3. ERGEBNISSE
3.2 Einfluss von AGEs auf dermale Fibroblasten
61 KDa 80 KDa
48 KDa BSA
AGE-BSA Amylase
BSA AGE-BSA
Am ylase 1:600 1:2000
61 KDa 80 KDa 48 KDa 61 KDa 80 KDa
48 KDa BSA
AGE-BSA Amylase
BSA AGE-BSA
Am ylase 1:600 1:2000
Eine in der Literatur beschriebene Standardmethode zur Erfassung des Glycierungsgrades verschiedener Proteinlösungen ist der Nachweis fluoreszierender AGEs mit Hilfe der Fluoreszenzspektrometrie. Hierzu wurden Emissionsspektren der glycierten BSA-Lösungen mit einer Konzentration von 1 mg/ml bei einer Excitationswellenlänge von 370 nm erstellt. Abb. 3.21 zeigt solche Spektren, in denen der Verlauf der Glycierung durch die zunehmende Fluoreszenz über einen Zeitraum von 24 Tagen dargestellt ist. Als Leerwert wurde BSA verwendet, welches über 24 Tage ohne Glucose bei 50°C inkubiert wurde.
3.2.2 Nachweis von AGE-BSA mit Antiseren bzw. Antikörpern
Für den immunhistochemischen Nachweis von AGEs stand ein kommerzieller monoklonaler Antikörper gegen CML (Klon 6D12; Fa. Wako) zur Verfügung. Zur Herstellung eigener polyklonaler Antiseren wurde BSA (10mg/ml) mit 1M Glucose in gepufferter physiologischer Salzlösung (PBS) bei 37°C und unter sterilen Bedingungen drei Wochen inkubiert. Das so glycierte BSA wurde als Antigen verwendet, wobei die Herstellung des polyklonalen Serums bei der Firma Seramun (Doggendorf) in Auftrag gegeben wurde. Zwei Kaninchen wurden immunisiert, aus denen die Seren 191 und 192 gewonnen wurden. Da beide Seren zu gleichen Ergebnissen führten, werden nur die Ergebnisse gezeigt, die mit dem Serum 191 erzielt wurden.
Abb. 3.22: Immunoblots gefärbt mit dem polyklonalen Serum 191. Aufgetragen wurde jeweils 1µg BSA, glyciertes BSA (AGE-BSA) und Amylase vom Schwein. Die Proteine wurden auf einem 12%
Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Der Semi dry-Blot des Gels wurde mit verschiedenen Antiserum-Verdünnungen gefärbt.
In Abb. 3.22 ist zu erkennen, dass das Serum 191 sowohl mit BSA als auch mit glyciertem BSA reagiert, jedoch nicht mit Amylase, das als Negativkontrolle verwendet wurde. Ebenfalls zeigte sich, dass das glycierte BSA sich durch einen Molekulargewichts-Shift, der auf der Zunahme des Molekulargewichts durch die Glycierung des Proteins beruht, vom Kontroll-BSA unterscheiden lässt.
Um die Kreuzreaktivität der Antiseren mit Serumalbumin unterschiedlicher Spezies zu untersuchen, wurde ein entsprechender Western Blot mit verschiedenen Albuminen hergestellt. Abb. 3.23 zeigt eine Kreuzreaktivität mit Albumin der Ziege (GSA) und eine leichte Kreuzreaktivität mit Albumin des Menschen (HSA). Aus diesem Grund durfte für
67 KDa
BSA
AGE-BSA 67 KDa
67 KDa
BSA
AGE-BSA
die entsprechenden Blockierungsreaktionen in der Immunhistochemie kein Ziegenserum verwendet werden. Des Weiteren mussten in der immunhistochemischen Analyse von menschlichem Gewebe eine höhere Verdünnung sowie eine Vorinkubation der Antiseren mit HSA erfolgen.
Abb. 3.23: Western Blot gefärbt mit dem polyklonalen Serum 191. Aufgetragen wurde jeweils 1µg BSA, glyciertes BSA (AGE-BSA), Albumin des Menschen (HSA), der Ratte (RSA), des Kaninchens (RaSA), des Hundes (DSA), der Ziege (GSA) und des Huhns (CSA), sowie Amylase vom Schwein. Die Proteine wurden in einem 8% denaturierendem Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und anschließend auf Nitrozellulose übertragen. Der Blot wurde mit einer 1:1000 Verdünnung des 191 Serums gefärbt.
Die Verwendung des monoklonalen Antikörpers 6D12 der Firma Wako in der Immunoblot-Analyse zeigte eine Reaktivität mit glyciertem BSA, jedoch nicht mit dem unglycierten Protein (Abb. 3.24). Dieser Antikörper bindet somit spezifisch an die Proteinepitope, die durch eine nicht-enzymatische Glykosylierung mittels Glucose modifiziert wurden.
Abb. 3.24: Western Blot gefärbt mit dem monoklonalen anti-AGE Antikörper 6D12. Aufgetragen wurde jeweils 1µg BSA und glykosyliertes BSA (AGE-BSA). Die Proteine wurden auf einem 10% Polyacrylamidgel getrennt und der Blot des Gels anschließend mit dem 6D12 monoklonalen anti-AGE Antikörper gefärbt.
Es wurde im weiteren versucht, die Antikörper aus Serum 191 anzureichern, die nur glycierte Epitope erkennen, um einen polyklonalen Antikörper mit ähnlichen Eigenschaften wie die des monoklonalen Antikörpers in der Hand zu haben. Hierzu wurde BSA an eine Bromcyan-aktivierte Sepharose gekoppelt, die für eine Affinitätschromatographie verwendet wurde, bei der die Antikörper, die nur BSA binden, entfernt werden sollten. Diese Aufreinigung war jedoch nicht erfolgreich.
Um die Sensitivität des verwendeten Hyperimmunserums 191 in solchen Experimenten zu testen, wurde ein Proteinlysat von 3T3-Mausfibroblasten wie unter Punkt 2.3.9.1 beschrieben, ohne Verwendung von TRIzol, hergestellt und dem Lysat nachfolgend
BSA
AGE-BSA HSA
RSA RaSA
DSA GSA
CSA Amylase 61 KDa
BSA
AGE-BSA HSA
RSA RaSA
DSA GSA
CSA Amylase 61 KDa
61 KDa
3T3 Zellysat + AGE-BSA
BSA AGE-BSA
100 ng 200 ng 1600 ng
400 ng
50 ng 800 ng
CoomassieSerum 191
3T3 Zellysat + AGE-BSA
BSA AGE-BSA
100 ng 200 ng 1600 ng
400 ng
50 ng 800 ng
CoomassieSerum 191
steigende Mengen an glyciertem BSA zugesetzt. Wie Abb. 3.25 zeigt, kann glyciertes BSA bis zu einer Menge von 200 ng pro Spur im Western Blot nachgewiesen werden.
Abb. 3.25: Auftrennung gleicher Mengen von 3T3-Zelllysaten mit steigenden Konzentrationen an AGE-BSA. Die Proben wurden auf einem 8%
Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und anschließend mit Coomassie gefärbt. Als Kontrollen wurden je 1000 ng BSA bzw. AGE-BSA aufgetragen. Ein äquivalentes Gel wurde geblottet und eine Immundetektion mit Serum 191 (1:1000 verdünnt) durchgeführt.
Das polyklonale Antiserum gegen AGE-BSA konnte für die unter 3.3.2 beschriebenen Untersuchungen eingesetzt werden. Es erbrachte jedoch aufgrund der geringen Spezifität für glycierte Proteine keine zufrieden stellenden Ergebnisse in der Immunzytochemie bzw. –histochemie (Daten nicht gezeigt).
3.2.3 Einfluss von AGE-BSA auf Proliferation und Apoptose von Fibroblasten Die Zellteilung und der programmierte Zelltod stellen wichtige Parameter bei Untersuchungen zur Wirkung von AGEs auf die Fibroblasten in der Dermis alternder Haut dar. Um die durch AGEs hervorgerufenen möglichen Veränderungen dieser Vorgänge zu analysieren, wurden sowohl NIH 3T3 Mausfibroblasten, die zu Beginn als Modellzellen dienten, als auch primäre dermale Fibroblasten mit AGEs in Form von glyciertem BSA behandelt. Die Proliferationsrate der Mausfibroblasten wurde ermittelt, indem die Zellen konzentrations- bzw. zeitabhängig mit AGE-BSA bzw. unbehandeltem BSA inkubiert wurden. Anschließend erhielten die Zellen BrdU als S-Phasen Marker, welches mit Hilfe einer Antikörperfärbung nachgewiesen wurde (2.3.6.2). Nach dem Auszählen erfolgte die Berechnung des prozentualen Anteils der BrdU-positiven Zellen.
Der Apoptoseindex wurde mit Hilfe des TUNEL-Assays analysiert, der den Nachweis von DNA-Strangbrüchen in Zellen über einen Fluoreszenzmarker ermöglicht (2.3.6.3).
Bei diesen Versuchen zeigte sich, dass die Proliferation der mit glyciertem BSA behandelten 3T3 Mausfibroblasten in Abhängigkeit von der Konzentration abnimmt (Abb. 3.26 a). Bei einer Konzentration von 60 µM war im Vergleich zur Kontrolle lediglich eine Proliferationsrate zwischen 3% und 7% nachweisbar. Die Zahl der
0 20 40 60 70 80 0
10 20 30
40 BSA
AGE-BSA
c [µM]
BrdU LI [%]
0 20 40 60 70
0.0 2.5
5.0 BSA
AGE-BSA
c [µM]
TUNEL LI [%]
0 3 6 12 18 24
0 10 20 30 40
50 PBS
BSA AGE-BSA
Zeit [h]
BrdU LI [%]
a b
c
0 20 40 60 70 80
0 10 20 30
40 BSA
AGE-BSA
c [µM]
BrdU LI [%]
0 20 40 60 70
0.0 2.5
5.0 BSA
AGE-BSA
c [µM]
TUNEL LI [%]
0 3 6 12 18 24
0 10 20 30 40
50 PBS
BSA AGE-BSA
Zeit [h]
BrdU LI [%]
a b
c
TUNEL-positiven Zellen stieg erst ab einer Konzentration von 60 µM deutlich an (Abb.
3.26 b). In der zeitabhängigen Versuchsreihe, bei der eine Konzentration von 50 µM BSA bzw. glyciertem BSA eingesetzt wurde, nahm die Proliferationsrate über einen Zeitraum von 24 Stunden nur leicht ab (Abb. 3.26 c).
Abb. 3.26: Markierungsindex (a und c) und Apoptoseindex (b) von NIH 3T3 Mausfibroblasten nach konzentrations- (a und b) bzw. zeitabhängigen (c) Inkubationen mit glyciertem BSA sowie unbehandeltem BSA. Die zeitabhängige Inkubation erfolgte mit einer Konzentration von 50 µM, die konzentrationsabhängige Inkubation über 24 h. Für den Nachweis proliferierender Zellen wurden die Fibroblasten mit BrdU markiert, fixiert und nach immunhistochemischer Detektion der BrdU-positiven Zellen ausgezählt. Die Zahl apoptotischer Zellen wurde mit Hilfe des ApoAlert DNA Fragmentation Kits durch den Nachweis TUNEL-positiver Zellen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie ermittelt. Es wurden jeweils 400 bis 600 Zellen ausgezählt, wobei jede Bedingung in Triplikaten analysiert. Dargestellt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung aus drei unabhängigen Messungen.
Diese Experimente wurden anschließend mit primären dermalen Fibroblasten junger und alter Spender wiederholt. Hierbei wurde eine Immunfärbung gegen das Protein Ki67 durchgeführt, das ebenfalls einen Proliferationsmarker darstellt (Abb. 3.27). In diesen Versuchen zeigte sich auch bei hohen Konzentrationen AGE-BSA bis zu 250 µM keine erhöhte Rate apoptotischer Zellen im Vergleich zu unbehandelten Fibroblasten. Die Proliferationsrate nahm lediglich bei den Fibroblasten der alten Spender ab, wobei die Standardabweichung hier jedoch sehr hoch lag. Bei jungen Fibroblasten dagegen war kein Effekt nachweisbar. Die Ergebnisse variierten zudem je nach Charge der verwendeten Zellen. In diesen Experimenten zeigte sich, dass AGE-BSA alleine keine signifikante Wirkung auf die Proliferation primärer dermaler
0 50 100 150 250 0
25
50 BSA junge Fibroblasten
AGE-BSA junge Fibroblasten BSA alte Fibroblasten
AGE-BSA alte Fibroblasten
c [µM]
Ki67 LI [%]
Fibroblasten hatte, wohingegen es in der Zelllinie der Mausfibroblasten einen Proliferationsstop bewirkte und bei höherer Konzentration das Absterben der Zellen zur Folge hatten. Dies macht deutlich, dass die Wirkung von AGEs u.a. stark von den gewählten Zelltypen abhängig ist.
Abb. 3.27: AGE-BSA hat nur einen geringen Einfluss auf die Proliferation von primären Fibroblasten. Dermale Hautfibroblasten verschiedener Spender wurden über 24 h mit unterschiedlichen Konzentrationen AGE-BSA bzw. unglyciertem BSA inkubiert. Die Bestimmung der Proliferationsrate erfolgte anschließend durch den immunzytochemischen Nachweis Ki67-positiver Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie. n = 3 (junge Fibroblasten: 26w, 30w, 35w; alte Fibroblasten: 60w, 75m, 77m). Angegeben sind die Mittelwerte mit Standardabweichung