zusammengefügten Zinkfinger-Modulen zu charakterisieren.

„Oligomerized Pool Engineering“ oder kurz „OPEN“ ist eine sehr viel präzisere Zinkfinger-Evaluierungsmethode. Hierbei werden die dreifinger-Module im Zusammenspiel getestet, was eine bessere Beurteilung des Gesamtverhaltens ermöglicht. Die Sequenzspezifität wird hier experimentell in einem „Bakterien-Zwei-Hybrid-System (B2H)“ getestet (Maeder et al., 2009).

Kann ein zusammengefügtes dreigliedriges Zinkfinger-Modul die vorgegebene Basenpaarsequenz erkennen, erfolgt die Aktivierung eines Reportergens. Je besser ein solches Modul an die Zielsequenz binden kann, desto höher ist die Transkription des Reporters. Auf diese Weise ist es möglich, Aussagen über die Bindeeigenschaften zusammengefügter Einzelmodule zu treffen. Eine Verdreifachung der Reporteraktivität wird hierbei als niedrigster Ausgangswert betrachtet. Das Problem dieses Ansatzes besteht darin, dass es eine hohe Anzahl an möglichen Triplett-Kombinationen gibt und nicht für jede steht ein experimenteller Datensatz zur Verfügung.

„Context Dependent Assembly“ oder kurz CoDA setzt an diesem Problem an. Innerhalb eines dreigliedrigen Zinkfingermoduls (F1 – F3) wird die mittlere Position (F2) als die Wichtigste für die DNA-Bindeeigenschaften angesehen. CoDA benutzt den experimentellen Datensatz von OPEN

beide funktional sind im Zusammenspiel mit einer identischen zentralen F2-Domäne (Abbildung 12 C). Zusammengefasst bedeutet dies, wenn F1-F2-X und Y-F2-F3 funktionieren, dann besteht eine hohe Erfolgschance, dass die Kombination F1-F2-F3 ebenfalls funktioniert.

Ein optimales Paar von Zinkfinger-Nukleasen erkennt die gewählte Zielsequenz, bindet an diese und verursacht genau einen Doppelstrangbruch (DSB) innerhalb des Genoms. Leider ist dies oftmals nicht der Fall, denn verschiedene Faktoren beeinflussen die Funktionsweise von ZFNs. Im schlimmsten Fall erkennen die in silico konstruierten ZFNs nicht die Zielsequenz und sind somit nicht funktional. Das andere Extrem ist eine hohe „off-target“-Aktivität, was bedeutet, dass die ZFNs nicht nur innerhalb der Zielsequenz einen DSB verursachen, sondern auch an vielen weiteren Stellen im Genom. Dies kann zur Instabilität eines Genoms führen und schließlich zum Zelltod. Somit ist es oftmals nicht vermeidbar neu konstruierte ZFNs in weiteren Vorexperimenten zu testen. Optimaler Weise geschieht dies in dem Organismus, in welchem die Nukleasen später zur Anwendung kommen sollen. In Zellkultursystemen wie z.B. HEK293 oder HeLa wird hierzu ein Reportersystem verwendet, welches auf der Reparatur eines inaktivierten GFPs (grün fluoreszierendes Protein) beruht. Hierbei wird die ZFN-Zielsequenz in das GFP-Gen integriert, was zu dessen Funktionsverlust führt. Diese Sequenz wird zuerst stabil in das Genom einer Zelllinie integriert. Die so generierte Reporter-Zelllinie wird dann mit den zu testenden ZFNs transfiziert. Abhängig vom Design des Reportersystems, wird noch ein Teil des GFP-Gens als Reparatur-Matrize Co-transfiziert. Erkennen die ZFNs nun die Zielsequenz innerhalb des inaktivierten GFPs, entsteht ein DSB, welcher unter Zuhilfenahme der Reparatur-Matrize repariert werden kann. Diejenigen Zellen welche funktionale GFP-Proteine exprimieren, können nun anhand ihrer Fluoreszenz in einem Durchflusszytometer detektiert werden. Das Verhältnis von fluoreszierenden zu nicht-fluoreszierenden Zellen einer transfizierten Zellpopulation gibt Aufschluss über die Funktionalität der neu generierten ZFNs.