Sequenzspezifische Insertionen oder Deletionen

Anhand der durchgeführten Vorversuche konnte nun eine ausreichend hohe Anzahl an Transformanten erzeugt werden, um nach Deletionen im COP3-Gen zu suchen. Dabei sollten die durch Verwendung der COP3-spezifischen ZFNs generierten Pm-R Kolonien des Modellstammes ZF37 untersucht werden. Wie schon in den beiden vorangegangenen Kapiteln gezeigt, diente die

nun davon ausgegangen werden, dass die für die Transformation verwendeten ZFNs die COP3-Zielsequenz erkennen und möglicherweise sowohl im aphVIII als auch im COP3-Genlocus einen DSB verursachen. Für die Wiederherstellung eines funktionalen aphVIII wurde eine Matrizen-DNA (Δ120aphVIII) verwendet, welche dann durch homologe Rekombination integriert wird. In den ersten Versuchen zur Detektion einer Deletion im COP3-Gen wurde auf die Verwendung einer Matrizen-DNA verzichtet. In diesem Falle erfolgt die Reparatur eines erfolgten DSBs durch Nicht-homologe Endverknüpfung (non-homologous end joining; NHEJ) der freien Enden. Dieser Reparaturmechanismus führt oft zu kleinen Insertionen oder Deletionen (InDels) innerhalb des Zielgens (Wright et al., 2005). Wie in Kapitel 1.4.2 beschrieben, können derartige Änderungen der Basenpaar-Abfolge mit Hilfe der Cel-1 Nuklease detektiert werden. Dies belegt eine detaillierte Studie von Perez-Pinera (Perez-Pinera et al., 2012), welche auf der Analyse des ROSA26 Locus in Mäuse-Zelllinien beruht.

Die Analyse von 192 Pm-R Kolonien führte zur Detektion zweier Mutanten, bei denen die Anwendung der ZFNS zu einer 9 bp bzw. 18 bp (ZF37-Δ9 und ZF37-Δ18) Deletion innerhalb des COP3-Ziellocus führte. Der erhoffte Knockout des COP3-Gens blieb bei beiden Mutanten leider aus, da das korrekte Leseraster des Gens erhalten blieb. Darüber hinaus wurde ein Klon gefunden, der eine 3,5 kb Insertion innerhalb des Zielgens enthielt, somit konnte kein funktionales COP3 mehr translatiert werden. Die Sequenzierung dieser Insertion ergab, dass es sich um eine teilweise Kopie der Modellkassetten-Sequenz handelte, wobei die Sequenzinformation des Promotors bis hin zur ZFN-Bindestelle in das COP3-Gen inseriert wurde.

Die Experimente zeigten, dass die durch den NHEJ-Reparaturmechanismus erzeugten Mutationen für unser Vorhaben wenig zuverlässig sind. Sie sind nicht vorhersehbar und wie im Falle von ZF37-Δ9 und ZF37-Δ18 auch oftmals nicht verwertbar. Die experimentelle Durchführung ist sehr aufwendig und die Detektion positiver Klone mittels Cel-1 Analysen in DNA-Polyacrylamidgelen schwer zu Visualisieren (Abbildung 19).

Da die Zielstellung in der Entwicklung einer verlässlichen Methode zur gezielten Sequenzveränderung bestand, wurde für weitere Experimente eine DNA-Matrize für das COP3-Gen verwendet. Dies sollte eine genaue Sequenzveränderung durch homologe Rekombination mit dem Zielgen ermöglichen.

Die meisten Studien der homologen Integration einer Matrizen-DNA in ein Zielgen stellten eine Abnahme der Effektivität mit kürzer werdender Sequenzhomologie fest. Daher wurde in ersten Versuchen eine Matrizen-DNA verwendet, die 2 kb in 5´und 3´ Richtung ausgehend von der ZFN-Bindestelle umfasste. In die ZFN-ZFN-Bindestelle der Matrize wurde eine 58 bp lange Sequenz integriert, die ein FLAG-Tag codiert (Einhauer and Jungbauer, 2001). Die Insertion zwischen der COP3-R und COP3-L1 Erkennungssequenz sollte eine mögliche weitere Hybridisierung der heterodimeren FokI-Nukelasedomänen verhindern, somit können die ZFNs nach der Integration der Donor-DNA keinen Doppelstrangbruch mehr verursachen. Außerdem wurden in das Template zwei Stopcodons eingefügt, die einen vorzeitigen Translationsstop verursachen. Mittels Western-Blot-Analysen dieser Transformanten, unter Verwendung eines COP3 spezifischen primären Antikörpers, konnten keine Deletionsmutanten des COP3-Gens gefunden werden. Die Problematik der Western-Blot-Experimente ist die relativ geringe Anzahl an Klonen, die gleichzeitig analysiert werden kann. Bei der experimentellen Durchführung dieser Analysen mussten kleine Geltaschen verwendet werden, um die Analyse einer größeren Anzahl an Proben zu ermöglichen. Beim Beladen der Geltaschen kann es auch bei vorsichtiger Handhabung leicht zur Überführung von Probenmaterial in benachbarte Taschen kommen. Die Folge ist eine Signaldetektion, die mögliche Deletionsmutanten überdeckt. Zu diesem Zeitpunkt konnte noch keine Aussage darüber getroffen werden, wie viele Analysen von Transformanten nötig sein werden, um eine Deletionsmutante zu identifizieren. Die Analyse mit PCR stellt daher eine effizientere Detektionsmethode dar.

Abbildung 20 Template-DNA Design

(A) Insertions-Template: Schematische Darstellung des Insertions-Template. Angegeben ist die Homologieregion (geschlossene Pfeile) 5´und 3´der ZFN-Zielsequenz. Die 58 bp Insertion ist in Rot dargestellt. Innerhalb dieser Sequenz bindet der vorwärts gerichtete Primer (rotes Dreieck). Der komplementäre Rückwärts-Primer bindet außerhalb der Homologieregion (schwarzes Dreieck). Nur korrekt insertierte Template-DNA kann amplifiziert werden. Mitte: Klone ZF37-H2 und –H4 generierten das korrekte PCR-Produkt. Unten: Western-Blot-Analysen zeigen keine Expression von ChR1 in H2 und H4. (B) Deletions-Template:

Schematische Darstellung des Deletions-Templates (oben). Angegeben ist die Homologieregion (geschlossene Pfeile) 5´und 3´der ZFN-Zielsequenz. Insertion der Donor-DNA führt zu einer 227bp Deletion in COP3. Generierte PCR-Produkte sind daher verkürzt. Mitte: Klon 6E zeigt die erwartete verkürzte COP3-Sequenz. Klon 8B zeigt eine unspezifische Integration von ca.

200bp. Western-Blot-Analysen zeigen keine Expression von ChR1 in 6E und 8B.

Für die Detektion der korrekten Template-DNA Integration in das Zielgen mittels PCR wurde die 3´ homologe Sequenz des „Insertions-Templates“ auf 700 bp verkürzt. Diese Verkürzung der Homologie war nötig um eine verlässliche Detektion mittels PCR zu erlauben. Bei derartigen Analysen werden meist sogenannte „pooling“-Strategien benutzt, das heißt man analysiert keine Einzelkolonien, sondern kombiniert mehrere Klone, um einen höheren Durchsatz zu ermöglichen. Für die Detektion von Deletionsmutanten mittels PCR konnte aber kein „Pooling“

verwendet werden, da die Gefahr einer durch Amplifikation der möglicherweise nicht-homolog

den COP3-Locus integriert und exprimierten kein funktionales ChR1-Protein mehr. Beruhend auf demselben PCR-basierenden Analyseprinzip wurde von Dr. Sizova ein „Deletions-Template“

hergestellt, um eine 227 bp Sequenz aus dem COP3-Gen zu entfernen. Auch dies führte mit derselben Häufigkeit von 1% zu einer Ausschaltung des COP3-Gens (Abbildung 20 B, ZF37-7G + ZF37-8B). Somit konnte gezeigt werden, dass es zumindest in dem Chlamydomonas-Stamm CW15-302 mittels Zinkfinger-Nukleasen möglich ist, sowohl Insertionen als auch Deletionen in einem Zielgen zu erzeugen.

Tabelle 2 Mutationen

Übersicht der induzierten Änderungen des COP3-Gens in Chlamydomonas.

Versuche, diesen Ansatz auch in motilen Stämmen durchzuführen, werden im nächsten Kapitel besprochen.