2. MATERIAL UND METHODEN
2.2 Material
2.2.2 Geräte
Zentrifugen: Kühlzentrifuge 3K30 Sigma
Tischzentrifuge Biofuge pico (Hereaus) Kühlzentrifuge J2-21 (Beckman) Kühlzentrifuge J6 (Beckman)
Zentrifuge Hermle Z364 (MAGV GmbH) Ultrazentrifuge Combi plus (Sorvall)
Mikroskope Fluoreszenzmikroskop Olympus BX 61
Fluoreszenzmikroskop Axiovert 100 (Zeiss) Transmissionselektronenmikroskop EM 109 (Zeiss)
Rasterelektronenmikroskop REM-ISI-SX-30
(Leitz)
Photometer Spektralphotometer Hitachi U-2000
Fluoreszenzphotometer SFM 25 Kont Mikrotiterplattenreader Infinite™ 200 (Tecan)
Thermocycler Personal Cycler UNO-Thermoblock (Biometra)
Vortexer Vortex Genie 2 ™ (Bender und Hobein)
Magnetrührer Typ Heidolph MR 2000 (MAGV GmbH)
Einbettautomat Microm
Mikrotom HM 400 (Microm)
Ultramikrotom OM U2 (Reichert)
Sputter Coater S150 (Edwards)
Real time cycler AbiPrism 7000 Sequence detection system (Applied Biosystems)
Wasserbad Kochwasserbad (Memmert)
Netzgeräte Power Pack P25 (Biometra)
2197 Power supply (LKB Bromma) Blotkammer SDE-Elektroblotting System (Peqlab)
Inkubatoren CO2-begasbarer Brutschrank Zellkultur (Integra) Brutschrank für die Bakterienkultur (Memmert) Brutschrank für Paraffinbäder (Jouan)
Schüttelinkubator (New Brunswick) 50◦C Wärmeschrank (Binder)
Autoklaven Laborautoklav GLA 40-1 (Gössner)
GTA 50 (Gössner)
Reinstwasseranlage Clear Millipore
Sterilbank NuAire DH Alphaflow (Integra)
Färbeautomat Histologie Tech-Mate Horizon UV Transilluminator CN6 1.4 Raytest
Potter B.Braun
Imagingsystem Chemi-Lux (Intas)
2.2.3 Plastikware
Alle Plastikwaren und Reaktionsgefäße wurden von den Firmen Becton-Dickinson (Franklin Lakes, NJ), Greiner (Frickenhausen), Sarstedt (Nümbrecht), Corning (Schiphol-Rijk, NE) und Eppendorf (Hamburg) bezogen.
2.2.4 Chemikalien
Alle Chemikalien wurden, wenn nicht anders vermerkt, in p.A.-Qualität von den unter Punkt 2.1.2 angegebenen Firmen bezogen
2.2.5 siRNA
siRNA siRNA ID Nummer Ambion
HO-1_a 11242
HO-1_b 11252
HO-1_c 11056
NOX4_a 117540
NOX4_b 118807
NOX4_c 117539
Silencer® Negative Control #1 AM4611
Die verwendeten siRNA Oligonukleotide wurden als doppelsträngige Oligonukleotide von der Fa. Ambion (Applied Biosystems, Darmstadt) in Standardqualität hergestellt.
2.2.6 Plasmide
pCI-neo Expressionsvektor für höhere eukaryonte Zellen (Promega, Mannheim) pEGFP-N1 (Clontech, France)
HMOX1 (human Heme oxygenase 1) full length cDNA clone IRAUp969F1147D Vektor pOTB7 (RZPD, Berlin)
NOX4 (human NADPH oxidase 4) full length cDNA clone IRATp970E0371D Vektor pCMV-SPORT6 (RZPD, Berlin)
2.2.7 Software
Analysis (Soft Imaging System, Münster) WinDiss (point electronic GmbH, Halle)
GraphPad Prism (GraphPad Software, CA, USA)
Adobe® Photoshop (Adobe Systems Incorporated, München) Adobe® Illustrator CS2 (Adobe Systems Incorporated, München) Microsoft PowerPoint (Microsoft Deutschland GmbH, Unterschleißheim) Microsoft Excel (Microsoft Deutschland GmbH, Unterschleißheim) Leica Application Suite Vers. 2.50 R1 (Leica, Wetzlar)
2.2.8 Antikörper
2.2.8.1 Antikörper für die Immunzytochemie
Erstantikörper Verdünnung Spezies Quelle Permeabilisierung
Ki67 1:100 Kaninchen abcam 0,1% Triton X-100
BrdU 1:100 Maus Dako siehe unter 2.3.6.2
HO-1 1:1000 Kaninchen ABR 0,1% Triton X-100
p22 phox 1:200 Kaninchen Santa cruz 0,1% Triton X-100
mnSOD 1:200 Maus Alexis 0,1% Triton X-100
HO-1 1:200 Maus abcam 0,1% Triton X-100
LAMP-1 1:1000 Maus BD Pharmingen keine
Zweitantikörper
Fluorochrom Verdünnung Spezies Quelle
Alexa 546
Anti-Kaninchen 1:800 Ziege Molecular Probes
Alexa 488
Anti-Kaninchen 1:800 Ziege Molecular Probes
Alexa 488
Anti-Maus 1:800 Ziege Molecular Probes
Alexa 546
Anti-Maus 1:800 Ziege Molecular Probes
2.2.8.2 Antikörper für die Immunhistochemie
Erstantikörper Verdünnung Spezies Quelle Demaskierung
Ki67 1:50 Kaninchen abcam Mikrowelle/Citratpuffer
S100 1:600 Kaninchen Dako Tech Mate
CD68 1:50 Maus Dako Tech Mate
FXIIIa 1:1000 Kaninchen Chiron-Behring
Dako Tech Mate
AGE 1:100 Maus Wako Proteinase K
2.2.8.3 Antikörper für die Immunoblotanalysen
Erstantikörper Verdünnung Spezies Quelle
HO-1 1:500 Kaninchen ABR
α-Tubulin 1:1000 Maus NeoMarkers
RAGE 1:600 Kaninchen Chemicon
GAPDH 1:1000 Kaninchen Biomol
Galectin-3 1:1000 Kaninchen Gebhardt
p22phox 1:200 Kaninchen Santa Cruz
Serum 191 1:1000 Kaninchen Seramun/AG
Elsässer
AGE 1:600 Maus Wako
2.2.9 Andere Reagenzien und Kits
Bovines Serumalbumin Low endotoxin, fettsäurefrei (Sigma) TRIZOL™ (Invitrogen)
Tri ® Reagent (Sigma)
Gene Ruler50 bp DNA Marker (Fermentas) Gene Ruler 100 bp DNA Marker (Fermentas) TriDye 2-Log DNA Ladder (NEB)
Proteinmarker Bench Mark Prestained (Invitrogen)
Proteinmarker PageRuler Prestained Protein Ladder Plus (Fermentas)
Enzym Antigen Spezies Verdünnung
Westernblot Quelle HRP
(Horseradish peroxidase) Maus Ziege 1:10 000 BioRad
HRP Kaninchen Ziege 1:10 000 BioRad
PVDF Membran Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA) Nitrozellulose Protran (Schleicher & Schuell)
Super Signal West Dura Extended Duration Substrate (Pierce) Super Signal West Pico Substrate (Pierce)
Hämin (Porphyrin Systems) Glutathion red. (Sigma) L-Histidin (Serva)
2.2.10 Filmmaterial
Medical X-Ray Filme (Fuji, Düsseldorf) Biomax MR Filme (Kodak, Rochester, NY) HP 5 Plus Negativfilme (Ilford, Cheshire, UK)
ProfPack ORT 25c EM (Maco Photo Products, Hamburg)
2.2.11 Biopsiematerial für die klinische Studie von Altersflecken
Der Antrag zum Projekt „Morphologische Untersuchungen von Altersflecken in der Haut“ wurde durch die Ethikkomission der medizinischen Fakultät der Universität Marburg genehmigt und die Studie nach den vorgegebenen Richtlinien durchgeführt.
Für die systematische morphologische Analyse von Altersflecken im Vergleich zu normaler Haut wurde Biopsiematerial von 12 freiwilligen Probanden (Kaukasischer Typ, 9 Frauen und 3 Männer im Alter von 52 bis 81 Jahren) entnommen, wobei die Auswahl der Probanden durch Frau Dr. Freyschmidt-Paul, Dermatologin der Hautklinik der Universität Marburg, erfolgte. Für die Biopsieentnahme wurden Probanden rekrutiert, die das 50. Lebensjahr überschritten hatten und entweder ambulant oder stationär in der Universitätshautklinik aufgenommen wurden. Die Probandenberatung und Aufklärung wurde von Frau Dr. Freyschmidt-Paul durchgeführt, die ebenfalls die Diagnose „Lentigo senilis“ stellte.
Die Altersflecken wurden vor der Entnahme zu Dokumentationszwecken fotografiert und die Anamnesebögen der Probanden ausgewertet, wobei folgende Parameter katalogisiert wurden: Geschlecht, Alter, Lichttyp, Lichtexposition, Raucher, Diabetes und sonstige dermale Erkrankungen. Die Einteilung in die verschiedenen Hauttypen erfolgte entsprechend der Klassifizierung nach Fitzpatrick (Fitzpatrick 1988). Alle Probanden gaben an, im Laufe ihres Lebens einer mittleren (++) bis starken (+++) Sonnenexposition ausgesetzt gewesen zu sein. Unter den ausgewählten Probanden befand sich kein Diabetiker, bei einem der Patienten war 5 Jahre vor der
Biopsieentnahme ein Melanom diagnostiziert worden. Eine weitere Probandin litt 4 Jahre zuvor an einem Basalzellkarzinom.
Es wurden pro Proband zwei pigmentierte Bereiche des Unterarmes bzw. der Hand sowie ein Areal der benachbarten, nicht-läsionalen Haut ausgewählt. Die Entnahme der Stanzbiopsien erfolgte, nach der schriftlichen Einverständniserklärung des entsprechenden Probanden, unter Lokalanästhesie mit 1% Mepivacaine. Die Biopsien, die einen Durchmesser von 4 mm besaßen, wurden sofort nach der Entnahme geteilt.
Ein Teil des Materials wurde für die Elektronenmikroskopie fixiert und anschließend in Kunstharz eingebettet (2.3.1.1) der zweite Teil wurde für histologische Analysen in 4%
Paraformaldehyd (2.3.3) fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Patientendaten sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
+++: starke UV-Exposition, ++: mittlere UV-Exposition; m = männlich, w = weiblich Proband Geschlecht Alter Hauttyp
Fitzpatrick
UV-Exposition Diabetes Raucher Weitere Merkmale
1 m 81 II ++ nein nein Melanom vor 5
Jahren
2 w 79 II +++ nein nein
3 w 63 II +++ nein nein
4 m 66 II +++ nein nein
5 m 56 II ++ nein nein
6 w 79 II ++ nein nein
7 w 74 II ++ nein nein
8 w 55 II ++ nein ja
9 w 56 II-III ++ nein nein Basaliom vor 4
Jahren
10 w 56 II ++ nein ja
11 w 52 III +++ nein nein
12 w 54 III +++ nein ja
2.2.11.1 Weiteres Biopsiematerial
Zusätzliches humanes Biopsiematerial verschiedener junger und alter Spender wurde von der Beiersdorf AG zur Verfügung gestellt. Bei dem Material handelte es sich um paraffinierte Hautproben aus unterschiedlichen anatomischen Arealen. Die Gewebe wurden, wie unter Punkt 2.3.3 beschrieben, für histologische als auch immun-histochemische Analysen weiterverarbeitet.
2.2.12 Häufig verwendete Puffer und Lösungen
Für alle aufgeführten Lösungen wurde, wenn nicht anders vermerkt, deionisiertes Reinstwasser (a.d., 18 mΩ Millipore-Qualität) verwendet. Die in der Zellkultur und Molekularbiologie verwendeten Lösungen wurden mit pyrogenfreiem (aqua ad iniectabilia: a.a.i.) bzw. RNAse/DNAse-freiem Wasser angesetzt.
PBS (Phosphate buffered saline): 140 mM NaCl 2,5 mM KCl 6,5 mM Na2HPO4
1,5 mM KH2PO4
PBS-T: PBS mit 0,1% Tween 20 (v/v)
10x TBS (Tris buffered saline): 0,5 M Tris Base 1,5 M NaCl
TBS-T: TBS mit 0,1% Tween 20 (v/v)
TBS-TB: TBS-T mit 5% Magermilchpulver (w/v)
4x SDS Probenpuffer: 200 mM Tris Base
400 mM Dithiothreitol (DTT) 8% Natriumdodecylsulfat (w/v) 0,4% Bromphenolbllau (w/v) 40% Glycerol (v/v)
10x Laemmli-Laufpuffer: 250 mM Tris Base 1,9 M Glycin
0,04% Natriumdodecylsulfat (w/v)
Semi dry Blotpuffer: 48 mM Tris 39 mM Glycin
0,04% (w/v) Natriumdodecylsulfat 20% (v/v) Methanol
TE (Tris-EDTA): 10 mM Tris/HCl, pH 7,6 1 mM EDTA, pH 8,0
5xTBE 0,445 M Tris Base
0,445 M Borsäure 0,01 M EDTA
6x DNA Probenpuffer: 0,4% Bromphenolblau (w/v) 0,4% Xylencyanol (w/v) 50% Glycerol (v/v)
4% Paraformaldehydlösung: 4% Paraformaldehyd (PFA w/v, Serva) in PBS geben, über Nacht unter Rühren lösen und durch tropfenweise Zugabe von 1N NaOH klären.