1. Einleitung
3.5 Diurnale Photorezeptor-mRNA Transkription
Die in diesem Kapitel behandelten Datensätze zu diurnalen Expression der Photorezeptor mRNA, wurden von der Arbeitsgruppe Merchant (UCLA) bereitgestellt. Im Rahmen eines Projektes sollten Änderungen der mRNA-Level während des Tag-Nacht-Zyklus analysiert werden. Dazu wurde eine Chlamydomonas-Kultur synchronisiert und über einen Zeitraum von 48h stündlich Proben genommen. Nach Extraktion konnte die Gesamt-RNA diese in cDNA übersetzt werden, um so eine Analyse durch Illumina-Sequenzierung zu ermöglichen. Diese als RNA-Seq bezeichnete Technik ist ein Hochdurchsatzverfahren zur Analyse des Transkriptoms einer Zelle oder einer Zellpopulation. Die Anzahl der erhaltenen Sequenzen (Reads) einer mRNA geben dabei Aufschluss über die vorliegende Transkriptmenge. Um einen Vergleich der erhaltenen Sequenzdaten zu ermöglichen, wird der Datensatz normalisiert. Dabei werden verschiedene Faktoren eines experimentellen Ansatzes berücksichtigt. Zum einen die Länge einer betrachteten mRNA und zum anderen die Anzahl der erfolgten Reads und die Gesamtzahl der im Experiment erhaltenen Reads. Diese als RPKM (reads per kilobase of exon model per million mapped reads) bezeichnete Methode der Normalisierung ermöglicht sowohl einen Datenvergleich innerhalb
eines Experimentes als auch den Vergleich von Experimenten unter verschiedenen Versuchbedingungen (Mortazavi et al., 2008).
Es ist anzumerken, dass die Versuchbedingungen im Experiment nicht exakt den physiologischen Bedingungen entsprechen. Der Übergang vom Tag- in den Nacht-Zustand und umgekehrt wurde durch An- bzw. Abschalten der Beleuchtung in einem Inkubator simuliert. Auch die verwendete gleichbleibende Lichtintensität entspricht nicht dem natürlichen Tageslauf.
In Abbildung 38 ist eine Übersicht der RPKM normalisierten RNA-Seq-Daten aller Photorezeptoren gegeben. Dies soll zunächst dazu einem Vergleich der Photorezeptoren untereinander dienen, bevor dann die einzelnen Kategorien verglichen werden. Gezeigt ist der komplette Datensatz, welcher zwei Tag-Nacht-Zyklen umfasst. Eine allgemeine Tendenz der Photorezeptor-Transkriptmenge ist die Akkumulation während der Dunkelphase. Mit Beginn der Lichtphase kommt es zu einem starken Abfall der Transkriptmenge, die Ausprägung ist dabei unterschiedlich. Das höchste Level an Transkripten zeigen COP1/2, COP3 (ChR1) und Phototropin.
Im Vergleich ist die Menge an Transkripten der Histidinkinase-Rhodopsine eher niedrig. COP1/2 zeigt nicht nur das höchste Level an Transkripten (RPKMMAX = 444), sondern auch einen ungewöhnlichen Kurvenverlauf. Nach Applikation von Licht kommt es zu einem starken Abfall der Transkriptmenge. Dies wird jedoch innerhalb von 3 bis 4 Stunden im Licht umgekehrt, so dass das Transkriptlevel wieder den Ausgangswert vor Belichtung erreicht. Anschließend sinkt das Niveau wieder auf ungefähr 25% des Maximalwertes, um dann in der Dunkelphase wieder anzusteigen.
Die beiden Kanalrhodopsine 1+2 (COP3 + COP4) zeigen eine unerwartet große Differenz der gemessenen Transkriptmenge. Wie bei allen anderen Photorezeptoren, wird auch hier das Maximum an Reads am Ende der DP erreicht. Jedoch zeigt COP3 ein fünfmal höheres Transkriptlevel (RPKMMAX = 312) als COP4 (RPKMMAX = 63). Auch die Kanalrhodopsine unterliegen einer starken Reduktion der Transkriptmenge mit Beginn der Lichtphase (Abbildung 39 A). Der Kurvenverlauf von COP3 ist dabei sehr interessant, da mehrere lichtabhängige Prozesse zu beobachten sind. Innerhalb der ersten 30 Minuten der Dunkelphase (L12-D0.5) gibt es einen sprunghaften Anstieg der RPKM-Werte. Dies deutet auf eine lichtabhängige Derepression der Transkription von COP3 hin. Diesem kurzen Anstieg folgt eine Phase des kontinuierlichen Anstiegs bis zum Erreichen von D10. Zwischen D10 und D12 erhöht sich der RPKM-Wert um fast das Doppelte, anschließend sinkt er innerhalb einer Stunde fast auf Nullniveau. Es können hier also zwei lichtabhängige Regulationsebenen erkannt werden, eine Ebene zu Beginn und Ende der Lichtphase sowie eine lichtunabhängige Ebene zwischen D10 und D12. Diese experimentellen Daten passen sehr gut zu den biochemischen Expressiondaten der ChR1-Proteinmenge (siehe Kapitel 3.6.2.5) im Phototropin-Deletionsstamm ΔPHOTG5. Dieser zeigte deutlich einen Verlust des Licht- und Phototropin-abhängigen Abbaus von ChR1. Es konnte jedoch auch eine Phototropin unabhängige Reduktion an ChR1 detektiert werden. Eine mögliche Erklärung ist die Regulation durch Komponenten der Circadian Uhr. In Versuchen zur Analyse von aCRY Interaktionspartnern wurden auch Peptide aus PHOT detektiert (Prager, 2012).
Die Daten der Histdinkinase-Rhodopsine zeigen eine wesentlich geringere Menge an Transkripten. Die RPKMMAX –Werte liegen zwischen 7 und 42. COP5 mit einem Wert von 42 weist zudem im Laufe der Lichtphase einen geringen Anstieg der Transkriptmenge auf, ähnlich dem Verlauf von COP1/2 (Abbildung 39 B). Auch die Histidinkinase-Rhodopsine zeigen einen lichtunabhängigen Anstieg der Werte am Ende der Dunkelphase (D7 – D11). Interessant ist, dass bis auf COP9/10, alle Transkriptmengen der Histidinkinase-Rhodopsine ihr Maximum etwa 1 Stunde vor Beginn der Lichtphase (D11) erreichen, diese aber bis D12 wieder absinken. Daraus lässt sich schließen, dass die Regulation der Transkriptmengen nicht lichtabhängig verläuft, sondern könnte ebenfalls durch die circadian Uhr reguliert werden.
Der RPKMMAX von Phototropin liegt bei 170 und ist somit der dritt höchste nach COP1/2 und COP3.
Als einziger Photorezeptor nimmt die Transkriptmenge von PHOT im Verlauf der Lichtphase eher kontinuierlich ab, es kommt auch nicht zu dem sonst charakteristischen Knick im Verlauf zu Beginn der Lichtphase. aCRY hat insgesamt ein sehr niedriges Expressionsniveau mit RPKMMAX = 10, welches sich auch im Verlauf des Tag-Nacht-Zyklus nur geringfügig ändert. Im Gegensatz dazu weist pCRY einen deutlich höheren RPKMMAX von 85 auf und zeigt den typischen
Photorezeptor-Abbildung 39 Diurnale Änderung der Photorezeptor mRNA
(A) Auswertung der RPKM-Werte für COP3 und COP4. Die Dunkelphasen sind grau hinterlegt. Die Beschriftung der X-Achse