Biochemische Methoden

5.2.1 Bestimmung von Proteinkonzentrationen

Für die Bestimmung von Protein-Konzentrationen aus Zellextrakten von E.coli- oder C. reinhardtii-Kulturen wurde das BIO-RAID DC Protein AssayTM (BIO-RAID. Hercules, USA) nach Angaben des Herstellers verwendet. Durch photometrische Messungen (Beckman Coulter, DU 530) der Absorption bei 650- 750 nm konnte die Konzentrationsbestimmung der Proteine erfolgen. Dazu wurde eine Standardkurve mit BSA (Bovines Serum Albumin) erstellt. Das BIO-RAID DC Protein Assay^TM ist nicht für SDS- oder DTT- haltige Lösungen geeignet. Daher wurde in solchen Fällen eine photometrische Messung mit Amido-Black (Popov et al., 1975) gefärbten Proteinen durchgeführt.

5.2.2 Polyacrylamid Gel Elektrophorese (PAGE)

Bei Analysen für die Selektion von positiven C. reinhardtii Transformanten wurden 200 μl

Flüssigkultur aus 96-well Mikrotiterplatten pelletiert (13200 rpm / 1 min; Eppendorf Microcentrifuge 5420) und der Überstand verworfen. Zellwandhaltige Stämme wurde in 15-30 μl SBA-Puffer (0,1 M Na₂CO₃, 0,1 M DTT) resuspendiert. Nach Zugabe von 20 μl SBB-Puffer (30%

Sucrose, 5% SDS) wurde die Zellsuspension für 30 min auf höchster Stufe gevortext. Durch mehrfaches Einfrieren bei -80° Celsius und anschließendem Auftauen, konnte bei Bedarf eine verbesserte Zelllyse erreicht werden. Für die anschließende Beladung der Polyacrylamid-Gele wurde den Proben 5 μl 4x SDS Probenpuffer (Laemmli, 1970) zugegeben und die Probe für 5 Minuten im Wasserbad bei 100°C inkubiert. Zellwandlose-Stämme wurden direkt in 4x SDS-Probenpuffer resuspendiert und für 5 min bei 95°C gekocht. Durch erneute Zentrifugation konnte das Zelldebris entfernt werden. Die Beladung der Gele erfolgte mit 15 μl der Proben.

Die SDS-Gelelektrophorese (Schägger, 1994) wurde mit 8-15% Polyacrylamid-Gelen durchgeführt.

Tabelle 5 Puffer SDS-PAGE

5.2.3 Comassie Brillant Blau Färbung

Nach dem elektrophoretischen Trennvorgang wurde das Gel gestoppt und in die Coomassie-Färbelösung gegeben. Als Farbstoff diente Coomassie-Brillant-Blue R250 das in Methanol oder

5.2.4 Western-Blot-Analysen

Für die Immunodetektion von spezifischen Proteinbanden mit Antikörpern wurden die Polyacrylamid-Gele nach der SDS-PAGE mit einem Semi-Dry-Blotter auf Nitrocellulose-Membranen (Hybond™-C Extra 0,45 μm Porengröße, Fa. Amersham, Piscataway, NJ, USA) übertragen (2 mA/cm² Membranfläche, 15V, 45 min).

5.2.5 Ponceau-S Färbung

Für die Überprüfung des erfolgten Transfers der Proteine auf die Nitrocellulose-Membran wurde der Blot anschließend mit Ponceau-S-Lösung gefärbt. Ponceau-S färbt reversible alle vorhandenen Proteine. Speziell für die Beurteilung möglicher Deletionsmutanten ist es wichtig die Beladung einzelner Spuren beurteilen zu können.

5.2.6 Immunologische Proteindetektion

Die mit Ponceau-S gefärbten Membranen wurden in Blockierpuffer (PBS-Puffer + 0,1% Tween20 + 5% Magermilchpulver) bei Raumtemperatur entfärbt. Die im Blockierpuffer enthaltenen Milchproteine blockieren Bindungsstellen der Membran, an die Antikörper unspezifisch binden könnten. Primäre Antikörper wurden in frischem Blockierpuffer oder PBS-T in Verdünnungen von 1:500 bis 1:10000 verwendet. Als primäre Antikörper für Analysen wurden verwendet: (1) Anti- ChR1 C-terminus (aufgereinigt, 1:10 000); (2) Anti-^ShBLE (1:2000); Anti-LOV1 (1:2000). Als sekundäre Antikörper wurden Anti-Rabbit IgG oder Anti-Mouse IgG Antikörper aus der Ziege verwendet. Konjugate der Antikörper waren hierbei entweder alkalische Phosphatase (AP) (Firma Pierce, Rockford, USA), IRDye800 oder IRDye700 (Fa. Licor). Die Blotting-Membranen wurden über Nacht mit den in Blockierpuffer verdünnten primären Antikörpern inkubiert. Danach folgten drei Waschschritte in PBS-T (3x 10 min; PBS-Puffer + 0,1% Tween20). Anschließend wurden die Membranen mit den sekundären Antikörpern (1:2000) für mindestens zwei Stunden hybridisiert.

Darauf folgten vier Waschschritte (1x 15 min, 3x 5 min) in PBS-T.

5.2.7 Zellkultur und Medien

C. reinhardtii-Kulturen wurden in einem sterilen Glaskolben in TAP-Medium kultiviert (Hoober, 1989). Dies geschah unter Schütteln (180rpm) entweder im Dauerlicht oder in einem 12h / 12h Tag-Nacht-Zyklus (25W/m²).

Tabelle 6 Tris-Acetat-Phosphat-Medium

5.2.8 Transformation von C. reinhardtii

Für die Transformation von C. reinhardtii wurde vorwiegend die Glasperlenmethode angewandt (Kindle, 1990). Dazu wurden vegetative Zellen bei einer Dichte von 2x10⁶ bis 7x10⁶ Zellen/ml in

einprozentiger Triton-X-100-Lösung versetzt. Nach erfolgreichem Abbau der Zellwand lysieren die Zellen auf dem Objektträger nach fünf Minuten. Durch erneute Zentrifugation (900g, RT) wurden die Zellen pelletiert und mit TAP-Medium für die Transformation auf eine Zelldichte von 3x10⁸ Zellen/ml eingestellt. 300 μl der Zellsuspension wurden dann zu 0,3 g sterilen Glasperlen (Ø 45 μm) in einem 2 ml Reagenzgefäß gegeben. Nach Zugabe von DNA erfolgte das Vortexen bei voller Leistung (Heidolp Vortex, Typ 54117, 2400 UpM). Anschließend wurden die Zellen in einen 100 ml Erlenmeyerkolben mit 50 ml TAP überführt und über Nacht bei kontinuierlichem Licht (25W/m²) und 25° Celsius inkubiert. Dies dient dazu, den Zellen genügend Zeit zur Regeneration und Expression des Resistenzgens zu geben. Am nächsten Tag wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 900g für fünf Minuten pelletiert. Das Pellet wurde vorsichtig in TAP Medium aufgenommen und auf 1% TAP-Agar-Platten mit dem entsprechenden Antibiotikum ausplattiert. Anschließend wurden die Platten bei kontinuierlichem Dauerlicht (25W/m²) und 25° Celsius für 6-15 Tage inkubiert, bis die ersten Kolonien sichtbar wurden.

5.2.9 Isolation genomischer DNA aus C. reinhardtii

Für die Isolation genomischer DNA aus C. reinhardtii wurde das Nucleospin^® Plant II Kit der Firma Macherey Nagel nach Angaben des Herstellers verwendet. Für die schnelle Analyse von kürzeren Fragementen (< 700bp) wurde die von Cao et al. (2009) beschrieben Methode der Kolonie-PCR verwendet (5%-Chelex).

5.2.10 Phototaxis Assay

Für die Bestimmung des phototaktischen Verhaltens wurden Lichtstreumessungen nach der von Schaller et al. (Schaller et al., 1997) beschriebenen Methode durchgeführt. Stamm CC-806 welcher nur negative Phototaxis zeigt, wurde dabei als Referenz verwendet. Um eine gleichmäßige phototaktische Antwort zu erhalten wurden die zu analysierenden Kulturen auf Stickstofffreies Medium (NMM- Nitrogen Minimal Media) gesetzt und über Nacht im Licht geschüttelt. In Vorversuchen zur Analyse der Phototropin-Überexpressionsstämme wurde überprüft, ob die Ionenzusammensetzung des Mediums sich unterschiedlich auf die Stämme auswirkt. Im Standardmedium, dass 10mM K⁺ enthält konnte kein signifikanter Unterschied der Stämme CC-125 und CC-CC-125_KIN erkannt werden. Jedoch zeigten sich Unterschiede wenn kein zusätzliches Kalium dem Medium zugegeben wurde. CC-125_KIN zeigt stärkere Signale, wohingegen CC-125 eine zeitabhängige Abnahme der Signalstärke zeigte. Diese Abnahme war zu erwarten, da Kalium für die Repolarisation der Zellmembran benötigt wird (Govorunova et al., 1997). Aufgrund dieses

Vergleich mit zuvor durchgeführten elektrophysiologischen Messungen, wurden die Kulturen vor den Messungen in 10 mM HEPES, 81 µM MgSO₄ und 100 µM CaCl₂ bei pH 6.0 überführt. Licht-/

Dunkeladaptation wurde durch aufteilen der Kultur in zwei Kolben erreicht, wobei einer der Kolben mit Aluminiumfolie umwickelt wurde. Für die Dunkeladaptation wurden die Zellen mindestens eine Stunde inkubiert. Als Reizlicht kamen in den Lichtstreumessungen LED´s folgender Wellenlängen zu Einsatz: 405nm (150 µmol Photonen m^-2/s^-1) und 470 nm (20 µmol Photonen m^-2/s^-1)