Konstitutive Expression von Cas9

Zu Beginn der Versuche mit Cas9 wurde versucht, einen Modellstamm zu generieren, der konstitutiv die Cas9-Nuklease exprimiert. Die Generierung eines solchen Stammes hätte den Vorteil, dass in weiteren Experimenten lediglich die Transformation einer gRNA und möglicherweise eines Insertions/Deletions-Templates erforderlich wäre. Zudem ermöglicht es, verschieden Gene mittels dieses Expressionstammes als Ziele zu verwenden. Für die Expression von Cas9 wurde die von Le Cong et. al (Cong et al., 2013) publizierte Proteinsequenz in eine Chlamydomonas codon-optimierte (Genscript) DNA-Sequenz übersetzt. Zusätzlich zur Sequenz von Cas9 enthielt die Sequenz und C-terminal eine Kernlokalisationssequenz (NLS), am N-Terminus folgt dem NLS eine 3-fache FLAG-Tag Sequenz.

Da das Klonieren der Cas9 Sequenz in den Expressionsvektor pIS105-Arg7 nicht realisierbar war, vermutlich aufgrund einer zu großen Gesamtgröße des Plasmides von 14 kbp, wurde die Cas9 Sequenz zuerst in pIS105 hinter den HR-Promoter kloniert, um später mit pUC7.8 (Arg7) cotransformiert zu werden. Kolonien aus diesen Experimenten wurden in Mikrotiterplatten kultiviert und dann anhand von Western Blot Analysen charakterisiert. Leider konnte in keinem der analysierten Klone ein Signal des anti-Flag Antikörpers detektiert werden (Abbildung 30 A).

Das verwendete Antiserum verursacht unspezifische Signale und das Fehlen einer Positivkontrolle erschwerte das Auswerten der detektierten Signale. Da in keinem der analysierten Klone ein Signal des anti-Flag Antikörpers detektiert werden konnte, wurde diese Strategie nicht weiter verfolgt.

Die nächste Versuchsreihe beruht auf den Erfahrungen mit der Arbeit zur Verbesserung des Modellsystems (3.2.1). Die vorherigen Experimente verhalfen nicht zur gewünschten Vorauswahl möglicher positiver Kolonien. Die Cotransformation mit Arg7 erlaubt auch keinen Rückschluss über ein mögliches Expressionlevel des cotransformierten Cas9-Konstruktes.

Aus diesem Grund wurde auf das _Crble_Cryfp-p2a-Konstrukt zurückgegriffen. Im Falle der Modellkassetten gelang es, durch die Verwendung dieses Konstruktes eine einfach Vorselektion am Mikroskop durchzuführen, da das BLE:YFP einfach im Kern detektiert werden kann. Das darauf folgende inaktivierte aphVIII wurde in diesem Fall durch die Cas9-Nuklease ersetzt. Zwar konnten mit dem _Crble_Cryfp-Spacer-Konstrukt mehr Klone generiert werden, es war jedoch nicht bekannt, ob ein großes N-terminales Fusionsprotein (BLE:YFP) die Cas9-Aktivität inhibieren

möglicherweise schwer zu exprimierendes Protein darstellt, weshalb auch die Detektion per Western-Blot problematisch sein könnte, wurde in diesem Ansatz auch ein möglicher funktionaler Assay angestrebt. Die weiteren Arbeiten zielten darauf, in einem ersten Schritt PsaD::BY2C in C. reinhardtii zu tranformieren und Klone durch YFP-Fluoreszenz zu selektionieren, die möglicherweise ebenfalls die Cas9-Nuklease exprimieren. Im zweiten Schritt sollte dann durch Transformation dieser Klone mit einer gRNA gegen die YFP-Sequenz die Fluoreszenz wieder abgeschalten werden. Dieser Ansatz birgt den Vorteil, dass die Expression der Cas9-Nuklease nach erfolgter Mutation im YFP dadurch gestoppt würde. Somit könnte ein möglicher mutagener Langzeiteffekt durch simultane Expression von gRNA und Cas9 verhindert werden.

Abbildung 30 Analysen der heterologen Expression von Cas9 in C. reinhardtii

(A) Western-Blot-Analyse (Falschfarben-Darstellung): Fluoreszierende Kolonien des Stammes CW3403 nach Transformation mit pBY2C. Für die Detektion des BLE:YFP-P2A-Fragments wurde ein Anti-^ShBLE-Antiserum (Rabbit; 1:2000) verwendet. Für eine

Nach erfolgreicher Transformation von Stamm CW3403 mit dem Plasmid pBY2C konnten, wie erhofft, Klone anhand ihres Fluoreszenzsignals vorselektiert werden. Western-Blot-Analysen dieser Klone (Abbildung 30 A, Exemplarisch) zeigten ein starkes Signal des BLE:YFP-Fusionsproteins bei 36 kDa (grün). Ein 3xFLAG-Cas9 Signal wäre bei ca.150 kDa zu erwarten gewesen. Hierbei konnte in keinem der vorselektierten Klone ein spezifisches Signal detektiert werden.

Da durchaus eine sehr geringe Menge an Cas9 für die Deletionsexperimente ausreichend sein kann, wurden acht der vorselektionierten Stämme mit C1::gYFP transformiert. Von jedem dieser Stämme wurden 48 der erhaltenen Kolonien gepickt und in Mikrotiterplatten kultiviert. Erste mikroskopische Analysen zeigten in etwa 10% der Klone ein vollkommenes Fehlen der Fluoreszenz. Etwa weitere 10-15% zeigten ein Mosaikverhalten, also eine graduelle Abnahme der Fluoreszenz innerhalb des selektierten Stammes. Wie sich später zeigte, war dies allerdings in den untransformierten Modellstämmen nach 4 Wochen ebenfalls zu sehen (Abbildung 30, rechts). Es wurden einige der Stämme, welche mit C1::gYFP transformiert wurden und überhaupt keine Fluoreszenz mehr zeigten weiter analysiert. Auf zuvor extrahierter genomischer DNA wurde die Sequenz des _Cryfp amplifziert und die erhaltenen Fragmente anschließend sequenziert. Die Auswertung der Sequenzierergebnisse ergab keine induzierte Mutation innerhalb der Zielsequenz. Infolgedessen lässt sich der Verlust des Fluoreszenzsignals auf epigenetisches Silencing zurückführen.

Aufgrund der bisher erfolglosen Versuche, ein Fusionsprotein mit integriertem P2A-Peptid zu exprimieren, wurde in einem weiteren Versuch eine direkte Fusion des BLE-Markers mit Cas9 angestrebt. Während der Arbeiten am Modellsystem und der in diesem Zusammenhang erfolgten Codon-Optimierung des ^Shble-Markers konnten gute Ergebnisse mit der _Crble-Version erzielt werden. Die Cas9-Sequenz wurde 3´an das optimierte Crble eingefügt und das erhaltene Plasmid p_Crble:Cas9 in Stamm CW15-302 transformiert. In einem ersten Screening mittels Western-Blot-Analysen konnte in 9 von 40 Klonen ein Signal detektiert werden, welches dem zu erwartenden Molekulargewicht von 185 kDa des Fusionsproteins entsprach. In einer weiteren PAGE-Analyse und dem darauf folgenden Western-Blot konnten mit dem verwendeten anti-^Sh BLE-Antiserum Banden detektiert werden, welche dem berechneten Molekulargewicht entsprachen.

Für weitere Analysen und Experimenten mit gRNAs wurden die Klone 3, 5, 6 und 8 ausgewählt.

Das aus Klon 3 detektierte Signal des Fusionsproteins lag bei etwa 130 kDa und damit etwas unterhalb der erwarteten 185 kDa. Da aber durch post-translationale Modifikationen, wie Phosphorylierungen oder Glycosylierungen, ein verändertes Laufverhalten während der PAGE auftreten kann, sollte auch dieser Klon im Weiteren verwendet werden. Das Bandenmuster der

ungewöhlich ist, daher finden auch mit diesen Stämmen weiterführende Experimente statt. Klon 6 zeigte das stärkste Signal bei dieser Analyse, wobei das detektierte Signal dem berechneten Molekulargewicht entspricht. Die hier beschriebenen Expressionsversuche fanden zum Ende der Laborarbeiten statt, die im Folgenden beschriebenen Arbeiten fanden daher zu einem früheren Zeitpunkt statt.