Leiter: Prof. Dr. R. Lill
des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg
in Zusammenarbeit mit dem Universitätsklinikum Gießen und Marburg GmbH, Standort Marburg
Das dermale Kompartiment von Altersflecken
und die Wirkung von Advanced Glycation End Products
(AGEs) auf dermale Fibroblasten
Inaugural Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Humanbiologie (Dr. rer. physiol.)
dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von
Nadime Ünver aus Oberhausen Marburg, 2007
Angenommen vom Fachbereich Medizin
der Philipps-Universität Marburg am 22.02.2008 Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs. Dekan: Prof. Dr. M. Rothmund
Referent: Prof. Dr. H.-P. Elsässer 1. Korreferent Prof. Dr. R. Moll
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG ... 1
1.1 Die Haut ... 1
1.1.1 Die Epidermis... 1
1.1.1.1 Melanozyten ... 3
1.1.2 Die dermo-epidermale Übergangszone ... 5
1.1.3 Die Dermis ... 5 1.1.3.1 Kollagen... 6 1.1.3.2 Elastin... 7 1.1.3.3 Grundsubstanz ... 7 1.1.4 Dermale Zellen... 8 1.1.4.1 Fibroblasten... 8
1.1.4.2 Dermale dendritische Zellen... 10
1.1.4.3 Makrophagen...11
1.1.4.4 Mastzellen ...11
1.1.5 Die Subcutis ... 12
1.2 Die Alterung menschlicher Haut ... 12
1.3 Reaktive Sauerstoffspezies und antioxidative Schutzmechanismen ... 13
1.4 Advanced Glycation End Products ... 18
1.5 Fragestellung ... 23
2. MATERIAL UND METHODEN ... 24
2.1 Abkürzungsverzeichnis... 24 2.2 Material ... 27 2.2.1 Firmenverzeichnis ... 27 2.2.2 Geräte ... 28 2.2.3 Plastikware... 29 2.2.4 Chemikalien ... 29 2.2.5 siRNA ... 29 2.2.6 Plasmide ... 29 2.2.7 Software ... 30 2.2.8 Antikörper ... 30
2.2.8.1 Antikörper für die Immunzytochemie ... 30
2.2.8.2 Antikörper für die Immunhistochemie ... 31
2.2.8.3 Antikörper für die Immunoblotanalysen ... 31
2.2.9 Andere Reagenzien und Kits ... 31
2.2.10 Filmmaterial... 32
2.2.11 Biopsiematerial für die klinische Studie von Altersflecken ... 32
2.2.11.1 Weiteres Biopsiematerial... 34
2.2.12 Häufig verwendete Puffer und Lösungen... 34
2.3 Methoden ... 36
2.3.1.1 Elektronenmikroskopie von Gewebe... 36
2.3.1.2 Melaninfärbung von Semi- und Ultradünnschnitten nach Warthin-Starry (Youngs modification) ... 38
2.3.1.3 Elektronenmikroskopischer Nachweis der Meerrettich-Peroxidase in Zellen ... 39
2.3.2 Rasterelektronenmikroskopie ... 40
2.3.3 Probenvorbereitung für die Histologie und Immunhistochemie ... 41
2.3.3.1 Herstellung von Paraffinschnitten... 42
2.3.4 Histologische Färbungen ... 42
2.3.4.1 Hämatoxylin und Eosin Färbung ... 42
2.3.4.2 Fontana-Masson... 42
2.3.4.3 Lipofuszinfärbung mit Sudan B ... 43
2.3.5 Immunhistochemie ... 43
2.3.5.1 Prinzip des TechMateTM Horizon ... 44
2.3.5.2 Nachweis des Proliferationsmarkers Ki67... 45
2.3.6 Immunzytochemie ... 46
2.3.6.1 Immunofärbung von Zellen... 46
2.3.6.2 Immunzytochemischer Nachweis von BrdU... 46
2.3.6.3 TUNEL Assay ... 47
2.3.7 Zellkultur... 48
2.3.7.1 Kultivierung adhärenter Zellen ... 48
2.3.7.2 Bestimmung der Zellzahl... 48
2.3.7.3 Transiente Transfektion eukaryotischer Zellen durch Lipofektion ... 49
2.3.7.4 Kontrolle der Transfektionseffizienz von Plasmid-DNA... 50
2.3.7.5 Optimierung und Kontrolle der Transfektion von siRNA... 50
2.3.7.6 Herstellung und Glycierung von Kollagen G-Gelen ... 50
2.3.7.7 Herstellung von AGE-BSA... 51
2.3.8 Molekularbiologische Methoden ... 52
2.3.8.1 Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellen ... 52
2.3.8.2 Ethanolfällung von Nukleinsäuren... 53
2.3.8.3 Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA... 54
2.3.8.4 Microarray Analysen... 55
2.3.8.5 cDNA-Synthese durch Reverse Transkription... 56
2.3.8.6 Polymerasekettenreaktion... 57
2.3.8.7 Semiquantitative PCR ... 59
2.3.8.8 Agarosegelelektrophorese... 59
2.3.8.9 Klonierung spezifischer DNA-Fragmente... 59
2.3.9 Proteinbiochemie ... 65
2.3.9.1 Herstellung von Zelllysaten ... 65
2.3.9.2 Zellfraktionierung durch Differenzialzentrifugation ... 65
2.3.9.3 Acetonfällung ... 66
2.3.9.5 Immunoblot-Analysen... 70
2.3.10 Enzymassays ... 71
2.3.10.1 Verdau von Proteinen mit Cathepsin D und der lysosomalen Fraktion aus Mausleber ... 71
2.3.10.2 Bestimmung der Cathepsin D Aktivität mittels Fluoreszenz... 72
2.3.10.3 Aktivitätsbestimmung der Sauren Phosphatase... 73
2.3.10.4 Bestimmung der Peroxidase-Aktivität ... 74
3. ERGEBNISSE ... 75
3.1 Klinische Studie zur Untersuchung der Lentigo senilis... 75
3.1.1 Morphologische und histologische Analyse der Biopsien ... 75
3.1.2 Analyse der Reteleisten ... 76
3.1.3 Analyse der Proliferation ... 77
3.1.4 Analyse der Hyperpigmentierung... 79
3.1.5 Morphologische Analyse der Dermis ... 82
3.1.6 Immunhistochemische Analyse der dermalen melaninhaltigen Zellen ... 91
3.1.7 Immunhistologischer Nachweis von Advanced Glycation End Products in Hautbiopsien ... 93
3.2 Einfluss von AGEs auf dermale Fibroblasten ... 97
3.2.1 Herstellung und Charakterisierung von AGE-BSA als Modell-AGE... 97
3.2.2 Nachweis von AGE-BSA mit Antiseren bzw. Antikörpern... 98
3.2.3 Einfluss von AGE-BSA auf Proliferation und Apoptose von Fibroblasten... 100
3.3 Aufnahme und Abbau von AGEs durch lysosomale Enzyme... 102
3.3.1 Elektronenmikroskopischer Nachweis unglycierter und glycierter Meerrettich-Peroxidase in Mausfibroblasten... 103
3.3.2 Untersuchung des Abbaus von AGE-BSA in einem zellfreien lysosomalen in vitro-System ... 106
3.4 RT-PCR und Immunoblot-Analyse der Expression verschiedener AGE-Rezeptoren ...110
3.5 Analyse der differenziellen Genexpression von Fibroblasten nach Behandlung mit AGE-BSA...113
3.5.1 Validierung verschiedener Kandidatengene durch PCR-und Immunoblot-Analysen 116 3.5.2 Kontrollversuch zur Induktion von HO-1 und NOX4 durch Lipopolysaccharide ...118
3.5.3 Untersuchungen zur Expression von NOX-Homologen und NOX-Untereinheiten in dermalen Fibroblasten ...119
3.5.4 Expressionsanalyse der NOX-Untereinheit p22phox in primären dermalen Fibroblasten ... 121
3.5.5 Lokalisationsstudien von NOX4, p22phox und HO-1 durch Immunfluoreszenzanalysen ... 123
3.6 siRNA-vermittelte Inhibition der HO-1 und NOX4 Expression in primären dermalen Fibroblasten ... 126
3.7 Expressionsanalysen der HO1 und NOX4 nach Behandlung mit Glutathion, Histidin und Hämin... 129
3.8 Untersuchungen zur Adhäsion und Migration von dermalen Fibroblasten auf glycierten
Kollagengelen ... 131
4. DISKUSSION ... 137
4.1 Klinische Studie der Lentigo senilis ... 137
4.1.1 Morphologische Analyse der Epidermis von Altersflecken ... 137
4.1.2 Ursachen der Hyperpigmentierung ... 139
4.1.3 Morphologische und immunhistologische Analyse der Dermis hyperpigmentierter Läsionen... 140
4.1.4 Auf welchem Weg gelangt Melanin in die Dermis?... 141
4.1.5 Pigmentierte Zellen der läsionalen Dermis enthalten große Melanosomenkomplexe ... 143
4.1.6 Melanophagen in der Dermis von Altersflecken entsprechen Faktor XIIIa positiven dermalen Dendrozyten... 144
4.1.7 Der Anteil CML-modifizierter Strukturen ist in der Dermis der Altersflecken nicht erhöht ... 146
4.2 Die Wirkung von AGEs auf Fibroblasten ... 148
4.2.1 Einfluss von AGE-BSA auf die Proliferation und Apoptose primärer dermaler Fibroblasten ... 148
4.2.2 Einfluss von AGE-BSA auf den Redox-Status von dermalen Fibroblasten ... 150
4.2.3 Regulation und Funktion von NOX4 und p22phox in dermalen Fibroblasten ... 152
4.2.4 Die Induktion der HO-1 nach Behandlung mit AGE-BSA wird durch den Redoxzustand dermaler Fibroblasten vermittelt ... 154
4.2.5 Stehen HO-1 und NOX4 miteinander in Wechselwirkung? ... 156
4.2.6 Eine Hypothese zur Funktion der NOX4 und HO-1 in der menschlichen Haut ... 157
4.2.7 Fibroblasten auf gylcierten Kollagengelen zeigen eine veränderte Morphologie ... 158
4.2.8 Bei der Kultivierung dermaler Fibroblasten auf glycierten Kollagengelen entstehen globuläre Strukturen, die Aktin enthalten ... 159
5. ZUSAMMENFASSUNG... 162
6. LITERATURVERZEICHNIS... 164
7. ANHANG ... 180
7.1 Tabellarische Auswertung der Microarray-Analysen... 180
7.2 Lebenslauf ... 194
7.3 Akademische Lehrer ... 195
7.4 Danksagung... 196
1. Einleitung
1.1 Die HautDie Haut stellt die äußere Begrenzung des Körpers gegenüber seiner Umwelt dar. Sie ist von komplexem Aufbau und besitzt als größtes und schwerstes Organ des Menschen vielfältige Funktionen. Die Haut bietet nicht nur Schutz gegen schädliche Umwelteinflüsse wie chemische, physikalische oder mikrobiologische Noxen, sondern ist auch für die Regulation des Temperatur-, Wasser- und Elektrolythaushalts mitverantwortlich. Ebenso fungiert sie als immunologisches Abwehrsystem sowie als Sinnesorgan. Die in der Haut enthaltenen Melaninpigmente gewährleisten zudem die Abschirmung des Organismus gegen UV-Strahlung (Tobin 2006). Die Haut lässt sich von außen nach innen in drei Kompartimente unterteilen: Epidermis (Oberhaut), Dermis (Lederhaut) und Subcutis bzw. Hypodermis (Unterhaut).
Abb. 1.1: Modell der Haut mit den Hautanhangsgebilden. Die Haut setzt sich aus Epidermis, Dermis und Subcutis zusammen. Modifiziert nach Young, Wheater 2006.
1.1.1 Die Epidermis
Die Epidermis ist ein mehrschichtiges, verhornendes Plattenepithel ektodermaler Herkunft mit einer Dicke von 0,04 bis 1,5 mm und ist, wie die meisten Epithelien, nicht vaskularisiert. Sie besteht zu 90-95% aus Keratinozyten, die einem komplizierten, genetisch determinierten Differenzierungsprozess unterworfen sind (Fuchs, Raghavan 2002; Mack et al. 2005; Koster, Roop 2004; Houben et al. 2007). Aufgrund des Differenzierungsstadiums der Keratinozyten lässt sich die Epidermis in vier morphologische Schichten unterteilen. Die innerste Schicht, das Stratum basale, besteht aus hochprismatischen, mitotisch aktiven Basalzellen, die über Hemidesmosomen mit der darunterliegenden Basalmembran verbunden sind.
Abb. 1.2: Schematische Darstellung der Epidermis. Die Keratinozyten bilden 4 Schichten,
Stratum basale (SB), Stratum spinosum (SS), Stratum granulosum (SG) und Stratum corneum
(SC). Neben den Keratinozyten enthält die Epidermis ebenfalls Melanozyten, Langerhanszellen und Merkelzellen. Modifiziert nach Welsch (Welsch, Sobotta 2003)
In der basalen Zellschicht der interfollikulären Epidermis befinden sich zwei Arten proliferierender Zellen. Bei einigen dieser Keratinozyten handelt es sich um Stammzellen mit einer unbegrenzten Teilungsfähigkeit. Aus ihnen gehen als Tochterzellen die transient amplifizierenden Zellen (TAC) hervor, die sich durch eine hohe Teilungsrate auszeichnen, jedoch ein nur begrenztes Proliferationspotential besitzen und nach zwei bis fünf durchlaufenen Zellzyklen in die suprabasalen Zellschichten wandern. Aus den transient amplifizierenden Zellen entstehen somit postmitotische Keratinozyten, die in das Stratum spinosum übertreten und sich dort terminal differenzieren (Potten, Morris 1988; Watt 1998; Jones, Watt 1993). In den Epithelzellen dieser suprabasalen Schicht sind die intrazytoplasmatischen Keratinfilamente an einer Vielzahl von Desmosomen verankert und werden auf diese Weise miteinander verbunden, was ihnen im histologischen Schnitt ihr typisches Aussehen mit zahlreichen stachelartigen Ausläufern verleiht. Dem Stratum spinosum folgt eine dünne Lage sogenannter Körnerzellen, das Stratum granulosum. Diese zwei- bis dreilagige Zellschicht wird durch die enthaltenen basophilen Keratohyalingranula charakterisiert, welche neben Keratin das histidinreiche Protein Filaggrin enthalten. Im oberen Stratum granulosum erfolgt durch die Quervernetzung von Involucrin, Loricrin, Keratolinin und weiteren Proteinen mittels einer kalziumabhängigen Transglutaminase an der Innenseite der Zellmembran die Synthese des sogenannten „cornified envelope“. Dieser verleiht den Keratinozyten eine sehr hohe Rigidität. Die Zellen produzieren zusätzlich eine Lipidmatrix aus Ceramiden, Cholesterol und Cholesterolestern, die dem cornified envelope von außen angelagert wird. Gemeinsam
bilden diese beiden Strukturen eine Permeabilitätsbarriere, die unter anderem ein Austrocknen der Haut durch Verdunstung verhindert (Madison 2003; Nemes, Steinert 1999; Wertz 1992). An das Stratum granulosum schließt sich das Stratum corneum, eine mehrlagige Schicht toter, keratinisierter Zellen an, die zu flachen, kern- und organelllosen Hornschuppen reduziert sind. Diese schilfern schließlich von der Hautoberfläche ab und werden von nachfolgenden Zellen aus dem Stratum granulosum ersetzt (Alberts, Jaenicke 2004). Die Epidermis enthält als weitere Zelltypen 1% bis 2% pigmentproduzierende Melanozyten sowie Langerhanszellen, die die antigenpräsentierenden Zellen in diesem Kompartiment darstellen. Des Weiteren finden sich im Stratum basale Merkelzellen, die als Mechanorezeptoren fungieren.
1.1.1.1 Melanozyten
Die Melanozyten entstammen der Neuralleiste. Sie sind für die Produktion der Melanine verantwortlich und bestimmen somit hauptsächlich die Hautfarbe eines Menschen. Ein einzelner Melanozyt besitzt 20 bis 30 dendritische Ausläufer, die den Kontakt zu ca. 36 Keratinozyten herstellen und die sogenannte epidermale Melanineinheit bilden (Fitzpatrick, Breathnach 1963; Quevedo et al. 1975; Nordlund 2007). Je nach Aktivitätszustand eines Melanozyten sind die ausgebildeten Dendriten größer oder zahlreicher (Fritsch 1998). Die Biosynthese des Melanins erfolgt in charakteristischen Zellorganellen der Melanozyten, den Melanosomen. Hierbei handelt es sich um eine spezielle Form der Lysosomen, deren Vorstufen im glatten Endoplasmatischen Reticulum entstehen (Raposo, Marks 2002; Orlow 1995). Die für die Melaninsynthese notwendigen Enzyme, wie beispielsweise die Tyrosinase und TYRP1 (Tyrosinase related protein 1) sowie weitere Komponenten, werden im rauen ER gebildet und nach der Reifung im Golgi-Apparat in die Melanosomen transportiert (Freinkel 2001; Boissy 2003; Seiberg 2001). Für die strukturelle Reifung der Melanosomen sind die Proteine MART-1 und Pmel17 von entscheidender Bedeutung (Berson et al. 2001; Hoashi 2005). Die Melaninsynthese erfolgt über die Hydroxylierung von Tyrosin zu Dihydroxyphenylalanin (DOPA), welches im weiteren Verlauf zu Dopachinon oxidiert wird. Beide Schritte werden durch die Tyrosinase, dem zentralen Enzym des Melaninstoffwechsels, katalysiert. Ab diesem Schritt verzweigt sich der Syntheseweg und führt zur Bildung zweier Polymerisationsprodukte des Tyrosins, welche sich durch ihre chemischen, physikalischen und strukturellen Eigenschaften unterscheiden. Wird Dopachinon nach verschiedenen weiteren Schritten der Decarboxylierung, Oxidation und Polymerisation zu Dihydroxyindolen umgesetzt, entsteht das schwarzbraune, äußerst stabile Eumelanin (Jimbow 1995; Prota 1980). Die Synthese des rötlich-gelben Phaeomelanins dagegen erfolgt durch die
BM
Polymerisation von Cysteinyldopa-Konjugaten, die zuvor durch die Reaktion von Dopachinon mit Cystein oder Glutathion entstanden sind (Costin, Hearing 2007). In den Melanozyten werden stets beide Melaninformen generiert und in die Proteinmatrix der Melanosomen eingelagert. Während dieses Prozesses, bei dem die Melanosomen durch die dendritischen Zellausläufer wandern, kann man je nach dem Melaningehalt vier Reifestadien dieser Organellen unterscheiden (Jimbow 1985; Raposo et al. 2002; Raposo, Marks 2002).
Abb. 1.3: Schematische Darstellung verschiedener Zelltypen der Haut und der von ihnen synthetisierten Faktoren und Proteine, die an der Regulation der epidermalen Melanineinheit beteiligt sind. BM: Basalmembran. Modifiziert nach Yamaguchi et al. 2007.
Die vollständig melanisierten Melanosomen werden anschließend in einem noch nicht genau bekannten Prozess in die Keratinozyten transferiert, in denen sie zu Melanosomenkomplexen zusammengefasst werden (Yamamoto, Bhawan 1994; Seiberg 2001). Der Melanintransfer kann durch verschiedene Stimuli, vorrangig durch UV-Strahlung, induziert werden und führt in diesem Fall zu einer kappenartigen Verteilung der Melanosomenkomplexe um den Nukleus der Keratinozyten. Auf diese Weise wird die DNA vor UV-induzierten Schäden geschützt (Yamashita et al. 2005; Byers et al. 2003; Gibbs et al. 2000). Die epidermale Melanineinheit reagiert ebenfalls auf zahlreiche intrinsische Faktoren, wie Hormone, Wachstumsfaktoren und Zytokine. Abbildung 1.3 verdeutlicht die Interaktion der verschiedenen Zelltypen, die über zumeist parakrine Wege miteinander kommunizieren und die Pigmentierung der Haut beeinflussen (Yamaguchi et al. 2007). Zurzeit sind 127 Gene bekannt, die die Pigmentierung der Haut direkt oder indirekt regulieren (Bennett, Lamoreux 2003). Der
Abbau von Melanin erfolgt in den Lysosomen der Keratinozyten, wobei jedoch der genaue molekulare Mechanismus dieses Vorgangs noch weitgehend unklar ist (Borovansky, Elleder 2003).
1.1.2 Die dermo-epidermale Übergangszone
Die Basalmembran bildet die Grenze zwischen Epidermis und Dermis und stellt eine spezielle Form der extrazellulären Matrix dar. Sie besteht aus den Hauptkomponenten Kollagen (I, IV, VII) Laminin (1, 5 und 6), Entactin, Heparansulfat, Fibulin und Perlecan, die untereinander vernetzt sind (Fritsch 1998). Mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie lassen sich in der dermo-epidermalen Übergangszone zwei Schichten unterscheiden, die Basallamina, welche sich aus der Lamina lucida und der Lamina densa zusammensetzt, sowie die Lamina fibroretikularis (SELBY 1955; Briggaman, Wheeler 1975).
Ein charakteristisches Merkmal dieser dermo-epidermalen Übergangszone in der humanen Haut ist die wellenförmige Ausbildung von epidermalen Reteleisten, die zapfenartig in die darunter liegende Dermis ragen und mit den dermalen Papillen verzahnt sind. Auf diese Weise wird eine starke Oberflächenvergrößerung erreicht, die die Versorgung epidermaler Zellen und die mechanische Verankerung der Epidermis gewährleistet (Lavker et al. 1987). Die Basalmembran wird hauptsächlich von den Fibroblasten synthetisiert, zu Teilen jedoch auch von den epidermalen Keratinozyten (Smola et al. 1998; Lee, Cho 2005; Marionnet et al. 2006). Die dermo-epidermale Übergangszone ist entscheidend für den strukturellen Aufbau der Haut. Sie beeinflusst den Proliferations- und Differenzierungszustand sowie die Polarität der basalen Keratinozyten und verhindert das Einwandern epidermaler Zellen in die darunter liegende Dermis (Nishiyama et al. 2000; Stetler-Stevenson et al. 1993). Des Weiteren stellt sie eine Diffusionsbarriere dar, durch die Signalmoleküle und Plasmaproteine gefiltert werden, bevor sie das epidermale Kompartiment erreichen.
1.1.3 Die Dermis
Die Dermis besteht primär aus Bindegewebe, welches ihr eine hohe Elastizität und Reißfestigkeit verleiht und besitzt eine Dicke von 2 bis 4 mm. Sie schützt den Körper vor mechanischen Verletzungen, kann große Mengen Wasser binden und unterstützt die Thermoregulation. Im Gegensatz zur Epidermis ist die Dermis stark vaskularisiert und dient daher der Versorgung der darüber liegenden Schichten mit Nährstoffen. Zudem sind in der Dermis zahlreiche Nervenbahnen, Sinneszellen (Mechano-, Druck- und Berührungsrezeptoren) sowie die Hautanhangsgebilde wie Haare, Nägel, Schweiß- und Talgdrüsen lokalisiert. Das Bindegewebe setzt sich aus drei
verschiedenen Strukturelementen zusammen, kollagenen Fasern, Elastinfasern und der Grundsubstanz. Die Zusammensetzung der drei Komponenten, die gemeinsam die Extrazelluläre Matrix bilden, definiert die physikalischen Eigenschaften des Bindegewebes und beeinflusst die Differenzierung, Migration und Proliferation der darin lokalisierten Zellen (Eckes et al. 1999). Bei den zellulären Bestandteilen der Dermis handelt es sich vorrangig um Fibroblasten. Im dermalen Kompartiment finden sich ebenfalls immunologisch aktive Mastzellen, Makrophagen und dermale Dendrozyten (Nestle, Nickoloff 1995; Gonzalez-Ramos et al. 1996). Die Dermis kann aufgrund der Organisation des Bindegewebes in zwei unterschiedliche Bereiche eingeteilt werden, die papilläre und die darunter liegende retikuläre Region. Die Einteilung dieser Zonen ergibt sich hauptsächlich durch die unterschiedliche Dicke und Zusammensetzung der kollagenen Fasern. Die papilläre Dermis, die an die Epidermis grenzt, ist reich an Blutgefäßen und besteht hauptsächlich aus Kollagen Typ III. Die Fasern in dieser Region sind von geringem Durchmesser (0,2 -1 µm), wenig organisiert und lose miteinander verbunden. Die papilläre Dermis enthält einen hohen Anteil an dem Proteoglycan Decorin und besitzt zudem die höchste Dichte an metabolisch aktiven Fibroblasten. Dagegen ist die retikuläre Dermis mit kräftigen, zu dichten Bündeln gepackten Kollagenfibrillen durchzogen, zwischen denen sich größere Mengen an Versican befinden. Die Kollagenfasern, die zum größten Teil aus Typ I bestehen, sind in diesem Bereich parallel zur Hautoberfläche orientiert (Sorrell et al. 2004).
1.1.3.1 Kollagen
Kollagen ist das häufigste Strukturprotein des dermalen Kompartiments. Die Synthese erfolgt zum größten Teil durch die dort lokalisierten Fibroblasten. Die Dermis enthält 10 unterschiedliche Typen von Kollagenen, hauptsächlich jedoch Typ I, III, VI und VII. Die Proteinfamilie der Kollagene besteht derzeit aus insgesamt 28 verschiedenen Mitgliedern. Allen gemeinsam ist ihre Domänenstruktur, die aus α-Polypeptidketten besteht, welche zu einer Tripelhelix angeordnet sind (Myllyharju, Kivirikko 2001; Ricard-Blum, Ruggiero 2005). Das charakteristische Merkmal dieser Polypeptidketten, welches zur Ausbildung der tripelhelikalen Konformation führt, ist ihr repetitives Sequenzmotiv (Gly-X-Y)n. Die einzelnen Mitglieder dieser Proteinfamilie lassen sich
aufgrund ihrer dreidimensionalen Struktur in zwei Klassen unterteilen, die fibrillären und die nicht-fibrillären Kollagene (Gelse et al. 2003; Avery, Bailey 2006). Letztere sind nicht in der Lage, Fasern auszubilden und lassen sich wiederum in mehrere Gruppen einteilen, die Netzbildenden, die Fibrillen-assoziierten und die Filament-bildenden Kollagene. Der erste Schritt der Kollagenproduktion ist die Synthese von
Prokollagenen, welche an ihrem C- und N-Terminus nicht-kollagene Extensionspeptide, die sogenannten Propeptide tragen. Die Prokollagene werden im ER hergestellt, wo die Hydroxylierung der Prolin- und Lysinreste erfolgt. Daran schließt sich die Glykosylierung von Hydroxyllysylresten mit Glucose und Galactose an. Nach Zusammensetzung zu einer Tripelhelix, die durch Disulfidbrücken zwischen Cysteinresten stabilisiert wird, erfolgt die Sekretion in den Extrazellulärraum. Dort werden die Propeptide durch Peptidasen abgespalten und es erfolgt eine Zusammenlagerung der Tripelhelices zu einer Mikrofibrille. In einem letzten Schritt werden durch das Enzym Lysyloxidase Aldehydgruppen eingeführt, die zu Schiff’schen Basen reagieren. Auf diese Weise entstehen Quervernetzungen, die die Kollagenfasern stabilisieren und ihnen eine hohe Reißfestigkeit verleihen.
1.1.3.2 Elastin
Elastin stellt ein fibrilläres Protein dar, welches lediglich einen Anteil von 1-2% in der Dermis besitzt. Dennoch ist es für die Formerhaltung und Elastizität der Haut von besonderer Bedeutung. Elastische Fasern bestehen hauptsächlich aus den Proteinen Elastin und Fibrillin, die beide durch dermale Fibroblasten synthetisiert werden. Dabei bildet Elastin einen amorphen, hydrophoben Kern, der von Fibrillin-haltigen Mikrofibrillen umgeben ist. Diese Elastinfasern formen ein stark verzweigtes Netzwerk, welches in die Grundsubstanz eingebettet ist und das sich von der dermo-epidermalen Übergangszone bis in das Bindegewebe der Subcutis erstreckt. In der papillären Dermis sind die feinen Fasern vertikal angeordnet und umgeben die Blutgefäße sowie die Haarfollikel. In der darunterliegenden retikulären Dermis dagegen sind sie kräftiger und verlaufen parallel zur Epidermis.
1.1.3.3 Grundsubstanz
Die Grundsubstanz zeichnet sich durch einen hohen Gehalt an stark hydrophilen Makromolekülen aus, wobei die wichtigsten molekularen Komponenten polyanionische Proteoglykane sowie Glykoproteine darstellen. Die Proteoglykane, wie beispielsweise Dekorin, Syndecan und Versican, bestehen aus einem Kernprotein, welches zahlreiche Seitenketten aus Glykosaminglykanen trägt. Bei Glycosaminglykanen handelt es sich um lange und unverzweigte Ketten aus Disaccharideinheiten, die durch ihre negative Ladung gekennzeichnet sind. Wichtigste Vertreter der Glykosaminglykane sind die Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Heparansulfat und Dermatansulfat. In der Grundsubstanz der Haut finden sich zudem verschiedene Glykoproteine wie Laminin, Nidogen und Fibronektin. Aufgrund ihrer Zusammensetzung kann die Grundsubstanz große Mengen Wasser binden und dient daher nicht nur als Füllsubstanz für das
Fasergewebe der Haut, sondern ebenfalls als Wasserspeicher. Sie ermöglicht den Transport von Nährstoffen, Gasen und Abbauprodukten und besitzt des Weiteren eine wichtige Funktion bei Zell-Zell- sowie Zell-Matrix-Interaktionen (Welsch, Sobotta 2003). 1.1.4 Dermale Zellen
1.1.4.1 Fibroblasten
Der vorherrschende und zentrale Zelltyp des dermalen Kompartiments, der den größten Teil des Bindegewebes konstituiert und die Physiologie der Haut maßgeblich beeinflusst, ist der Fibroblast, dessen residente Form auch als Fibrozyt bezeichnet wird. Diese beiden Zellformen, die mesenchymalen Ursprungs sind, unterscheiden sich nicht nur in ihrer Mobilität, sondern auch in ihrer Syntheseaktivität sowie der Morphologie. Die stoffwechselaktiven Fibroblasten bilden kurze Zellfortsätze aus, zeichnen sich aufgrund ihrer sekretorischen Funktion durch ein hoch entwickeltes raues ER sowie einen großen Golgi Apparat aus und sind reich an Mitochondrien. Ihr basophiler Zellkern ist oval und enthält einen hohen Anteil Euchromatin. Fibrozyten dagegen sind aufgrund ihrer geringen Syntheseaktivität spindelförmig und besitzen wenig Zytoplasma. Ihr Kern ist reich an Heterochromatin und besitzt ellipsoide Form. Ein residenter Fibrozyt kann sich jedoch wieder in einen Fibroblasten umwandeln und umgekehrt. Die Komponenten der extrazellulären Matrix, wie die meisten Kollagene, Proteoglykane und Elastin, werden vornehmlich von Fibroblasten synthetisiert. Sie interagieren über sogenannte Fokalkontakte mit der sie umgebenden Matrix. Die Verbindung zwischen den Aktinfilamenten im Inneren der Zelle und der extrazellulären Matrix auf ihrer Außenseite erfolgt hauptsächlich über Integrine, spezielle heterodimere Transmembranproteine in der Plasmamembran von fokalen Adhäsionen (Humphries 2000). Sie vermitteln als Oberflächenrezeptoren nicht nur die Interaktion zwischen einzelnen Zellen sondern auch Zell-Matrix-Kontakte und sind zudem an verschiedenen Signaltransduktionswegen beteiligt. Ihre äußere Domäne, bestehend aus je einer α- und β-Untereinheit, bindet an eine Konsensussequenz der extrazellulären Matrix, während der ins Zytoplasma ragende Teil an Aktinfilamente gekoppelt ist.
Abb. 1.4: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines ruhenden Fibrozyten (a) und eines sogenannten aktivierten Fibroblasten im dermalen Bindegewebe menschlicher Haut (b). Der Fibrozyt ist spindelförmig, relativ arm an Organellen und enthält einige Glykogengranula in seinem Zytoplasma. Der Fibroblast besitzt ein stark ausgebildetes raues ER und zahlreiche Mitochondrien, was auf seine Stoffwechselaktivität hindeutet. Maßstab: 3,7 µm
Fibroblasten sind nicht für die Synthese und Organisation, sondern auch für den Abbau der sie umgebenden extrazellulären Matrix verantwortlich. Sie exprimieren eine große Anzahl an Matrixmetalloproteinasen (MMPs) (Page-McCaw et al. 2007). Hierbei handelt es sich um zinkabhängige Endopeptidasen, welche für die Regeneration und Organisation der extrazellulären Matrix essenziell sind (Bode, Maskos 2003). MMPs spielen im Organismus eine wichtige Rolle bei Wachstum und Entwicklung, der Wundheilung, der Angiogenese und zahlreichen weiteren Prozessen (Ravanti, Kahari 2000). Sie lassen sich aufgrund funktioneller und struktureller Unterschiede in fünf Untergruppen einteilen: die Kollagenasen, die Gelatinasen, die Stromelysine, die membranständigen MMPs, die Matrilysine sowie andere MMPs, deren Aktivität über spezifische Gewebeinhibitoren, die TIMPs (tissue inhibitors of MMPs), reguliert wird (Visse, Nagase 2003).
Fibroblasten stehen durch unterschiedliche Signalmoleküle wie Zytokine und Wachstumsfaktoren untereinander sowie mit anderen Zelltypen der Dermis als auch der Epidermis in Verbindung und sind an den parakrinen und autokrinen Vorgängen in der Haut beteiligt (Sorrell et al. 2004; Werner, Smola 2001; Smola et al. 1993; Kondo
a
2000; Moulin 1995; Gilchrest et al. 1983). Die von Fibroblasten sezernierten verschiedenen Faktoren wie KGF, GM-CSF, FGF-10, HGF, EGF und IL-6, haben Einfluss auf die Proliferation von Keratinozyten und spielen eine wichtige Rolle bei der Wundheilung (Gontier et al. 2003; Rubin et al. 1995; Waelti et al. 1992; Boxman et al. 1993; Sato et al. 1995; Breuhahn et al. 2000; Marchese et al. 2001).
Die Dermis enthält eine heterogene Population von Fibroblasten, die aufgrund ihrer Lokalisation in der papillären bzw. retikulären Dermis in zwei Unterpopulationen eingeteilt wurde (Ham, Cormack 1987; Sorrell et al. 2004). Die papillären und retikulären Fibroblasten lassen sich teilweise durch ihre morphologischen und physiologischen Eigenschaften unterschieden. Fibroblasten aus der papillären Dermis besitzen im Vergleich eine höhere Teilungsrate. In Kontraktionsassays zeigten retikuläre Fibroblasten bei Kultivierung in einer Kollagenmatrix eine stärkere Kontraktionsfähigkeit als papilläre Zellen (Schafer et al. 1985). Die beiden Populationen synthetisieren zudem verschiedene Mengen und Arten von Komponenten der extrazellulären Matrix, wie Versican und Decorin, sowie einige Signalmoleküle. So wurden beispielsweise höhere Konzentrationen von KGF-1 und GM-CSF in der papillären Dermis nachgewiesen (Sorrell et al. 2004).
Neue Studien weisen darauf hin, dass in der Dermis mehr als zwei Populationen von Fibroblasten existieren und dass aus einem spezifischen Bereich der Dermis eine Vielzahl von Unterpopulationen isoliert werden kann, die Unterschiede hinsichtlich ihrer Morphologie und Physiologie aufweisen (Sorrell et al. 2007). Dermale Fibroblasten zeigen aber nicht nur in Abhängigkeit von der Lokalisation innerhalb der Dermis Varianzen in ihrem Expressionsmuster, sondern ebenfalls je nach dem anatomischen Areal, aus dem sie stammen (Chang et al. 2002; Rinn et al. 2006).
1.1.4.2 Dermale dendritische Zellen
Eine weitere Gruppe von Zelltypen des dermalen Kompartiments stellen die dermalen Dendrozyten (DD) dar, die dem Knochenmark entstammen. Sie sind vor allem in der superfiziellen Dermis lokalisiert und häufig im Bereich der Blutgefäße mit Mastzellen assoziiert (Sueki et al. 1995; Monteiro et al. 2000). Dermale Dendrozyten wurden, bevor sie 1986 von Headington näher charakterisiert wurden, zumeist als Fibroblasten oder Histiozyten angesehen (Larregina, Falo 2005). Dies ist teilweise auf ihre Fähigkeit zurückzuführen, ihr morphologisches Erscheinungsbild sehr stark verändern zu können (Monteiro et al. 2000). Dermale Dendrozyten zeichnen sich vor allem durch die Expression von Faktor XIIIa aus, einer Transglutaminase, die unter anderem für die Vernetzung von Fibronectin und Fibrin benötigt wird (Headington 1986; Cerio et al. 1989; Stingl 1990). Daher wird dieser Zelltyp als eine spezielle Form von
Gewebsmakrophagen angesehen, dem eine Aufgabe während des Wundheilungsvorgangs zukommt. Dermale Dendrozyten werden zu den Antigen-präsentierenden Zellen der Dermis gezählt, die MHC Klasse II Antigene exprimieren, und entsprechen somit teilweise in ihrer Morphologie und Funktion den epidermalen CD1a-positiven Langerhanszellen (Lappin et al. 1996). Im Gegensatz zu diesen weisen sie jedoch keine, für Langerhanszellen ultrastrukturell charakteristischen, Birbeck-Granula auf. Neben CD1a besitzen sie zahlreiche weitere zelluläre Marker, wie unter anderem den von-Willebrand-Faktor Rezeptor, CD11, CD14 und CD68 (Sontheimer et al. 1989; Gibran et al. 1996; Akagi et al. 1999). Aufgrund der von ihnen exprimierten Oberflächenmarker wurde die Population der dermalen dendritischen Zellen in drei weitere Untergruppen eingeteilt: CD1a- CD14-,CD1a+ CD14- und CD1a- CD14+ (Nestle et al. 1993; Nestle et al. 1994; Deguchi et al. 2002). Sie scheinen bei der Pathogenese von fibrösen Histiozytomen, Xanthogranulomen, Graft-versus-Host-Erkrankungen und inflammatorischen Dermatosen wie Psoriasis und Lichen planus eine Rolle zu spielen. In psoriatischer Haut stimulieren sie u.a. die Proliferation von autologen T-Zellen und induzieren die Ausschüttung von Th1-Zytokinen (Deguchi et al. 2002). Jedoch ist ihre genaue physiologische Funktion in der Haut zurzeit noch weitgehend unklar.
1.1.4.3 Makrophagen
Makrophagen, die auch als Histiozyten bezeichnet werden, entstehen aus Vorläuferzellen im Knochenmark und besitzen zahlreiche Funktionen. Als phagozytierende Zellen können sie bakterielle Krankheitserreger, Fremdkörper und tote Zellen eliminieren. Des Weiteren gehören sie zu den Antigen-präsentierenden Immunzellen und dienen durch die Produktion von Lysozym, Peroxid sowie Superoxid der mikrobiellen Abwehr. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Wundheilung und synthetisieren ebenfalls Wachstumsfaktoren und Zytokine (Welsch, Sobotta 2003).
1.1.4.4 Mastzellen
Mastzellen sind spezielle sekretorische Zellen, die im Knochenmark gebildet werden. Sie kommen ubiquitär im Bindegewebe und in den Schleimhäuten des Körpers vor. Ihr Anteil an dermalen Zellen in der Haut beträgt 2-8%. Mastzellen sind dort als Bindegewebszellen vor allem in der papillären Dermis lokalisiert, wo sie häufig Blutgefäße umgeben. Sie sind an der Initiierung entzündlicher sowie immunologischer Reaktionen, fibrotischen Prozessen und am Gewebeumbau beteiligt und werden morphologisch durch das Vorhandensein zahlreicher metachromatischer Granula charakterisiert, die u.a. Proteasen, Chemokine, Zytokine, Histamin und Heparin
enthalten. Die Freisetzung dieser Mediatoren führt zur allergischen Reaktion sowohl vom Soforttyp als auch vom verzögerten Typ, weswegen ihnen eine regulatorische Funktion bei der Pathogenese allergischer, aber auch inflammatorischer Erkrankungen zugeschrieben wird (Theoharides, Kalogeromitros 2006).
1.1.5 Die Subcutis
Die Subcutis dient als Energiespeicher und Wärmeisolator und enthält sowohl Fett- als auch lockeres Bindegewebe. Sie ist als unterste Hautschicht mit der angrenzenden Muskulatur verbunden. Die Dermis geht ohne Begrenzung in die Subcutis über, wobei beide Gewebe durch zahlreiche Blutgefäße und Nervenbahnen miteinander verbunden sind. Als zelluläre Bestandteile enthält die Subcutis vor allem Adipozyten, die läppchenartig zwischen Septen aus Bindegewebe liegen.
1.2 Die Alterung menschlicher Haut
Altern ist ein äußerst komplexer Prozess, der als irreversible, zeitabhängige Veränderung von Struktur und Funktion lebender Systeme definiert wird. Der Alterungsprozess wird sowohl durch Umweltfaktoren (extrinsische Faktoren) als auch durch die biologischen und genetischen Voraussetzungen eines einzelnen Organismus (intrinsische Faktoren) determiniert. Die Gesamtheit der Faktoren führt im Laufe der Zeit zu kumulativen degenerativen Veränderungen eines Organismus.
Es werden zwei Arten der Hautalterung definiert, die als zwei voneinander unabhängige, biochemisch unterscheidbare Vorgänge angesehen werden (El-Domyati et al. 2002; Rhie et al. 2001; Rittie, Fisher 2002). Die intrinsische oder chronologische Hautalterung und das sogenannte Photoaging lassen sich anhand ihrer morphologischen und histologischen Merkmale charakterisieren (Freinkel 2001).
Die intrinsisch gealterte Haut erscheint dünner, trockener und besitzt weniger Elastizität (Lavker 1979; Lavker, Kligman 1988; Yaar, Gilchrest 2001). Ein deutliches histologisches Merkmal ist die infolge des Abflachens der Reteleisten verdünnte Epidermis (Montagna, Carlisle 1990). Es wird vermutet, dass dies möglicherweise mit einer verminderten Proliferationsrate von epidermalen Stammzellen einhergeht, die sich in den Spitzen der Retezapfen befinden (Lavker, Sun 1982). Im dermalen Kompartiment intrinsisch gealterter Haut nimmt die Zahl der Fibroblasten während des Alterungsprozesses deutlich ab, wobei gleichzeitig die Syntheserate von Kollagen Typ I und III durch die verbleibenden Zellen sinkt (Uitto 1986; Bizot-Foulon et al. 1995; Varani et al. 2001). Des Weiteren kommt es zu einer verstärkten Expression von Matrixmetalloproteinasen, was zu einem vermehrten Abbau der extrazellulären Matrix
führt. Der Gehalt an Elastin in der Dermis nimmt in chronologisch gealterter Haut ebenfalls ab. Die Gesamtheit der Faktoren hat somit eine Umstrukturierung des Bindegewebes im dermalen Kompartiment zur Folge.
UV-Strahlung gilt als die wichtigste exogene Noxe, die am stärksten zur vorzeitigen Alterung menschlicher Haut beiträgt und für das klinische Bild des sogenannten Photoaging verantwortlich ist. UV-gealterte Haut zeigt im Vergleich zu chronologisch gealterter Haut eine vermehrte Faltenbildung, eine stärkere Schlaffheit des Gewebes und eine unregelmäßige Pigmentierung. Histologische als auch ultrastrukturelle Analysen zeigen eine verdickte Epidermis, eine erhöhte Anzahl an Fibroblasten sowie die Akkumulation von elastinhaltigem, amorphem Material in der papillären Dermis (Kligman, Kligman 1986). Diese sogenannte solare Elastose ist ein typisches Merkmal UV-geschädigter Haut und wird in der intrinsisch gealterten Haut nicht beobachtet. Beide Formen der Hautalterung zeigen somit die größten Modifikationen vorrangig in der Dermis.
In der Epidermis geht der Alterungsprozess der Haut mit einer Abnahme der Melanozyten einher. Ihre Zahl sinkt nach dem dreißigsten Lebensjahr innerhalb einer Dekade um 8 bis 20%. Dies führt zu einer ungleichmäßige Pigmentierung gealterter Haut, die sich häufig in Form von hyperpigmentierten Arealen stark sonnenexponierter Körperteile wie den Händen, den Unterarmen und dem Gesicht manifestiert (Gilchrest et al. 1979).
Die sogenannten Altersflecken, klinisch als Lentigo senilis bezeichnet, sind hyperpigmentierte Läsionen, die ab dem fünfzigsten Lebensjahr mit gleicher Inzidenz bei Männern und Frauen auftreten. Altersflecken variieren stark in ihrer Färbung (gelb-braun bis nahezu schwarz) und Größe (einige Millimeter bis zu mehr als einem Zentimeter Durchmesser). Ihre Form ist zumeist unregelmäßig begrenzt und einzelne Läsionen vereingen sich häufig zu größeren Aggregaten. Als histopathologische Merkmale gelten eine Hyperpigmentierung des Stratum basale und eine Verlängerung der Retezapfen, die teilweise auch verzweigt sein können (Hodgson 1963; Holzle 1992; Cario-Andre et al. 2004a; Noblesse et al. 2006). Die molekularen Mechanismen, die diesen Charakteristika zugrunde liegen, sind zurzeit noch weitgehend unverstanden
1.3 Reaktive Sauerstoffspezies und antioxidative Schutzmechanismen Die Theorie der freien Radikale ist einer der bekanntesten Ansätze im Bereich der Alternsforschung, da oxidativer Stress zu den wichtigsten Promotoren des Alterungsprozesses zu zählen scheint (Droge 2002; Valko et al. 2007). Die 1956 von Harman (Harman 1956) begründete Theorie besagt, dass die molekulare Basis des
Alterns auf eine zeitlich bedingte Akkumulation oxidativer Zellschäden durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zurückzuführen ist. ROS stellen eine große Gruppe hochreaktiver Moleküle dar, wie z.B. Singulett-Sauerstoff, Superoxidanionen, Wasserstoffperoxid, Lipidperoxide, Peroxynitrit und Hydroxylradikale, die während aerober zellulärer Stoffwechselprozesse entstehen. Weiterhin sind zahlreiche exogene Faktoren, wie UV-Strahlung, Umweltgifte, Tabakrauch sowie weitere chemische und physikalische Noxen an der Bildung von ROS beteiligt. Unter dem Begriff ROS werden sowohl hochreaktive radikalische, als auch nicht-radikalische Sauerstoffmetabolite zusammengefasst (Halliwell & Gutterdrige 1999).
Bei der Reaktion von freien Radikalen entstehen als Produkte zumeist neue reaktive Moleküle und die Initiation einer solchen Kettenreaktion unterscheidet sie von den nicht-radikalischen Metaboliten (Bickers, Athar 2006). Die Stärke der Reaktivität von freien Radikalen ist indirekt proportional zu ihrer Halbwertszeit, wobei eine instabile Elektronenkonfiguration für die hohe Reaktivität verantwortlich ist (Yu 1994).
Die Addition eines Elektrons zu molekularem Sauerstoff führt zur Bildung des Superoxidanionradikals (O2-). Dieses entsteht als Nebenprodukt hauptsächlich durch
die unvollständige Reduktion von Sauerstoff in der mitochondrialen Atmungskette. Des Weiteren sind verschiedene Enzymsysteme an der Bildung beteiligt, wie z.B. Xanthinoxidasen, NO-Synthasen, Zyklooxygenasen, D-Aminosäureoxidasen und NADPH-Oxidasen (Frei 1994). Bei Letzteren handelt es sich um Transmembranproteine, die Elektronen über Zell- sowie Organellenmembranen transportieren, welche der Reduktion von Sauerstoff zu Superoxid dienen.
In Phagozyten ist die NADPH-Oxidase das wichtigste Enzym bei der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, die die Abwehr von Pathogenen ermöglichen. Die phagozytäre NADPH Oxidase besteht aus fünf Proteinkomponenten, den drei zytosolischen Untereinheiten p40phox, p47phox und p67phox sowie dem membranständigen Cytochrom
b558, welches sich wiederum aus gp91phox (NOX2) und p22phox zusammensetzt (Ray,
Shah 2005; Babior et al. 2002). Nach Aktivierung der Phagozyten durch entsprechende Stimuli erfolgt die Phosphorylierung der zytosolischen Komponenten und die anschließende Assoziation mit den transmembranständigen Flavocytochrom b-Anteilen (Abb. 1.5). Dieser Komplex katalysiert den Transfer eines Elektrons auf molekularen Sauerstoff, welches zur Bildung eines Superoxidanions führt. Die Reaktion erfolgt durch die gp91phox Untereinheit und benötigt NADPH als Elektronendonor. In den
letzten Jahren wurden ebenfalls in zahlreichen nicht-phagozytierenden Zellen gp91phox
-Homologe identifiziert (Serrander et al. 2007). Zurzeit besteht die sogenannte NOX-Genfamilie aus sieben humanen Homologen, die der NADPH-Oxidase gp91phox (NOX2)
gebildeten Menge an ROS unterscheiden und auf andere Weise reguliert werden (Bedard, Krause 2007). Ihre Aktivität wird unter anderem durch Zytokine, Wachstumsfaktoren und hohe Glukosekonzentrationen beeinflusst (Takeya et al. 2006).
Abb. 1.5:
A) Die phagozytäre NADPH Oxidase besteht aus verschiede-nen membranständigen (NOX2, p22phox) und zytoplasmatischen Komponenten (p40phox, p47phox, p67phox und rac).
B) Die Aktivierung der Phago-zyten führt zu einer Assoziation der Untereinheiten an der Plasma- bzw. Phagosomen-membran. Der aktive Enzym-komplex überträgt anschließend Elektronen von zytosolischem NADPH auf Sauerstoff im luminalen bzw. extrazellulären Raum (Bedard, Krause 2007).
Nicht-enzymatisch können Superoxidanionen über die Autooxidation von Thiolen, Catecholaminen und Übergangsmetallen generiert werden. O2- stellt ein primäres
Radikal dar, das in einer Kettenreaktion mit anderen Molekülen zur Bildung zahlreicher Sekundärmetabolite führen kann (McIntyre et al. 1999). Durch die negative Ladung ist es jedoch nicht membrangängig und verbleibt daher in den zellulären Kompartimenten, in denen es entsteht.
Das Hydroxylradikal (OH-) ist extrem kurzlebig und stellt die aggressivste Form der ROS dar, da es aufgrund seiner extrem kurzen Halbwertszeit direkt am Entstehungsort mit anderen Molekülen reagiert. Es kann in Anwesenheit von Übergangsmetallen wie Eisen- oder Kupferionen in der Fenton- oder Haber-Weiss-Reaktion entstehen und ist hauptverantwortlich für die Bildung von Lipidperoxiden (Halliwell, Gutteridge 1984a). Fenton-Reaktion: •O2- + Fe3+ O2 + Fe2+ Fe2+ + H 2O2 Fe3+ + HO• + OH
-Haber-Weiss-Reaktion:
Singulett-Sauerstoff (1O2) stellt den angeregten Zustand des Triplett-Sauerstoffs dar.
Es handelt sich um eine nicht-radikalische Spezies, die sich durch einen hohen Energiegehalt auszeichnet und daher eine hohe Reaktivität besitzt. Singulett-Sauerstoff wird entweder durch chemische Anregung oder aber durch die photochemische Anregung eines Chromophors gebildet. Da es in der Lage ist, in Membranen über weite Strecken zu diffundieren, spielt es ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Lipidperoxidation.
Wasserstoffperoxid (H2O2) entsteht hauptsächlich durch die enzymatische Dismutation
von O2- durch die Superoxiddismutase (SOD). Das ungeladene H2O2 ist zwar schwach
reaktiv, kann jedoch Membranen permeieren und über die Fenton-Reaktion zum hochreaktiven Hydroxylradikal umgesetzt werden.
Kommt es in einem Organismus zu einem Ungleichgewicht zwischen der Entstehung von ROS und ihrem Abbau, führt dies zur Bildung des sogenannten oxidativen Stresses. Ein Überschuss an ROS kann sämtliche biologische Makromoleküle schädigen und führt zur Generierung von Lipidperoxiden, mutierter DNA und inaktiven Proteinen (Löffler, Petrides 1998). Daher wurden ROS zumeist als zytotoxisch eingestuft und mit zahlreichen altersbedingten Erkrankungen wie Diabetes, Krebs, Arteriosklerose, Bluthochdruck, Alzheimer und Parkinson in Verbindung gebracht (Finkel, Holbrook 2000; Droge 2002; Halliwell, Gutteridge 1990; Harrison et al. 2003). Im Verlauf der letzten Jahre zeigten jedoch verschiedene Untersuchungen, dass reaktive Sauerstoffspezies nicht nur toxische Nebenprodukte darstellen, sondern ebenfalls als Vermittler wichtiger Signaltransduktionswege fungieren (Rhee et al. 2000; Valko et al. 2007; Esposito et al. 2004). Um diese Prozesse zu kontrollieren und die Entstehung von oxidativem Stress zu verhindern, muss die Aufrechterhaltung des zellulären Redox-Gleichgewichts einer sehr genauen Regulation unterliegen (Droge 2002).
Die Haut besitzt eine Reihe von Enzymsystemen und nicht-enzymatischen Antioxidanzien zur Verteidigung gegen oxidativen Stress. Eines der wichtigsten nicht-enzymatischen löslichen Antioxidanzien stellt die reduzierte Form des Glutathion (GSH) dar, welches als Substrat der Glutathion-Reduktase dient. Dieses intrazelluläre Thiol ist in millimolaren Konzentrationen in nahezu allen Zellen vorhanden und trägt maßgeblich zur Abwehr reaktiver Sauerstoffspezies bei. Es wechselt zwischen der
H2O2 + •O2 Metallkatalysator O 2 + HO• + OH
-reduzierten Thiolform (GSH) und der oxidierten Disulfidform (GSSG), in der zwei Tripeptide über eine Disulfidbrücke verbunden sind.
Vitamin C zählt wie GSH zu den intrazellulären hydrophilen Antioxidanzien. Als lipophile Antioxidanzien sind Vitamin E und Coenzym Q10 zu nennen, wobei letzteres membrangebunden vorliegt und durch Vitamin C regeneriert wird. Q10 spielt als ein lipidlösliches Redoxmolekül eine wichtige Rolle in der Atmungskette. Beide Antioxidanzien besitzen ähnliche Funktionen, da sie die Lipidperoxidation verhindern. Ein wesentlich effektiverer Schutz vor ROS wird jedoch durch die enzymatischen Antioxidant-Systeme gewährleistet. Hierzu gehört die Superoxiddismutase, die als einziges Enzym die Dismutation von O2- zu H2O2katalysiert. Diese Reaktion läuft um
das tausendfache schneller ab als die spontane Dismutation und wird lediglich durch die Diffusionsgeschwindigkeit vom Substrat zum Enzym limitiert (Halliwell, Gutteridge 1984b). Bei Säugetieren können drei verschiedene Formen der SOD unterschieden werden. Die Kupfer-Zink-SOD (CuZnSOD) wird im Zytoplasma exprimiert, während die Mangan-SOD (MnSOD) ausschließlich in Mitochondrien lokalisiert ist. Die dritte Form stellt die extrazelluläre SOD (ecSOD) dar, die von den Zellen in den Extrazellulärraum sezerniert wird und dort an die EZM bindet (Marklund 1990; Fattman et al. 2003). Das entstanden H2O2 wird zum größten Teil in den Peroxisomen durch die Katalase zu
H2O und O2 umgesetzt. Die Metabolisierung des nicht-peroxisomalen H2O2 erfolgt über
das Glutathion-System, welches aus den Enzymen Glutathion-Peroxidase, Reduktase und Transferase besteht. Dieses Enzymsystem sorgt ebenfalls für die Regeneration des oxidierten Glutathions.
Neben den beschriebenen antioxidativen Enzymsystemen existieren weitere Proteine, die durch Oxidanzien induziert werden, und ebenfalls dem Schutz vor oxidativem Stress dienen. Die Hämoxygenase 1 (HO-1), die auch als Hitzeschockprotein 32 bezeichnet wird, katalysiert den initialen und umsatzlimitierenden Schritt des Häm-Abbaus. Dieses hochkonservierte Protein bewirkt die Degradation von Häm unter Freisetzung von Fe2+ und der Bildung von Kohlenmonoxid zum linearen Tetrapyrrol
Biliverdin. Biliverdin wird in einem weiteren Schritt durch die Biliverdin Reduktase zu Bilirubin umgesetzt, welches antioxidative Eigenschaften besitzt (Matsumoto et al. 2006). Die Hämoxygenase1 erfährt in den meisten eukaryontischen Zellen durch zahlreiche verschiedene Stressoren und Oxidanzien wie z.B. UVA-Strahlung, H2O2,
divalente Metallionen und andere Agenzien eine starke Induktion durch transkriptionelle Aktivierung (Prawan et al. 2005). In Hautfibroblasten führt UVA-Bestrahlung und H2O2 zur Entstehung freier Radikale, die zu einer vermehrten
Expression der HO-1 führen (Tyrrell 1999; Panchenko et al. 2000). Die HO-1 stellt ein Enzym mit antioxidativen Eigenschaften dar, dem eine wichtige zytoprotektive Funktion
zukommt (Poss, Tonegawa 1997). In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von HO-1 in Zellen vor oxidativer Schädigung schützt und anti-inflammatorisch wirkt (Wijayanti et al. 2005).
Abb. 1.6:
Schematische Darstellung des Reaktionsmechanismus der Häm-oxygenase 1
1.4 Advanced Glycation End Products
Durch die nicht-enzymatische Reaktion reduzierender Zucker mit den primären Aminogruppen von Proteinen entstehen die sogenannten Advanced Glycation End Products (AGEs), bei denen es sich um eine Gruppe höchst komplexer, heterogener Addukte handelt. (Miyata et al. 1996; Ulrich, Cerami 2001). Diese Reaktion wurde bereits um 1912 von Maillard beschrieben, welcher entdeckte, dass während des Kochens die Aminosäuren von Proteinen mit Zuckern zu Produkten reagieren, die durch Umlagerung, Dehydratation und Fragmentierung stabile braune Pigmente, die sogenannten Melanoidine, bilden. Dieser Vorgang wird daher nach seinem Entdecker als Maillard-Reaktion oder auch als nicht-enzymatische Glykosylierung bzw. Glycierung bezeichnet. Die Bildung von AGEs erfolgt durch einen über einen Zeitraum mehrerer Wochen andauernden chemischen Vorgang, der in zwei Stufen eingeteilt werden kann. Die Initiation dieses Prozesses wird durch eine nukleophile Addition zwischen der freien ε-Aminogruppe des Proteins und der Carbonylgruppe des Zuckers bedingt, wobei es zur Bildung labiler Schiff’scher Basen kommt. Die Stärke der Glycierungsreaktion ist zu Beginn zum größten Teil von der Konzentration des Zuckers abhängig (Cerami 1985). Nach mehreren Tagen lagern sich die Schiff’schen Basen zu den stabileren Amadori-Produkten um, bei denen es sich um Ketoamine handelt. Diese erfahren im weiteren Verlauf komplexe Umordnungen durch Oxidations-, Kondensations- oder Dehydratationsreaktionen und werden teilweise irreversibel untereinander oder mit anderen Proteinen quervernetzt (Singh et al. 2001).
Abb. 1.7: Schematische Darstellung der Entstehung von Advanced Glycation End Products. In der frühen Phase bilden freie oder gebundene Aminosäuren mit Glucose reversible Schiff’sche Basen, die zu Amadori-Produkten weiterreagieren. Im Verlauf von Wochen entstehen verschiedenartige stabile Advanced Glycation End Products, die quervernetzt sein können (modifiziert nach Ahmed 2005).
Aufgrund der sehr komplexen Reaktionsmechanismen entsteht eine Vielzahl gelb-brauner Substanzen, die in drei verschiedene Klassen unterteilt werden können: die fluoreszierenden und quervernetzenden AGEs, die nicht-fluoreszierenden und quervernetzenden AGEs sowie die nicht-quervernetzenden AGEs (Ahmed 2005). Einige Beispiele für die unterschiedlichen Klassen von AGEs sind in Abb. 1.8 dargestellt.
Carboxymethyllysin (CML) ist das am besten charakterisierte AGE und entsteht einerseits durch die oxidative Spaltung von Amadori-Produkten unter der Beteiligung von Hydroxylradikalen und Übergangsmetallen, wie Fe2+-Ionen. Andererseits kann es
über die Reaktion von Lysin mit Glyoxal, welches ein frühes Maillard-Reaktionsprodukt darstellt, generiert werden (Ahmed et al. 1986; Reddy et al. 1995). Pentosidin, ein weiteres gut beschriebenes AGE, ist aufgrund seiner chemischen Eigenschaften in der Lage, Aminosäuren querzuvernetzen (Dyer et al. 1991; Grandhee, Monnier 1991; Sell, Monnier 1989).
Abb. 1.8: Bei der nicht-enzymatischen Glykosylierung entstehen zahlreiche heterogene Reaktionsprodukte mit unterschiedlichen Charakteristika. Die Abbildung zeigt die chemische Struktur einiger Advanced Glycation End Products (AGEs), die aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften in fluoreszierende und quervernetzende (a), nicht-fluoreszierende und quervernetzende (b) und nicht-quervernetzende (c) AGEs eingeteilt werden können (modifiziert nach Ahmed 2005).
AGEs wurden in verschiedenen menschlichen Geweben, Plasma und Urin nachgewiesen. Hämoglobin war eines der ersten Proteine, bei dem eine Modifikation mit AGEs ermittelt wurde (Bunn et al. 1975). Aufgrund eines erhöhten Blutzuckerspiegels konnte bei Patienten mit Diabetes mellitus im Vergleich zu Nicht-Diabetikern eine erhöhte Menge an AGEs im Serum gemessen werden (Makita et al. 1991; Nawroth et al. 1999). Maillard-Produkte wurden ebenfalls mit verschiedenen degenerativen Erkrankungen wie z.B. Alzheimer sowie dem Alterungsprozess (Chiarelli et al. 1999; Lee, Cerami 1992; Munch et al. 1997) in Zusammenhang gebracht.
Da die Bildung von AGEs über einen Zeitraum von mehreren Wochen erfolgt, sind vor allem langlebige Proteine mit einer langsamen Umsatzrate einer Modifikation durch diese Substanzen unterworfen. Die Quervernetzung durch AGEs, die zu einer strukturellen und funktionellen Veränderung von Proteinen führt, scheint die Hauptursache für ihre schädigende Wirkung zu sein. Die modifizierten Proteine können in vivo nicht durch entsprechende Enzyme abgebaut werden und akkumulieren intra-
als auch extrazellulär (Ahmed et al. 1997; Monnier, Sell 2006; Furber 2006; Kueper et al. 2007).
Im Bereich der Haut erfahren vor allem die Strukturproteine des Bindegewebes sowie der Basalmembran Modifikationen durch AGEs (Vlassara, Bucala 1996). Die nicht-enzymatische Quervernetzung von Kollagenen führt zu einer größeren Steifheit der Proteine und verändert auf diese Weise die Struktur des Bindegewebes. Vor allem in der Dermis stark sonnenexponierter Areale der Haut kommt es zu einer vermehrten Modifikation der elastischen Fasern durch Carboxymethyllysin (Mizutari et al. 1997). Ob AGEs lediglich die Folge von pathophysiologischen Zuständen und des Alterungsprozesses sind oder ob sie ursächlich zur Entstehung von Krankheitsbildern beitragen wird noch diskutiert.
Die intrazelluläre Wirkung von AGEs kann durch unspezifische, chemische Reaktionen erfolgen, die die Bildung von oxidativem Stress initiieren (Loske et al. 1998). Der oxidative Stress generiert in der Folge zelluläre Schäden, die Proteine, Lipide und DNA umfassen und zu ihrer Dysfunktion führen. Die Entstehung von AGEs wird wiederum durch oxidativen Stress begünstigt, wodurch ein Circulus vitiosus entsteht.
Die Wirkung von AGEs kann ebenfalls über eine spezifische Bindung an Rezeptoren vermittelt werden. In der Literatur wurden verschiedene Rezeptoren beschrieben, wie z.B. RAGE, Galectin-3, R1 (OST-48), R2 (80K-H), CD36 und ScR II (Scavenger Receptor II), durch die eine Interaktion von AGEs mit verschiedenen Zellen erfolgen kann und die teilweise zu einer Internalisierung der gebundenen Substanzen führt (Thornalley 2002). Eine solche Interaktion von AGEs mit den oben aufgeführten Rezeptoren bewirkt die zelluläre Aktivierung unterschiedlicher Signaltrans-duktionswege, die verstärkte Expression von Proteinen der extrazellulären Matrix und die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (Thornalley 1998).
RAGE ist der am besten charakterisierte Rezeptor für AGEs. Er gehört zur Familie der Immunglobuline und wird in verschiedenen Zelltypen wie z.B. Endothelzellen, Herzmuskelzellen, Monozyten und Neuronen exprimiert. RAGE interagiert neben AGEs mit verschiedenen anderen Liganden, darunter S100/Calgranulin, Amyloiden und Amphoterin. Die Bindung von AGEs an RAGE führt zu einer Translokation des Transkriptionsfaktors NFκB in den Zellkern, wo dieser die Expression proinflammatorischer Zytokine vermittelt (Schmidt et al. 2001). Die Expression von RAGE korreliert mit der vermehrten Bildung von RAGE-Liganden im Verlauf chronischer Erkrankungen, aber auch bei Alterungsprozessen. Die sekretorische Form von RAGE (sRAGE), die durch alternatives Spleißen entsteht, kann an verschiedene RAGE-Liganden binden und auf diese Weise ihre Interaktion mit dem membranständigen Rezeptor inhibieren (Yonekura et al. 2003). In der Literatur wurde
bereits beschrieben, dass die lösliche Form von RAGE mit glycierten extrazellulären Proteinen aber auch Matrixproteinen interagiert und auf diese Weise eine Bindung mit dem membranständigen Rezeptor auf den Zielzellen verhindert (Schmidt et al. 2001). Diese lösliche Form fungiert somit als scavenger receptor, der die Epitope glycierter Proteine maskiert und auf diese Weise eine Bindung von AGEs an die Zielzellen mittels RAGE unterbindet oder zumindest erschwert. Eine solche Interaktion von sRAGE besitzt eine protektive Wirkung, da die Aktivierung von zumeist degradativen Prozessen in den Zellen unterdrückt wird (Geroldi et al. 2006; Sakurai et al. 2003).
1.5 Fragestellung
Die menschliche Haut unterliegt im Alter zahlreichen Modifikationen, wobei die veränderte Pigmentierung in Form sogenannter Altersflecken ein augenfälliges Charakteristikum darstellt. Über die pathogenetischen Ursachen und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, die zur Bildung dieser hyperpigmentierten Läsionen führen, ist wenig bekannt. Die bereits in der Literatur dokumentierten Analysen beschränken sich zumeist auf die epidermalen Zellschichten.
Im Rahmen dieser Arbeit sollten senile Lentigines im Vergleich zu periläsionaler Haut von 12 Probanden systematisch morphologisch untersucht werden. Durch histologische und elektronenmikroskopische Analysen von Biopsiematerial sollte eine Hypothese für die Entstehung der Lentigo senilis erarbeitet und diese im weiteren Verlauf mit verschiedenen immunhistochemischen sowie biochemischen Untersuchungen überprüft werden.
AGEs akkumulieren im Laufe des Lebens sowohl intra- als auch extrazellulär und wurden bereits im Plasma sowie in unterschiedlichen Gewebe- und Zelltypen nachgewiesen. Im Laufe der vergangenen Jahre sind AGEs als pathogene Risikofaktoren bei einer Vielzahl von Erkrankungen wie Diabetes, Alzheimer sowie bei Alterungsprozessen in den Blickpunkt des Interesses gerückt. Ihre biochemische sowie physiologische bzw. pathophysiologische Wirkung ist zurzeit jedoch noch unzureichend charakterisiert. Die altersabhängige Akkumulation von AGEs in der Haut und dort vor allem im dermalen Kompartiment, welches Proteine mit einer geringen Umsatzrate wie z.B. Kollagen und Elastin enthält, wurde bereits mehrfach beschrieben. Diese glycierten Proteine sind dort wahrscheinlich nicht nur Indikatoren des Alterungsprozesses sondern auch Promotoren der Hautalterung und stellen somit potenzielle Faktoren dar, die Einfluss auf die Entstehung der Lentigo senilis haben könnten. Die intrazelluläre Wirkung von AGEs kann dabei einerseits durch unspezifische, chemische Reaktionen, die zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies wie Hydrogenperoxid führen, bedingt sein. Möglich ist jedoch auch die Bindung von AGEs an spezifische Rezeptoren wie z.B. RAGE oder Galectin-3, welche eine Veränderung des Expressionsmusters in den Zellen zur Folge hätte. Prozesse die hierdurch beeinflusst werden könnten, sind z.B. Proliferation, Apoptose, verschiedene zelluläre Synthese- sowie Abbauprozesse oder die Adhäsion.
Diese Arbeit sollte die Veränderungen der Altershaut im Zusammenhang mit der biochemischen Wirkung von AGEs auf das dermale Kompartiment und insbesondere auf den zentralen Zelltyp dieser Struktur, den Fibroblasten, analysieren.
2. Material und Methoden
2.1 Abkürzungsverzeichnisa.d. aqua destillata
Abb. Abbildung
ABTS 2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazolin-6-ulfonsäure)
AEC 3-Amino-9-Ethylcarbozol
AGE Advanced glycation end product
APS Ammoniumpersulfat AS Aminosäure ATP Adenosintriphosphat BM Basalmembran bp Basenpaare BrdU Bromo-Desoxyuridin
BSA bovines Serumalbumin
°C Grad Celsius
C Carboxy
ca. circa
CD Cluster of differentiation
cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure
(com-plementary DNA) cm2 Quadratzentimeter CTP Cytidintriphosphat CML Carboxymethyllysin d Desoxy Da Dalton
DMEM Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleotide DOPA Dihydroxyphenylalanin DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendinitrilotetraacetat
EGF Epidermal growth factor
EGTA Ethylenglycoldinitrilotetraacetat
EZM Extrazelluläre Matrix
FAD Flavin-Adenin-Dinukleotid
FCS Fötales Kälberserum
FGF Fibroblast growth factor
FITC Fluoreszeinisothiocyanat
GM-CSF Granulocyte monocyte colony stimulating factor
GSH γ-L-Glutamyl-L-cysteinylglycin/Glutathion
GTP Guanosintriphosphat
h Stunde
HGF Hepatocyte growth factor
HEPES
Na-N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N-2-ethansul-fonat
IL Interleukin
k Kilo
KGF keratinocyte growth factor
LB Luria Bertani
Lsg. Lösung
m Meter
m Milli
M Molar
MHC Major histocompatibility complex
min Minuten
ml Milliliter
MMP Matrixmetalloproteinase
mRNA Messenger Ribonukleinsäure
n Nano
NADPH Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat
NO Stickstoffmonoxid
NOX NADPH oxidase
NTP Nukleosidtriphosphat
p.A. Pro Analysis
PAA Polyacrylamid
PBS Phosphat gepufferte Kochsalzlösung
PCR Polymerasekettenreaktion
PFA Paraformaldehyd
Phox phagocyte oxidase
RAGE Receptor of advanced glycation end products
REM Rasterelektronenmikroskop
RNA Ribonukleinsäure
ROS Reactive oxygen species
RPM Umdrehungen pro Minute
RT Raumtemperatur
SCF Stem cell factor
SDS Natriumdodecylsulfat
sec Sekunden
SOD Superoxiddismutase
TAC transient amplifying cell
TEMED Tetramethylethyldiamin
TIMP tissue inhibitors of MMPs
TRIS Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan
TYRP Tyrosinase related protein
U Unit
ü.N. über Nacht
UV Ultraviolett
v/v Volumen pro Volumen
w/v Gewicht pro Volumen
w/w Gewicht pro Gewicht
z.B. Zum Beispiel
2.2 Material
2.2.1 Firmenverzeichnis
Active Motif USA Sarstedt Nümbrecht
Aldrich Deisenhofen Schleicher & Schuell Dassel Amersham Life Science Braunschweig Seromed Berlin
Bachofer Reutlingen Serva Heidelberg
Bayer Leverkusen Sigma Deisenhofen
Beckmann USA Sorvall Bad Homburg
Binder Tuttlingen Stratagene Heidelberg
BioCat Heidelberg Zeiss Oberkochen
Biomol Hamburg Biometra Göttingen Biorad München BioWhittaker USA Boehringer Mannheim Braun Melsungen Calbiochem Schwalbach Clontech USA Dianova Hamburg DIFCO USA Falcon BD Heidelberg Fluka Neu-Ulm FUJI-Film Düsseldorf
Genomed Bad Oenhausen
Gibco Karlsruhe Gössner Hamburg Greiner Frickenhausen Heraeus Düsseldorf Hoechst Frankfurt Invitrogen Karlsruhe Kontron Schweiz
Kühn und Baier Nidderau
Leitz Wetzlar MAGV GmbH Rabenau Memmert Rabenau-Londorf Menzel-Gläser Braunschweig Merck Darmstadt Messer-Griesheim Düsseldorf Metabion Martinsried Milipore Eschborn
Molecular Probes USA New Brunswiek SCI USA New England Biolab Schwalbach
Novagen USA Olympus Hamburg Pharmingen Kanada Promega Mannheim Peqlab Erlangen Pierce USA Plano Wetzlar Qiagen Hilden
Riedel de Haen Niederlande
Roche Mannheim
Roth Karlsruhe
2.2.2 Geräte
Zentrifugen: Kühlzentrifuge 3K30 Sigma
Tischzentrifuge Biofuge pico (Hereaus) Kühlzentrifuge J2-21 (Beckman) Kühlzentrifuge J6 (Beckman)
Zentrifuge Hermle Z364 (MAGV GmbH) Ultrazentrifuge Combi plus (Sorvall)
Mikroskope Fluoreszenzmikroskop Olympus BX 61
Fluoreszenzmikroskop Axiovert 100 (Zeiss) Transmissionselektronenmikroskop EM 109 (Zeiss)
Rasterelektronenmikroskop REM-ISI-SX-30
(Leitz)
Photometer Spektralphotometer Hitachi U-2000
Fluoreszenzphotometer SFM 25 Kont Mikrotiterplattenreader Infinite™ 200 (Tecan)
Thermocycler Personal Cycler UNO-Thermoblock (Biometra)
Vortexer Vortex Genie 2 ™ (Bender und Hobein)
Magnetrührer Typ Heidolph MR 2000 (MAGV GmbH)
Einbettautomat Microm
Mikrotom HM 400 (Microm)
Ultramikrotom OM U2 (Reichert)
Sputter Coater S150 (Edwards)
Real time cycler AbiPrism 7000 Sequence detection system
(Applied Biosystems)
Wasserbad Kochwasserbad (Memmert)
Netzgeräte Power Pack P25 (Biometra)
2197 Power supply (LKB Bromma)
Blotkammer SDE-Elektroblotting System (Peqlab)
Inkubatoren CO2-begasbarer Brutschrank Zellkultur (Integra)
Brutschrank für die Bakterienkultur (Memmert) Brutschrank für Paraffinbäder (Jouan)
Schüttelinkubator (New Brunswick) 50◦C Wärmeschrank (Binder)
Autoklaven Laborautoklav GLA 40-1 (Gössner)
Reinstwasseranlage Clear Millipore
Sterilbank NuAire DH Alphaflow (Integra)
Färbeautomat Histologie Tech-Mate Horizon
UV Transilluminator CN6 1.4 Raytest
Potter B.Braun
Imagingsystem Chemi-Lux (Intas)
2.2.3 Plastikware
Alle Plastikwaren und Reaktionsgefäße wurden von den Firmen Becton-Dickinson (Franklin Lakes, NJ), Greiner (Frickenhausen), Sarstedt (Nümbrecht), Corning (Schiphol-Rijk, NE) und Eppendorf (Hamburg) bezogen.
2.2.4 Chemikalien
Alle Chemikalien wurden, wenn nicht anders vermerkt, in p.A.-Qualität von den unter Punkt 2.1.2 angegebenen Firmen bezogen
2.2.5 siRNA
siRNA siRNA ID Nummer Ambion
HO-1_a 11242 HO-1_b 11252 HO-1_c 11056 NOX4_a 117540 NOX4_b 118807 NOX4_c 117539
Silencer® Negative Control #1 AM4611
Die verwendeten siRNA Oligonukleotide wurden als doppelsträngige Oligonukleotide von der Fa. Ambion (Applied Biosystems, Darmstadt) in Standardqualität hergestellt. 2.2.6 Plasmide
pCI-neo Expressionsvektor für höhere eukaryonte Zellen (Promega, Mannheim) pEGFP-N1 (Clontech, France)
HMOX1 (human Heme oxygenase 1) full length cDNA clone IRAUp969F1147D Vektor pOTB7 (RZPD, Berlin)
