Optimierung

Um die Rekombinationseffizienz zu erhöhen, wurden zwei verschiedene Ansätze verfolgt. Zum einen wurden Mutationen in die FokI-Nukleasedomäne (englisch: FokI cleavage domain – FCD) eingefügt, um die katalytische Aktivität (Guo et al., 2010) zu erhöhen. Zum anderen wurden die Kulturen des Teststammes ZF37 synchronisiert und zu verschiedenen Zeitpunkten des Zellzykluses transformiert. In vielen Studien zur Anwendung von ZFNs in pflanzlichen oder

Zyklus kultiviert werden. Da der hier verwendete Teststamm ZF37 bzw. der parental Stamm CW15-302 keine Flagellen besitzt, ist die zu erwartende Synchronität etwas geringer als z.B. in einem motilen Wildtypstamm. Um dies zu überprüfen, wurde eine Wachstumskurve des ZF37 Stammes aufgezeichnet (Abbildung 17). Tatsächlich konnte eine ausreichend gute Synchronisation erreicht werden, was sich im Anstieg der Zellzahl gegen Ende der Lichtphase zeigte. Bei nicht oder nur schlecht synchronisierten Kulturen würde die Zellzahl schon während der Lichtphase kontinuierlich ansteigen. Zur Überprüfung des synchronen Wachstums wurden vor den Experimenten die Kulturen mikroskopisch auf das Vorhandensein von teilungsaktiven Zellen überprüft. Diese sind unter dem Mikroskop gut als nicht–motile, zwei- bis viergeteilte Zellen zu erkennen.

Abbildung 17 Synchronisation ZF37

Eine ZF37 Kultur wurde in einem Licht-Dunkel-Zyklus synchronisiert. Die Zellzahl wurde stündlich gemessen. Gezeigt sind die Ergebnisse zweier unabhängiger Messungen. Die Werte wurden gemittelt und gefittet (rot). Die Zeitpunkte der Transformationen sind grau hinterlegt.

Um die katalytische Aktivität der FokI-Nukleasedomänen zu erhöhen, wurden zwei Mutationen (S418P und K441E) analysiert, die in Studien an HEK293-Zellen eine erhöhte Nukleaseaktivität bewirkten (Guo et al., 2010). Die Auswirkungen dieser Mutationen auf das ZFN-Verhalten in Chlamydomonas wurden auf Basis der COP3-FokI^M-Heterodimere getestet, wobei alle hier im Folgenden beschriebenen Mutationen in beide Heterodimere integriert wurden.

ZF37-Kulturen wurden synchronisiert und zu Beginn der einsetzenden Teilungsphase (S/M-Phase) transformiert. Dabei zeigte sich, dass die Verwendung der S418P (FokI^M-SP) oder K441E (FokI^M-KE) Mutationen zu einer, im Vergleich zu den Kontrollen mit FokI^M, drei- bis vierfachen Erhöhung der Anzahl an Pm-R Kolonien mit repariertem aphVIII führte (Abbildung 18 C). In der von Guo et al.

durchgeführten Studie, ergab die Kombination beider Mutationen (FokI^M-SP/KE) die höchste FCD-Aktivität. Wie sich in unseren Versuchen jedoch zeigte, führte diese Kombination zu einer mehr als vierfachen Abnahme der Pm-R Kolonien. Diese Reduzierung könnte das Resultat einer erhöhten „off-target“-Aktivität sein, welche zum Zelltod führte.

Eine genauere Betrachtung der FokI-Kristallstruktur (Wah et al., 1997) zeigte, dass Ser418 eine polare Bindung mit einem Phosphatrest am Rückgrat der DNA-Doppelhelix eingeht (Abbildung 18 B). Diese befindet sich in räumlicher Nähe zum Aktiven Zentrum (Asp450, Asp467, Ly469). Die Substitution von Ser418 durch eine Prolin führt zum Verlust der polaren Bindung zwischen der FCD und dem DNA-Rückrat, welches eine Erhöhung der Nukleaseaktivität in Hek293-Zellen bewirkte (Guo et al., 2010). Die Modellierung eines Arginins an die Position Ser418 würde hingegen die Ausbildung einer zweiten polaren Bindung ermöglichen (Abbildung 18 B), welche in diesem Falle eventuell eine Abnahme der katalytischen Aktivität zur Folge hätte. Um diese Hypothese zu überprüfen wurde in den COP3-ZFNs Ser418 durch ein Arginin (FokI-SR) substituiert. Wie sich zeigte, war die Annahme korrekt und eine dreifache Reduzierung der Pm-R Kolonien resultierte aus diesen Experimenten. Im Gegensatz zur FokI-SP/KE Variante der FCD, welche aufgrund einer erhöhten Aktivität zu einer Verringerung der Pm-R Kolonien führte, ist bei der SR-Variante von einer verringerten Aktivität auszugehen. Da FokI-SP und FokI-KE eine Verbesserung der Rekombinationseffizienz bewirkten, wurde anschließend überprüft, ob auch in diesen Varianten die erhöhte Aktivität in einem gewissen Prozentsatz der Transformanten zytotoxische Effekte verursacht und einen Verlust von Pm-R Kolonien bewirkt. Daher wurde die SR-Mutation mit der KE-Mutation kombiniert (FokI-SR/KE) (Variante 5). Dies Annahme konnte nicht bestätigt werden; als Ergebnis konnte gezeigt werden, dass diese Kombination die höchste Anzahl an Pm-R Kolonien generierte (Abbildung 18 C).

Als nächstes wurde verglichen, in wieweit die Zellzyklusphase einen Einfluss auf die aphVIII Reparatureffizienz ausübt. Hierzu wurden ZF37-Kulturen synchronisiert und auch während der Wachstumsphase (G1) transformiert. Die Varianten SP und KE zeigten dabei, wie erwartet, eine bessere Reparatureffizienz während der S/M-Phase. Die Varianten FokI^M, FokI-SR und FokI-SP/KE generierten nur sehr wenige Pm-R Kolonien und zeigten daher auch keine signifikanten Tendenzen. Transformationen mit FokI-SR/KE resultierten in beinahe gleich hohen Zahlen an Kolonien. Der Unterschied von G1 zu S/M war hierbei geringer als bei SP und KE (Abbildung 18 C).

Da die untersuchten FokI-Varianten immer mit den gleichen Mutationen in beiden

gezielten Genstilllegung von COP3 die SR/KE-Variante verwendet, um S/M synchronisierte Zellen zu transformieren.

Abbildung 18 Vergleich FokI-Varianten

(A) Tabellarische Darstellung der verwendeten FokI-Varianten. (B) Modellierung der mutierten Aminosäuren in die Kristallstruktur der FokI-Domäne (PDB entry: FOKI) gebunden an DNA. Das aktive Zentrum ist in rot dargestellt, die Dimerisierungsdomäne in gelb und das Helix-turn-Helix-Motiv, welches die Bindung an DNA vermittelt, in blau. Durch gestrichelte Kreise hervorgehoben sind Substitution S418R in hellblau und K441E in grün. (C) Mutierte Fok^M-Varianten wurden auf ihre Fähigkeit getestet, eine Verbesserung der HR zu bewirken. Synchronisierte Zellen wurden entweder während G1 (grau) oder S/M (blau) transformiert. Es wurden mindestens zwei unabhängige Experimente durchgeführt. Die Balken zeigen Mittelwerte dieser Experimente, die Fehlerbalken die Standardabweichung. Die Werte wurden auf die Anzahl der generierten Kolonien mit Fok^M normalisiert. (D) Bedingungen analog zu C. Getestet wurden alle Kombination an generierten Varianten (1L+1R, 1L+2R, …bis 6L+6R). Dargestellt sind die Ergebnisse der besten Kombinationen.