Klonierung spezifischer DNA-Fragmente

Zur Klonierung von spezifischen DNA-Fragmenten werden diese zunächst über geeignete Restriktionsschnittstellen in bakterielle Vektoren eingefügt und anschließend in kompetente Bakterien eingebracht. Dies ermöglicht die Vermehrung und eine anschließende Aufreinigung des Vektors in größerem Maßstab.

2.3.8.9.1 Restriktionsverdau

Bei Restriktionsenzymen handelt es sich um Endonukleasen, die doppelsträngige DNA sequenzspezifisch durch Hydrolyse spalten können, wobei entweder glatte oder überhängende Enden entstehen. Mit Hilfe eines Restriktionsverdaus lassen sich beliebige DNA-Moleküle in definierte Fragmente zerlegen.

Die verwendeten Restriktionsenzyme und Puffer wurden von NEB und Fermentas bezogen und die Temperatur- und Pufferbedingungen nach den Angaben des Herstellers für jedes Enzym entsprechend gewählt. Für einen analytischen Verdau wurde 1 µg DNA in einem Gesamtvolumen von 20 µl eingesetzt, wohingegen ein präparativer Verdau mit 10 µg DNA in einem 100 µl-Ansatz erfolgte. Die Menge des verwendeten Enzyms sollte in einem Ansatz nicht mehr als 10 % des Gesamtvolumens übersteigen. Ein Restriktionsansatz enthielt des Weiteren jeweils ein Zehntel 10-fach Restriktionspuffer, sowie BSA (1 mg/ml, NEB) und DTT (10 mM). Der Ansatz wurde mit a.d auf das vorgegebene Gesamtvolumen ergänzt und 2 h bei einem analytischen Verdau bzw. 6 h bei einem präparativen Verdau bei 37°C inkubiert. Die Vollständigkeit der Reaktion wurde anschließend durch die Auftrennung der DNA-Fragmente in einem Agarosegel kontrolliert.

2.3.8.9.2 Dephosphorylierung von geschnittenen Vektoren

Wurde ein Vektor zur Klonierung nur mit einem Restriktionsenzym geschnitten, so erfolgte eine Dephosphorylierung der Enden durch eine Behandlung mit alkalischer Phosphatase. Dies verhindert eine Religation des Vektors ohne das zu klonierende DNA-Fragment. Der präparative Restriktionsverdau wurde zunächst hitzedeaktiviert und anschließend mit 100 µl 50 mM Tris/HCl pH 8 auf 200 µl aufgefüllt. Anschließend wurde 1 µl alkalische Phosphatase (1U/µl; NEB) zugesetzt und der Ansatz 30 min bei 37°C inkubiert. Das Abstoppen der Reaktion erfolgte durch eine Zugabe von 4 µl 0,5 M EDTA. Nachfolgend wurde der Restriktionsansatz auf ein Agarosegel aufgetragen, die DNA Fragmente aufgetrennt und wie unter Punkt 2.3.8.9.4 beschrieben, isoliert.

2.3.8.9.3 Überführung überstehender Enden in glatte Enden

Viele Restriktionsenzyme erzeugen kohäsive Enden mit einem 5'- oder 3'-Überhang.

Benötigt man für eine Ligation glatte Enden, so können 5'-DNA-Überhänge mit Hilfe des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase aufgefüllt werden. Für die Reaktion wurde 1 µg DNA verwendet. Des Weiteren enthielt der Ansatz 2 µl 10x Klenow Fragment Reaction Buffer (Fermentas), 2 µl dNTP Mix (0,5 mM, Fermentas) und 1 µl Klenow Fragment (3 U/µl, Fermentas). Das Volumen wurde mit Nuklease-freiem a.d.

auf 20 µl ergänzt, die Probe gemischt, kurz abzentrifugiert und 10 min bei 37°C inkubiert. Das Enzym wurde anschließend durch eine Inkubation bei 75°C für 10 min inaktiviert.

2.3.8.9.4 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Für die Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurden das QIAquick Kit (Qiagen) verwendet. Hierbei wird die Agarose in Lösung gebracht und die dabei freigesetzten Nukleinsäuren an eine Säulenmatrix gebunden. Die Elution der DNA erfolgt anschließend mit einer Lösung mit geringerer Salzkonzentration. Das aufzureinigende DNA-Fragment wurde aus einem 1%-igen Agarosegel auf dem UV-Tisch ausgeschnitten und in ein 15 ml Röhrchen überführt. Das Gelstück wurde gewogen und mit dem dreifachen Volumen QG-Puffer versetzt. Es erfolgte eine Inkubation über 10 min bei 50°C, um die Gelmatrix aufzulösen, wobei der Ansatz im Abstand von 2-3 min durch Vortexen kräftig gemischt wurde. Anschließend wurde der vollständig gelöste Ansatz auf eine QIAquick Säule aufgetragen. Nach einem Zentrifugationsschritt von 1 min bei 13000 rpm wurde der Durchfluß verworfen und die Säule mit QG Puffer beladen. Nach einer einminütigen Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit wurde der Durchfluss verworfen und es erfolgte ein weiterer Waschschritt mit PE Puffer. Nach dem Verwerfen des Durchflusses wurden 30 µl EB Puffer in die Mitte der Säule pipettiert und diese 1 min bei RT inkubiert. Die Elution der DNA erfolgte durch eine Zentrifugation für 1 min bei 13000 rpm. Die Ausbeute der DNA-Isolierung wurde auf einem Agarosegel kontrolliert und das Eluat bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.

2.3.8.9.5 Ligation von DNA

Bei der Herstellung rekombinanter DNA-Moleküle durch Ligation werden die Enden von DNA-Fragmenten, die durch den Restriktionsverdau erzeugt wurden, miteinander verknüpft.

Für die Ligation wurden möglichst äquimolare Mengen des DNA-Fragments, das zuvor geschnitten und aus einem Agarosegel aufgereinigt wurde, und des entsprechend verdauten Vektors eingesetzt. Des Weiteren enthielt der Ansatz 2 µl Ligationspuffer (NEB), 10,5 µl a.d. und 1,5 µl T4-Ligase (400 U/µl, NEB). Die Ligation erfolgte bei 16°C über Nacht in einem Wasserbad.

Für die Ligation glatter Enden wurden 25 bis 50 ng (ca. 1 µl) aus der Klenow Reaktion (2.3.8.9.3) verwendet und mit 5 µl 10x Ligationspuffer (Fermentas) sowie 5 µl Polyethylenglycol 4000 (PEG, Fermentas) und 2 µl T4 DNA Ligase (Fermentas)

versetzt. Der Ansatz wurde mit a.d. auf 50 µl aufgefüllt, gemischt und wahlweise bei 4°C, 16°C über Nacht oder bei 22°C für 1h inkubiert.

Die Ligationsansätze wurden entweder sofort in kompetente Bakterien transformiert oder bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.

2.3.8.9.6 Transformation von kompetenten Bakterien

Das Einbringen von Plasmid-DNA in Bakterien wird als Transformation bezeichnet und kann für die Amplifikation eines Plasmids in größerem Maßstab genutzt werden. Hierzu wurden TAM-1 Bakterien (Actif Motive) verwendet, wobei es sich um Bakterien handelt, deren Transformationseffizienz zuvor durch eine chemische Behandlung erhöht wurde und die daher als kompetent bezeichnet werden.

Lösungen:

Luria-Bertani-Medium (LB-Medium): Bacto-Tryptone (Difco) 1 % (w/v) Hefeextrakt (Difco) 0,5 % (w/v) NaCl 1 % (w/v)

Die Bestandteile wurden in 800 ml a.d. gelöst und der pH-Wert mit NaOH (5M) auf 7,0 einsgestellt. Anschließend wurde das Volumen auf 1 l ergänzt und autoklaviert.

Ampicillin (Boehringer) 50 mg/ml (50 µg/ml Endkonzentration)

LB-Agar-Platten: 1 l fertiges LB-Medium wurde mit 20 g (2 % (w/v)) Bacto-Agar (Difco) gemischt und autoklaviert. Nachdem die Lösung auf auf ca. 50°C abgekühlt war, wurde sie optional mit 1 ml Antibiotikum (Ampicillin oder Kanamycin) versetzt. Anschließend wurde der LB-Agar in 55 cm² Petrischalen (Greiner) gegossen und unter der Sterilbank ausgehärtet. Die Schalen wurden bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.

Die benötigte Menge an Bakteriensuspension wurde auf Eis aufgetaut, wobei für eine Re-Transformation 10 µl und für eine Ligationstransformation 20 µl verwendet wurden.

Anschließend wurde 1 µl Transformations- bzw. Ligationsansatz zu den Bakterien gegeben, durch vorsichtiges Rühren mit diesen vermischt und 45 min auf Eis inkubiert.

Es erfolgte ein Hitzeschock für exakt 45 sec bei 42°C, an den sich das sofortige Abkühlen des Ansatzes auf Eis anschloss. Nachfolgend wurde der Ansatz mit LB-Medium unter sterilen Bedingungen auf 200 µl ergänzt und die Probe 1 h bei 37°C und 200 rpm geschüttelt. 150 µl und 50 µl dieses Reaktionsansatzes wurden auf LB-Agarplatten mit einer Grundfläche von 160 cm² ausplattiert, die das Antibiotikum

enthielten, für das das transformierte Plasmid eine Resistenz verlieh. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C in einem Wärmeschrank inkubiert

2.3.8.9.7 Isolierung von Plasmid-DNA durch Minipräparation

Um zu überprüfen, ob die nach einer Transformation gewachsenen Kolonien die gewünschte Plasmid-DNA enthielten, wurde diese zur weiteren Analyse aus den Bakterien isoliert. Dazu wurde die Plasmid-DNA nach der Methode von Birnboim und Doly (1979) durch alkalischen Lyse aus den Bakterien gewonnen.

Lösungen:

LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum zur Selektion

Lysis-Lösung: 0,1 % SDS (w/v)

0,2 M NaOH

Neutralisationslösung: 11,5 ml Essigsäure 60 ml 5 M Kaliumacetat 28,5 ml a.d.

Isopropanol 70% Ethanol

TE/RNase A 1% (v/v) RNase A (10µg/µl)

Eine zu untersuchende Einzelkolonie wurde von einem festen Nährboden mit einer sterilen Spitze in eine 3 ml-Flüssigkultur überimpft, die mit der entsprechenden Konzentration des selektionierenden Antibiotikums versetzt war. Nach einer Wachstumsphase über Nacht bei 200 rpm und 37°C wurden 900 µl der Bakteriensuspension in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und bei 13 000 rpm abzentrifugiert. 600 µl des Überstandes wurden abgenommen und das Pellet in den verbleibenden 300 µl resuspendiert.

Die Lyse der Bakterien erfolgte durch die Zugabe von 300 µl Lysis-Lösung. Nach einer fünfminütigen Inkubation bei RT wurden der Probe 300 µl gekühlte Neutralisationslösung hinzugefügt und der Ansatz durch vorsichtiges Schwenken neutralisiert. Anschließend wurde die Probe bei 13 000 rpm 5 min zentrifugiert und der plasmidhaltige Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Zur Fällung der Plasmid-DNA wurden die ca. 800 µl Überstand mit 600 µl Isopropanol versetzt, der Ansatz 2 min kräftig gevortext und anschließend bei 13 000 rpm 10 min zentrifugiert.

Das Pellet wurde nach dem Entfernen des Überstands mit 70%-igem Ethanol gewaschen und anschließend an der Luft getrocknet. Die Plasmid-DNA wurde danach in einem Volumen von 30-50 µl TE/RNase gelöst und anschließend bei 4°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Die Analyse der DNA erfolgte in einem Restriktionsverdau und der anschließenden Auftrennung der Fragmente in einem Agarosegel.

2.3.8.9.8 Isolierung von Plasmid-DNA durch Maxipräparation

Für die Transfektion eukaryotischer Zellen sollte die verwendete DNA in sehr reiner Form vorliegen, da die Verunreinigung mit bakteriellen Proteinen und Endotoxinen zum Absterben der Zellen führen kann. Da für solche Transfektions-Experimente außerdem eine größere Menge an DNA benötigt wird, muß diese in einem größeren Maßstab exprimiert und isoliert werden.

Dazu wurde der NucleoBond ® PC 500 Kit (Macherey & Nagel) verwendet, dessen Prinzip auf der modifizierten alkalischen Lyse und einer nachfolgenden Anionenaus-tauscherchromatographie basiert. Von den mit dem zu präparierenden Plasmid transformierten Bakterien, die auf einer, mit dem entsprechenden Antibiotikum versehenen LB-Platte gewachsen waren, wurde eine Einzelkolonie ausgewählt. Diese wurde mit einer sterilen Pipettenspitze gepickt und in eine 3 ml-Flüssigkultur mit selektionierendem Antibiotikum überführt. Die Vorkultur wurde über Tag bei 37°C auf dem Schüttler inkubiert und nach ca. 6 h 200 µl daraus in 200 ml LB-Antibiotikum-Medium überimpft. Es erfolgte eine Inkubation der Wachstumskultur über Nacht bei 37°C und 200 rpm auf dem Schüttler. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation in Zentrifugenbechern bei 5000 x g für 15 min geerntet und das Pellet nach dem Entfernen des Überstandes in 12 ml RNase A–haltigem S1 Puffer sehr gut resuspendiert. Die Zellen wurden nachfolgend durch Zugabe von 12 ml S2 Puffer und Inkubation für 5 min bei RT lysiert. Anschließend erfolgte die Neutralisation, indem 12 ml S3 Puffer zugegeben und der Ansatz vorsichtig durch 5-maliges Schwenken durchmischt wurde.

Eine NucleoBond ® AX 500 Säule mit Filter wurde mit 6 ml N3 Puffer äquilibriert und mit dem Bakterienlysat beladen. Nach dem Durchfluß des Lysates wurde die Säule mit 32 ml N3 Puffer gewaschen und nach dem Entfernen des Filters die gebundene Plasmid-DNA mit 15 ml N5 Puffer in ein 50 ml Reaktionsgefäß eluiert. Anschließend wurden 11 ml Isopropanol zu der eluierten DNA gegeben und der Ansatz in eine 50 ml-Spritze gegeben, auf die ein NucleoBond ® AX Finalizer aufgesetzt war. Dieser Filter besteht aus einer Silicamembran, an die die Plasmid-DNA beim Durchfluß bindet. Der

Finalizer wurde mit 5 ml 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und die Plasmid-DNA anschließend mit 500 µl 10 mM Tris, pH 8,0 mittels einer 1 ml-Spritze eluiert. Die in dem Eluat enthaltene DNA-Konzentration wurde photometrisch bestimmt.