Zellkultur

NIH 3T3: murine Fibroblasten Zelllinie ATCC

NIH 3T3 : murine Fibroblasten Zelllinie AG Elsässer

BJ: humane diploide Vorhautfibroblasten Zelllinie

ATCC

HDF: humane primäre dermale Fibroblasten aus der

Haut gesunder Spender isoliert

Die Zellen wurden von der Beiersdorf AG Hamburg zur Verfügung gestellt

2.3.7.1 Kultivierung adhärenter Zellen

NIH 3T3 und primäre Fibroblasten wurden in DMEM (Dulbeco’s modified Eagle’s Medium, Invitrogen), das zusätzlich 10% FCS (PAA), 1% N-Acetyl-N-Alanyl-L-Glutamin (Seromed) sowie 0,6% Gentamicin (PAA) enthielt, kultiviert. Für die Anzucht von BJ-Zellen wurde MEM (Invítrogen) anstatt DMEM mit den oben angegebenen Zusätzen verwendet. Die Inkubation der Zellen erfolgte bei 37°C in einer wassergesättigten Atmosphäre mit zusätzlich 5% CO2. Die Zellen wurden bei einer Konfluenz von ca. 80%

passagiert und dabei in einem Splitverhältnis von 1:3 bis 1:10 verdünnt. Hierzu wurde das verbrauchte Medium abgesaugt, die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend mit 0,05% Trypsin/ 0,02% EDTA (Sigma) bei 37°C inkubiert. Bei Abrunden der Zellen erfolgte das Abstoppen der proteolytischen Reaktion durch Zugabe von 8 ml vorgewärmtem Medium. Die resuspendierten Zellen wurden durch mehrmaliges auf- und abpipettieren vereinzelt und anschließend in neue Kulturschalen ausgesät.

2.3.7.2 Bestimmung der Zellzahl

Wurde für Experimente eine definierte Zahl von Zellen benötigt, wurden diese in einer Fuchs-Rosenthal-Kammer (Zeiss) ausgezählt. Dazu wurde ein Tropfen der in Medium resuspendierten Zellen mittels einer Pasteurpipette in die Kammer gegeben, die zuvor mit einem Deckglas abgedeckt wurde. Unter dem Phasenkontrastmikroskop wurden

anschließend 16 Kleinstquadrate ausgezählt. Der ermittelte Wert wurde mit 5000 multipliziert und ergab die Zellzahl pro Milliliter.

2.3.7.3 Transiente Transfektion eukaryotischer Zellen durch Lipofektion

Für die Transfektion von Plasmid DNA als auch siRNA wurde das Lipofektionsreagenz Lipofectamine 2000 (Invitrogen) verwendet. Dieses erbrachte im Vergleich zu Oligofectamine (Invitrogen) und Superfect (Qiagen) die höchste Transfektionsrate bei den verwendeten Zellen. Die Transfektion wurde nach den Vorgaben des Herstellers durchgeführt. Hierzu wurden die zu transfizierenden Zellen 24 Stunden vor der Transfektion mit einer Konfluenz von 50% ausgesät. Die verwendeten Mengen an Plasmid-DNA bzw. siRNA sowie an Transfektionsreagenz sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt. Als Kulturmedium und zur Verdünnung der entsprechenden Ansätze wurde DMEM ohne jegliche Zusätze verwendet (DMEM^-).

DNA-Transfektion siRNA-Transfektion

Kultur-gefäß Fläche

Volumen des vorzulegenden

Mediums (DMEM^-)

Volumen des Verdünnungs-mediums (DMEM^-)

Plasmid -DNA

Lipofectamine

2000 siRNA Lipofectamine 2000

6-well 10 cm² 1,5 ml 500 µl 4 µg 4 µl 200

pmol 10 µl

10 cm 60 cm² 12 ml 3 ml 24 µg 30 µl

Die DNA bzw. siRNA sowie das Lipofectamine 2000 wurden in zwei getrennten Ansätzen in der angegebenen Menge DMEM^- verdünnt und 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Anschließend wurden beide Ansätze miteinander vermischt und es erfolgte eine erneute Inkubation über 20 min bei RT. Es wurde die entsprechende Menge DMEM in die Zellkulturschalen vorgelegt und der Transfektionsansatz, der vorher durch zweimaliges Auf- und Abpipettieren gemischt wurde, tropfenweise auf die Zellen gegeben.

Erfolgte die Transfektion mit Plasmid-DNA, wurde das Medium bereits nach 4 Stunden durch serumhaltiges DMEM ersetzt. Nach der Transfektion von siRNA erfolgte der Mediumwechsel erst nach 24 Stunden. Wenn nicht anders angegeben, wurden die Zellen nach 24 Stunden, wie unter Punkt 2.7.1 beschrieben, für die nachfolgenden Analysen weiterverarbeitet.

2.3.7.4 Kontrolle der Transfektionseffizienz von Plasmid-DNA

Um die Transfektionseffizienz von Plasmid-DNA zu überprüfen, wurden die Zellen parallel mit dem Vektor pEGFP-N1 wie unter Punkt 2.6.4 beschrieben transfiziert.

Erfolgt eine Expression des Reporterplasmids, so konnte dies anhand der Grünfluoreszenz mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht und durch Auszählen der prozentuale Anteil positiver Zellen ermittelt werden.

2.3.7.5 Optimierung und Kontrolle der Transfektion von siRNA

Die Optimierung der siRNA Transfektion in Fibroblasten erfolgte mit Hilfe des BLOCK iT Transfection Kit (Invitrogen). Diese enthält ein Fluoreszein-markiertes doppelsträngiges Oligomer, das in seiner Größe, Ladung und Konfiguration einer Standard-siRNA entspricht und für die auf kationischen Lipiden basierende Transfektion von Säugerzellen eingesetzt werden kann. Die Transfektion des Oligomers erfolgte unter Verwendung der verschiedenen Lipofektionsreagenzien nach den jeweiligen Angaben der Hersteller. Das fluoreszierende Oligomer konnte bereits sechs Stunden nach der Transfektion mittels Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen und quantifiziert werden, wobei die Transfektionseffizienz bei Einsatz von Lipofectamine 2000 am höchsten war.

2.3.7.6 Herstellung und Glycierung von Kollagen G-Gelen

Für einige Experimente erfolgte die Kultivierung von Fibroblasten auf Kollagengelen.

Es wurden folgende drei Komponenten in einem Verhältnis von 1:10:1 vorsichtig auf Eis gemischt:

1. 10x DMEM 6,83 g DMEM (Sigma)

1,85 g Na2HPO4 1 g HEPES (Serva)

in 40 ml Aqua dest. lösen, auf 50 ml mit a.d.

ergänzen und sterilfitrieren 2. Kollagen G (Biochrom) 4mg/ml

3. Natriumhydrogencarbonatlösung 140 mM

Die gut gemischte Kollagenlösung wurde durch tropfenweise Zugabe von 1 N NaOH neutralisiert, wobei ein Farbumschlag des pH-Indikators von gelb nach rot erfolgt. Je 1 ml der luftblasenfreien Lösung mit einer Kollagen-Konzentration von 3,2 mg/ml wurde

in 6 cm² Petrischalen (10 ml) bzw. Transwell Inserts (Costar ® Transwell ® Inserts 3,0 µm Porengröße, Corning, 1 ml) gegeben und 1 h bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank inkubiert.

Die gelierten Gele wurden nachfolgend 5 Tage bei 37°C mit 50 mM Glycolaldehyd in PBS glyciert oder mit reinem PBS inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Gele viermal 30 min und einmal über Nacht mit PBS und dreimal 30 min mit DMEM gewaschen. Anschließend wurden Zellen auf die Gele ausgesät und über 5 Tage bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Für die weiteren Analysen mittels Licht- bzw.

Rasterelektronenmikroskopie wurden die Gele entsprechend fixiert.

Die Fixierung für die Lichtmikroskopie erfolgte mit 4% PFA über 1h bei Raumtemperatur. Für die rasterelektronenmikroskopische Auswertung erfolgte das Gießen der Gele und die anschließende Kultivierung von Zellen auf Transwell Inserts (3 µm). Die Fixierung für diese Methode erfolgte nach den Angaben des Herstellers und ist unter Punkt 2.3.2 beschrieben.

2.3.7.7 Herstellung von AGE-BSA

Endotoxinarmes bovines Serumalbumin wurde nach folgendem Protokoll nicht-enzymatisch glykosyliert bzw. glyciert:

10 mg/ml BSA und 1M Glucose wurden zusammen in sterilem PBS gelöst. Als Kontrolle wurde ein entsprechender Ansatz nur mit BSA ohne Glucose hergestellt.

Beide Lösungen wurden anschließend sterilfiltriert und in Glasflaschen abgefüllt. Es erfolgte eine Inkubation bei 50°C über 21 Tage. Nachfolgend wurden die Ansätze viermal über insgesamt 24 Stunden gegen das 10-fache Volumen PBS in einem Dialyseschlauch (Snakeskin, 10.000 MWCO) dialysiert. Die Proteinlösungen wurden mit Hilfe von Zentrifugalkonzentratoren (Vivaspin 20, Vivascience) bei 4000 rpm auf 1/10 Volumen aufkonzentriert und erneut sterilfiltriert. Die BSA- bzw. AGE-BSA-Konzentration wurde mittels BCA-Assay (2.3.9.3.1) nach den Vorgaben des Herstellers bestimmt. Ebenfalls wurde durch den Trinder Assay der Gehalt an Glucose ermittelt (2.3.7.7.1) und Aliquots der Lösung bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert.

Für die Inkubation von Zellen wurden die Proben auf die gewünschte Konzentration gebracht, indem sie mit Vollmedium, welches zuvor 1:1 mit PBS verdünnt wurde, gemischt wurden.

2.3.7.7.1 Bestimmung der Glucosekonzentration

Die Glucosekonzentration wurde mit Hilfe des Glucose Trinder Reagenz von Sigma (Methode Nr. 315) nach den Vorgaben des Herstellers bestimmt. Hierbei wird die

Glucose unter Beteiligung der Glucoseoxidase zu Gluconsäure und Wasserstoffperoxid oxidiert. Das gebildete Wasserstoffperoxid reagiert in Gegenwart von Peroxidase mit 4-Aminoantipyrin und p-Hydroxybenzensulfonat zu einem Qhinonimin-Farbstoff. Die Bildung des Qhinonimin-Farbstoffs mit einem Absorptionsmaximum bei 505 nm kann photometrisch bestimmt werden und ist direkt proportional der Glucosekonzentration in der Probe.

Ein Aliquot der dialysierten Probe wurde entnommen und 1:10 in PBS verdünnt.

Anschließend wurde 1 ml Glucose Trinder, der Raumtemperatur besitzen sollte, in ein Reaktionsgefäß vorgelegt und in bestimmten Zeitabständen mit je 5 µl der verdünnten Proben sowie Glucose-Standardlösungen vermischt. Als Standard wurden verschiedene Verdünnungen aus einer 1 M Glucoselösung in PBS mit Konzentrationen von 0,02 M bis 0,2 M hergestellt. Es erfolgte eine Inkubation der Ansätze für 18 min bei RT. Anschließend wurde die Absorption der Proben bei 505 nm ermittelt, wobei die vorausgegangenen Zeitabstände eingehalten wurden. Im Anschluß wurde die Glucose-Konzentration nach den Angaben des Herstellers berechnet und sollte bei den AGE-Präparationen unter 5 mM liegen.