Morphologische Analyse der Dermis

(Abb. 3.8) Im dermalen Kompartiment fanden sich einige S100-positive Zellen, in denen lichtmikroskopisch jedoch keine Pigmente zu erkennen waren.

Abb. 3.8: In den Altersfleckarealen war keine erhöhte Anzahl S100-positiver Melanozyten nachweisbar. Für die statistische Auswertung wurden die S100⁺ Zellen im Stratum basale ausgezählt und auf die Länge der Basalmembran bezogen. Es ergab sich hierbei kein signifikanter Unterschied im Vergleich der Mediane der Läsionen zu periläsionaler Haut.

Abb. 3.9: Nachweis pigmentierter dermaler Zellen in der läsionalen und der normalen Haut. Der Melaninnachweis durch die Fontana-Masson-Färbung zeigte eine erhöhte Zahl pigmentierter dermaler Zellen (PDZ) in den Altersfleckarealen (Abb. 3.6). Die statistische Auswertung ergab einen signifikant höheren Anteil (P=0,05) dieser melaninhaltigen Zellen in den Läsionen im Vergleich zur Umgebungshaut (a). Dies wird ebenfalls deutlich, wenn man die Zahl der pigmentierten Zellen der läsionale Haut und der normalen Haut jedes einzelnen Probanden vergleicht (b).

Lipofuszin stellt eine fluoreszierende, schwer abbaubare Substanz dar, welche sich während des Alterungsprozesses in den Lysosomen postmitotischer Zellen anreichert (Brunk, Terman 2002). Daher ergab sich die Frage, ob die in dieser Studie beschriebenen pigmentierten Zellen der Läsionen Lipofuszin enthalten, und ob der Gehalt an Lipofuszin im Vergleich zur nicht-läsionalen Haut erhöht ist. Lipofuszin lässt sich durch Silbersalze anfärben und ist durch die verwendeten Silberfärbungen nicht eindeutig von Melanin abzugrenzen. Daher erfolgte eine Lipofuszin-Färbung der Paraffinschnitte mit Sudan-Schwarz B. Die Untersuchung des Lipofuszingehalts in den Biopsien der Probanden erbrachte jedoch sehr uneinheitliche Ergebnisse (Daten nicht gezeigt), aufgrund derer sich kein Zusammenhang zwischen der Lokalisation der pigmentierten Läsion und einem erhöhten Lipofuszingehalt in diesem Bereich der Dermis herstellen ließ. Um den Lipofuszin-Gehalt in junger und alter Haut zu vergleichen, wurden neben den Biopsien der Probanden ebenfalls Hautproben von drei jungen und drei alten Spendern untersucht. Das Material wurde nicht im Rahmen der klinischen Studie entnommen, sondern von der Beiersdorf AG zur Verfügung gestellt.

Es war jedoch nicht bekannt, aus welchem Areal diese Biopsien stammten. Vergleicht man den Gehalt an Lipofuszin in der Haut des 25-jährigen Spenders mit dem eines 64-jährigen (Abb. 3.10), zeigte sich eine deutliche Färbung des Stratum reticulare der älteren Haut. In der jungen Haut war lediglich eine Hintergrundfärbung zu erkennen.

Durch den Nachweis mit Sudan-Schwarz wurden in den Paraffinschnitten der Hautbiopsien hauptsächlich Strukturen angefärbt, die elastischen Fasern entsprachen.

Da sich Lipofuszin vorrangig im lysosomalen Kompartiment von Zellen anreichert, war eine Färbung intrazellulärer Strukturen zu erwarten. Es schien sich bei dem in den

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0

50 100 150

Läsion 1 Läsion 2 Periläsional

Proband PDZ/Fläche Dermis [mm2 ]

Periläsional Läsional 0

50 100 150

PDZ/Fläche Dermis [mm2]

a b

dermalen, granulierten Zellen enthaltenen Pigment daher nicht um Lipofuszin zu handeln.

Abb. 3.10: Lipofuszin-Färbung von Paraffinschnitten junger und alter Haut. In der Haut des jungen Spenders (a) ist lediglich eine Hintergrundfärbung zu erkennen, wohingegen die retikuläre Dermis des älteren Spenders (b) zahlreiche Lipofuszin-positive Strukturen aufweist, die Ähnlichkeit mit elastischen Fasern besitzen. Maßstab: 200 µm

Die ultrastrukturelle Analyse der Biopsien bestätigte die Ergebnisse der vorausgegangenen histologischen Untersuchungen. Der Gehalt an Melanosomen in der Epidermis der Läsionen war im Vergleich zur normalen Haut meist erhöht, wobei sich die Pigmentierung nicht nur auf das Stratum basale beschränkte, sondern auch in den suprabasalen Schichten der Epidermis nachweisbar war. In den hyperpigmentierten Arealen zeigten sich zahlreiche Melanosomen-Komplexe in den Keratinozyten, die sich kappenartig um den Kern lagerten (Abb. 3.11).

Die elektronenmikroskopische Analyse des dermalen Kompartiments der Lentigines ergab ebenfalls ein vermehrtes Auftreten von Zellen, die stark elektronendichtes Material enthielten. Diese fanden sich zumeist in der papillären Dermis unterhalb der dermo-epidermalen Übergangszone und waren von Kollagenfasern der extrazellulären Matrix umgeben. Sie lagen dort häufig in Clustern vor, an die verschiedene nicht-pigmentierte Zellen angrenzten. Die pigmenthaltigen Zellen im dermalen Kompartiment der Läsionen wiesen unterschiedliche Morphologien auf (Abb. 3.12). Teilweise besaßen sie ein fibroblastenartiges, spindelförmiges Aussehen, andere waren eher von runder Gestalt. Letztere könnten aufgrund ihrer Morphologie und durch das Vorhandensein zahlreicher lysosomaler Strukturen Makrophagen darstellen.

a b

Abb. 3.11: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Ultradünnschnitten der normalen Haut (a) und eines Altersflecks von Probandin 12 (b). In der periläsionalen Haut sind einige wenige Melanosomen in den basalen Keratinozyten zu erkennen, die zumeist einzeln in den Zellen vorliegen (Pfeile in c). In bestimmten Bereichen der pigmentierten Läsion sind sowohl in den basalen als auch in den suprabasalen Keratinozyten der Epidermis große Mengen Melanin enthalten, welches eine perinukleäre Verteilung innerhalb der Zelle besitzt. Dabei sind 3 bis 8 Melanosomen zu größeren Komplexen zusammengefasst (Pfeile in d). Die Pfeilköpfe in c und markieren die Basalmembran. D = Dermis, EP = Epidermis, K = Kern, Maßstab a und b: 4 µm Als eine Möglichkeit, die das Vorkommen der pigmentierten Zellen erklären könnte, wurde das Einwandern epidermaler Zellen, wie beispielsweise von Langerhanszellen oder Melanozyten, in die Dermis in Betracht gezogen. Allerdings enthielt die pigmenthaltigen dermalen Zellen keine Birbeck-Granula, durch die Langerhanszellen ultrastrukturell charakterisiert sind. Daher konnte ausgeschlossen werden, dass es sich bei den hier beschriebenen melaninhaltigen Zellen um diesen epidermalen Zelltyp handelt.

a b

c d

Abb. 3.12: Elektronenmikroskopischer Nachweis pigmenthaltiger Zellen in der Dermis der Läsionen. Die dermalen Zellen enthielten unterschiedliche Mengen an Pigmentgranula und besaßen verschiedenartige Morphologien. Teilweise waren sie eher spindelförmig und entsprachen in ihrer Form Fibroblasten (a und b), andere wiesen Ähnlichkeit mit Makrophagen auf (c und d). Die stärkere Vergrößerung der enthaltenen Pigmente (f) zeigte, dass diese stets von einer Membran umgeben waren. Einige der lysosomalen Strukturen enthielten mehrere melaninartige Granula (Pfeile), in anderen war weniger elektronendichtes und feiner granuliertes Material (Sterne) zu erkennen. Maßstab: 3,7 µm (a, b, d), 3,0 µm (c), 2,2 µm (e), 0,8 µm (f).

Bei den in dieser Studie durchgeführten ultrastrukturellen Analysen fanden sich sowohl in den Läsionen als auch in der Umgebungshaut Melanozyten, die in die Dermis hineinragten. Diese waren jedoch stets von einer Basalmembran umgeben und somit

noch in das epidermale Kompartiment eingebunden (Abb. 3.13 a und b). Nur wenige der pigmenthaltigen Zellen ließen sich aufgrund ihrer Ultrastruktur eindeutig einem bestimmten Zelltyp zuordnen, wie z.B. zu Perineuralzellen oder Schwannzellen (Abb.

3.13 c und d).

Die Morphologie des in den dermalen Zellen enthaltenen elektronendichten Materials war recht unterschiedlich. In den meisten Zellen waren Strukturen erkennbar, die eine sehr starke Ähnlichkeit mit den in den Keratinozyten enthaltenen Melanosomen aufwiesen. Bei stärkerer Vergrößerung der oben beschriebenen Zellen in der Dermis der läsionalen Haut zeigte sich, dass die enthaltenen melanosomenartigen Strukturen selten vereinzelt, zumeist als Aggregate vorlagen. In einigen Zellen war nahezu das gesamte Zytoplasma mit großen Melanosomen-Komplexen ausgefüllt (Abb. 3.12 b). In den Keratinozyten der Epidermis enthielt ein solcher Komplex durchschnittlich 3 bis 5 Melanosomen, während in den dermalen Zellen teilweise 8 bis 20 Melanosomen von einer Membran umgeben waren.

Andere dermale Zellen enthielten feiner granuliertes Material, wobei hier keine einzelnen Pigmentkörnchen zu erkennen waren (Abb. 3.12 f). Möglicherweise ist dies auf einen fortgeschrittenen Abbau des elektronendichten Pigments zurückzuführen.

Auch in der Dermis der periläsionalen Haut fanden sich vereinzelt Zellen mit elektronendichtem Material im Zytoplasma (Abb. 3.14 a). Diese unterschieden sich jedoch zumeist in der Struktur von den oben beschriebenen Pigmenten in den dermalen Zellen des Altersflecks (Abb. 3.14 b). Die Substanzen in den Zellen der normalen Haut waren zwar ebenfalls von einer Membran umgeben, jedoch inhomogener und wesentlich feiner gekörnt. Es zeigten sich keine Ähnlichkeiten mit den in der Epidermis enthaltenen Melanosomen. Der Nachweis von Melanin erfolgte mit Hilfe der Warthin-Starry-Färbung ebenfalls in den Ultradünnschnitten. Dies ermöglichte eine detailliertere Analyse der Pigmentierung des Biopsiematerials mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie. In den Gewebeschnitten einiger Probanden färbte sich ein großer Anteil dermaler Zellen, die melanosomenartige Pigmente enthielten, mit Hilfe dieser Methode an. Das ausgefallene Silber war hierbei deutlich auf die Bereiche, die das elektronendichte Material enthielten, begrenzt und es war nahezu keine Hintergrundfärbung im Zytoplasma der Zellen zu erkennen (Abb. 3.15).

Die Spezifität der Färbung für Melanin wurde durch die positiv markierten Melaningranula in den Keratinozyten der Epidermis verdeutlicht (Abb. 3.16). Bei nahezu allen analysierten Gewebeschnitten zeigte sich, dass die Melaningranula in den Keratinozyten der Altersfleckareale stärker positiv reagierten als jene in der normalen Haut. Die ausgefallenen Silberkörnchen bildeten auf zahlreichen

Melanosomen Aggregate (Abb. 3.16 e und f). Auffällig war jedoch, dass sich nicht alle Melaningranula anfärben ließen.

Abb. 3.13: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Melanozyten in der dermo-epidermalen Übergangszone, sowie pigmenthaltiger Perineuralzellen und Schwannzellen in der Dermis. In einigen Biopsien der Lentigines fanden sich Zellen, die in die Dermis ragten, jedoch noch in das epidermale Kompartiment eingebunden waren (Sterne in a und b). Diese besaßen die für Melanozyten typischen ultrastrukturellen Charakteristika und enthielten nur wenige Melaningranula, die nicht in einem Melanosomenkomplex vorlagen. In der Dermis konnte Melanin ebenfalls in Perineuralzellen (c) und Schwannzellen nachgewiesen werden (Pfeil in d).

Der vergrößerte Ausschnitt in c zeigt die enthaltenen Melaningranula. Die Pfeilköpfe in c und d markieren das Perineurium. Maßstab: 3,1 µm (a, c und d), 0,8 µm (b).

Abb 3.14: Elektronenmikroskopischer Nachweis von pigmenthaltigen Zellen in der normalen Haut (a) und eines Altersflecks (b). Dermale Zellen der Läsion enthielten häufig Pigmente, die in ihrer Ultrastruktur Melanosomen entsprechen (Pfeile in b). Die Pigmente waren zu großen Aggregaten zusammengefasst und von einer Membran umgeben. Im Vergleich dazu fanden sich in der Dermis der normalen Haut nur selten Zellen mit elektronendichtem Material (a).

Diese Substanzen waren ebenfalls von Membranen umschlossen (Pfeilköpfe in a), jedoch eher inhomogen und feiner granuliert (Sterne in a). Maßstab: a: 1 µm, b: 0,8 µm

Abb. 3.15: Nachweis von Melanin in den Ultradünnschnitten der Biopsien durch die Warthin-Starry Färbung. Die pigmenthaltigen Zellen in der Dermis der Läsion wiesen einen deutlichen Niederschlag auf, der auf die Bereiche mit elektronendichtem Material begrenzt war. Die stärkere Vergrößerung (b) zeigt die ausgefallenen Silberaggregate. Maßstab: a: 2,3 µm; b: 0,8 µm

Dies bestätigte sich bei sämtlichen durchgeführten Färbungen der Ultradünnschnitte menschlicher Altershaut. Möglicherweise ist dies mit dem unterschiedlichen Gehalt an Melanin in den einzelnen Melanosomen zu erklären. Da es sich bei der Warthin-Starry-Färbung um eine argyrophile Methode handelt, ist nicht auszuschließen, dass auch Aldehyd- und Ketongruppen, die durch die Fixierung entstehen, sowie Lipofuszin zu falsch positiven Ergebnissen geführt haben.

a b

a b

a b

Die hier gezeigten Untersuchungen des Biopsiematerials ergaben als ein weiteres charakteristisches Merkmal der Lentigo senilis eine erhöhte Zahl melaninhaltiger Zellen im dermalen Kompartiment der Altersfleckareale. Die Frage, um was für einen Zelltyp es sich hierbei handelt, konnte durch die ultrastrukturellen Analysen jedoch nicht ermittelt werden. Die Frage nach dem Typus und der Herkunft der beschriebenen Zellen sollte daher durch immunhistochemische Analysen geklärt werden.

Abb. 3.16: Warthin-Starry Färbung von Ultradünnschnitten zum Nachweis von Melanin in der Epidermis der Läsionen und der normalen Haut. Im Vergleich zur periläsionalen Haut war in den Läsionen ein stärkerer Niederschlag auf den Melanosomen der Keratinozyten nachweisbar. Es wurden in beiden Biopsien nicht alle Melaningranula mit dieser Methode gefärbt. Maßstab: 4 µm (a und b); 1 µm (c und d); 0,6 µm (e und f).

a b

Periläsional Läsional 0

25 50 75 100 125

CD68+ Zellen/mm2

Periläsional Läsional 0

100 200 300 400 500

FaktorXIIIa+ Zellen/mm2