Phototropin reguliert die Expression von LHCSR3

Die im Folgenden vorgestellten Experimente wurden von Dr. Dimtris Petrousos durchgeführt.

Grundlage seiner Experimente bildeten komplementierte Stämme, welche im Rahmen dieser Arbeit hergestellt worden sind. Die Komplemtierungen erfolgten in dem von Boris Zorin hergestellten Phototropin-Deletionsstamm ΔPHOT^G5 (Zorin et al., 2009).

Photosynthetische Organismen konvertieren Lichtenergie zu organischen Verbindungen durch stetige Produktion von NADPH und ATP, welche dann im Benson-Calvin Zyklus für die CO2-Assimilation verwendet werden (Allen, 2002). Die Endprodukte des Calvin-Zyklus, organische Zuckerverbindungen, dienen nun zum einen als Substrate für die Atmungskette, um Energie zu produzieren, und zum anderen als Intermediate für organische Verbindungen, welche für das Zellwachstum benötigt werden.

Häufig übersteigt jedoch das absorbierte Licht die Kapazitäten des Photosynthese-Apparates der Zellen. Die Zelle hat einen Mechanismus entwickelt, um sich vor überschüssiger Lichtenergie zu schützen (Li et al., 2009). Einer der Hauptwege der Photoprotektion in Algen ist die thermische Dissipation der überschüssigen Lichtenergie, welche als qE bezeichnet wird und eine Komponente der Nicht-Photochemischen Löschung oder „Quenchings“ darstellt. qE benötigt das bei hohen Lichtintensitäten exprimierte Proteine LHCSR3, welches eine Bestandteil des Lichtsammelkomplexes in Algen ist (Peers et al., 2009), sowie einen elektrochemischen Protonengradienten an der Thylakoidmembran (Tolleter et al., 2011). Hierbei wird die Expression von LHCSR3 durch Calcium und das Calcium-Bindeprotein CAS reguliert (Petroutsos et al., 2011).

Aufgrund der lichtabhängigen Expression von LHCSR3 sollte in dieser Kollaboration festgestellt werden, ob eine Verbindung zwischen Lichtabsorption und Photoprotektion besteht.

Der erste Schritt zur Untersuchung einer möglichen chromatischen Regulation des NPQ und LHCSR3 bestand darin, das Aktionspektrum des NPQ zu bestimmen. Dazu wurden Messungen am „Okazaki Large Spectrograph (OLS)“ durchgeführt (Dr. Dimitris Petroutsos). Das OLS ist der größte Spektrograph weltweit. Das Instrument wird mit einer 30kW Xenon-Bogenlampe betrieben und projiziert ein Wellenlängenspektrum von 250nm bis 1000nm auf einen 10m umfassenden Bogen. Dabei wird in der Fokusebene eine Lichtstärke von bis zu 2000 µE m-2 s-1

Chlamydomonas Kulturen des Wildtypstammes 137C und einer Photoprotektiven-Mutante (npq4) wurden mit dem OLS für 4 Stunden bei einer Lichtstärke von 250 µE m-2 s-1 belichtet. Dabei wurden die Wellenlängen des sichtbaren Lichtes untersucht (Dr. Dimitris Petroutsos). Ziel des Experimentes war es, die Wellenlängenabhängigkeit der lichtinduzierten Expression des LHCSR3 Proteins zu testen, welches für die Induzierung des qE in Algen verantwortlich ist. Wie bereits erwähnt, wird dieses Protein in Chlamydomonas nur bei hohen Lichtintensitäten exprimiert.

Abbildung 40 Chlamydomonas Phototropin reguliert die LHCSR3 Expression

(A) NPQ-Aktionspektrum eines Wildtypstammes (137C) und einer ΔLHCSR3-Mutante (npq4). NPQ wurde berechnet aus (Fm-Fm')/Fm, wobei Fm die maximale Fluoreszenz-Emission der Probe im Dunkeln ist. Fm' ist der Fm-Wert nach Belichtung mit hoher Lichtintensität. Western-Blot-Analysen der LHCSR3-Akkumulation im Wildtyp. (B) NPQ-Aktionsspektrum und Wellenlängen abhängige LHCSR3-Expression des Wildtypstammes und der aCRY- und PHOT-Mutanten (ΔPHOTG5 und ΔaCRY).

(C) Lichtintensitätsabhängigkeit der LHCSR3 Expression in ΔPHOTG5 und dem Parentalstamm CW15-302. Western-Blot-Analysen der Rohextrakte nach 4 Stunden Belichtung bei niedrigen (LL; 20 µE m-2 s-1) und hohen (HL; 250 µE m-2 s-1) Lichtintensitäten. (D) Kulturen der Wildtyp-, Deletions- und Komplementationsstämme wurden unter Schwachlicht (20 µE m-2 s-1) und dann für 4 Stunden unter hoher Lichtintensität (250 µE m-2 s-1) kultiviert. Verändert nach: Dr. Dimitris Petrousos;

unveröffentlichte Resultate.

Diese Ergebnisse führten zu der Hypothese, dass möglicherweise ein Blaulichtrezeptor an der Induktion der Expression von LHCSR3 beteiligt sein könnte. Um dies zu überprüfen, wurden zwei bekannte Blaulichtrezeptor-Mutanten getest. Dabei handelte es sich um eine Cryptochrom-Mutante (ΔaCRY - animal-like cryptochrome) (Beel et al., 2012) und um eine Phototropin-Cryptochrom-Mutante (∆PHOT^G5) (Zorin et al., 2009), beides funktional wichtige Blaulichtrezeptoren.

Die beiden Mutanten wurden mit demselben experimentellen Aufbau wie der Wildtypstamm 137C untersucht. Dabei konnten in der ΔaCRY -Mutante vergleichbare NPQ-Level und spektrale Eigenschaften gemessen werden wie im Wildtypstamm (Abbildung 40 B). Hingegen zeigte sich in der ΔPHOT-Mutante eine dramatische Abnahme des NPQ im blauen Spektrum des Lichtes, was eine direkte Abhängigkeit der LHCSR3 Expression von Phototropin wiedergibt.

Die Abhängigkeit der Induktion von LHCSR3 und des NPQ konnte auch in unabhängigen Experimenten im Weißlicht wiederholt und bestätigt werden (Abbildung 40 C).

Wie in der Einleitung beschrieben, besteht Phototropin aus zwei funktionalen Einheiten, einer N-terminalen Photorezeptordomäne (LOV1+LOV2) und einer C-N-terminalen Kinasedomäne. Um nun herauszufinden, welche dieser Domänen für die Signaltransduktion eine Rolle spielt, wurden verschiedene Phototropin-Komplementierungsmutanten getestet.

Im Folgenden werden die generierten Stämme des Volllängen-Phototropins als

„Stammname_PHOT“ bezeichnet. Analog, wenn nur die LOV1+LOV2-Domänen exprimiert werden

„Stammname_L1+L2“ und im Falle der Kinase-Domäne „Stammname_KIN“. Wird eine funktionale Domäne durch Mutagenese inaktiviert, so ist dies als durchgestrichene Bezeichnung markiert (L1+L2; KIN). Eine Übersicht aller hergestellten und im Weiteren verwendeten Konstrukte ist im nächsten Kapitel in Abbildung 42 A gegeben. Dabei diente Plasmid (pLY-A) als Vorlage für die im Weiteren erstellten Expressionskonstrukte, welches von Yinghong Lu im Rahmen seiner Doktorarbeit hergestellt wurde. Für die Selektion und eine verbesserte Expression verwendete er die PHOT cDNA-Sequenz als Fusions mit einem 5´ angefügten ^ShBLE-Resistenzgen (Lu, 2006). Alle Konstrukte und Stämme wurden vor Ihrer Verwendung mittels Western-Blot-Analysen auf die korrekte Expression überprüft. Dazu wurden entweder Antikörper gegen den N-terminalen BLE-Marker (Anti-^ShBLE, Invivogen) oder falls im Konstrukt vorhanden, gegen die LOV1-Domäne (Anti-LOV1), eingesetzt.

Für die Analysen wurden verschiedene Konstrukte in der PHOT-Mutante (∆PHOT^G5) überexprimiert und als Kontrolle Volllängen-Phototropin verwendet (∆PHOT^G5_PHOT). Es wurden ferner Stämme generiert, welche entweder nur LOV1+LOV2 (∆PHOT^G5-L1+L2) oder nur die C-terminale

Kinasedomäne 125_KIN) in einem Wildtypstamm mit normalen Leveln an Phototropin (CC-125). Nach der Kultivierung der Wildtypstämme sowie der komplementierten Stämme für 4 Stunden bei starker Lichtintensität (250 µE m-2 s-1) fand die Analyse derExpression von LHCSR3 mittels Wester-Blot-Analysen statt. Das Proteinlevel von LHCSR3 im Stamm ∆PHOT^G5_L1+L2 war niedriger als im WT-Parentalstamm, der Stamm ∆PHOT^G5_KIN zeigte hingegen ein höheres Level an detektiertem LHCSR3 (Abbildung 40 D). Zusammengefasst lassen diese Ergebnisse auf eine Regulation von LHCSR3 durch die Phototropin-Kinasedomäne schließen.