3.6.1 Zelllinie
Für die Zellkultur wurde folgende Zelllinie verwendet:
LNCaP-Prostatakarzinomzelllinie (THELEN et al., 2004).
3.6.2 Kultivierung der Zelllinie
Alle Arbeiten wurden unter einer Sterilbank durchgeführt. Die Zellkulturen lagerten in einem Brutschrank bei 37°C und einem CO2-Gehalt von 5%. Alle 3 Tage wurde das Medium der Zellen erneuert. Dafür musste zunächst das alte RPMI-Medium bis auf einen kleinen Rest abgesaugt werden. Dieser Rest war für die Kontinuität der Zellkultur nötig. Dann wurden 3ml frisches RPMI-Medium vorsichtig auf die Zellen gegeben. Generell wurde beim Umgang mit der Zellkultur auf vorsichtiges und erschütterungsfreies Arbeiten geachtet, um die Zelladhärenz nicht zu beeinflussen.
3.6.3 Passagieren der Zellkultur
Je nach Wachstum und Zelldichte der Zellen in der Kulturflasche mussten die Zellen passagiert werden. Dies geschah in Abhängigkeit von der eingesetzten Zellmenge ca. alle 7 Tage. Hierfür wurde zunächst das verbrauchte RPMI-Medium abgesaugt und durch 2ml Trypsin-EDTA ersetzt. Nun mussten die Zellen 5-10 Minuten im Brutschrank inkubieren. Durch das Trypsin-EDTA wurden die Zellen schonend vom Boden der Kulturflasche gelöst. Nach der Inkubationszeit wurde die Zellsuspension in ein Reagenzröhrchen überführt und 2ml RPMI-Medium dazu gegeben. Das Medium stoppte die Wirkung des Trypsins und schützte dadurch die Zellen.
Das Reagenzröhrchen wurde dann bei 10000 Umdrehungen pro Minute (UPM) für 10 Minuten zentrifugiert. Auf dem Boden des Röhrchens befand sich dann ein Zellpellet. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet in 2ml frischem
RPMI-36
Medium suspendiert. Von dieser Zellsuspension nahm man 0,5ml ab und überführte sie in eine frische Kulturflasche, welche mit 3ml RPMI-Medium aufgefüllt wurde.
Anschließend wurde die Kulturflasche unter den oben genannten Bedingungen kultiviert.
3.6.4 Behandlung der LNCaP-Zellen mit Valproat und Temsirolimus
Die LNCaP-Zellen wurden in verschiedenen Kombinationen mit Temsirolimus und Valproat behandelt. Temsirolimus (Tem) wurde in einer Konzentration von 1µMol/L verwendet, Valproat (VPA) in einer Konzentration von 1mMol/L.
Bei der Wahl der Konzentrationen und der Zeiten wurde sich an der Arbeit von Wedel et al., orientiert. Die genannten Konzentrationen von Valproat und dem mTOR-Inhibitor RAD001 bewirkten in der vorgenannten Arbeit einen synergistischen Effekt in LNCaP-Zellen auf das Tumorzellwachstum und die Inhibition des Zellzyklus (WEDEL et al., 2011). Ein durchgeführter Vorversuch hatte zudem gezeigt, dass eine erneute Behandlung der Zellen mit Valproat nach 48 Stunden notwendig war, um die in dieser Studie beschriebenen Effekte zu beobachten.
Temsirolimus der Firma Wyeth wurde nach Packungsbeilage mit dem beiliegenden Verdünnungsmittel vermischt, dann mit NaCl verdünnt, um eine Zielkonzentration von 1µMol/L zu erreichen. Valproat wurde mit RPMI-Medium vermischt, um eine Konzentration von 1mMol/L zu erreichen.
Zur Vorbereitung der Behandlung wurden die Zellen wie in Punkt 3.6.3 beschrieben vorbereitet. Während normalerweise die gewonnene Zellsuspension wieder zurück in die Kulturflasche gefüllt wurde, entnahm man zunächst mit einer Pipette eine kleine Menge der Suspension und gab sie auf eine Neubauer-Zählkammer, um die Zellzahl zu bestimmen. Anhand der errechneten Zellzahl ermittelte man, wie viel Suspension man pro Well einer Sechs-Well-Platte braucht, um eine Zellzahl von 100000 Zellen pro Well zu erreichen. Vier Wells wurde dann mit RPMI-Medium auf 2ml Inhalt aufgefüllt. Die Sechs-Well-Platte wurden dann für 24h zurück in den Brutschrank gegeben, damit die Zellen anwachsen konnten.
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Nach dieser Zeit begann die Behandlung nach folgendem Schema:
Stunde Well Nr.1 Well Nr.2 Well Nr.3 Well Nr.4
0 Medium 1mMol/L VPA 1mMol/L VPA
24
48 1mMol/L VPA 1mMol/L VPA +
1µMol/L Tem
1µMol/L Tem
72
96 RNA-Extraktion RNA-Extraktion RNA-Extraktion RNA-Extraktion
Tabelle 2: Schema der Behandlung der LNCaP-Zellen mit Valproat (VPA), Temsirolimus (Tem) und der Kombination aus beiden Medikamenten.
Well Nr. 1 diente als Kontrolle. In diesem wurde nur das alte RPMI-Medium gegen frisches ausgetauscht. Well Nr. 2 wurde Valproat in der oben genannten Konzentration zugegeben, dieses wurde nach 48h wiederholt. Well Nr. 3 wurde ebenfalls Valproat zugegeben, nach 48h wurde das Valpoat wiederholt und zusätzlich Temsirolimus auf die Zellen gegeben. Well Nr. 4 erhielt zu Beginn frisches RPMI-Medium und nach 48h wurde mit Temsirolimus behandelt. 96h nach der ersten Behandlung wurden die Überstände abgenommen. Die zurückbleibenden Zellen waren nun bereit zur RNA-Extraktion (siehe Punkt 3.6.7), (n = 3).
3.6.5 Vitalitätstest
3.6.5.1 Prinzip des Alamar Blue Assays
Es wurde ein Alamar Blue Assay durchgeführt, um zu klären, ob die Behandlung mit den verschiedenen Medikamenten die Zellen nachhaltig in ihrer Vitalität geschädigt hat. Der Assay beinhaltet einen Redoxindikator, das Resazurin. Unbehandelte Zellen erzeugen ein reduzierendes Milieu in dem das Resazurin zu dem fluoreszierenden Resorufin reduziert wird. Zytotoxische Substanzen hemmen oder verlangsamen
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diese Reduktion, so dass von einem Rückgang der Fluoreszenz auf einen Rückgang der Vitalität der Zellen geschlossen werden kann.
3.6.5.2 Protokoll des Alamar Blue Assays Behandlung der Zellen
Die Zellen wurden wie in Punkt 3.6.3 beschrieben passagiert. Bevor sie jedoch in eine frische Kulturflasche gegeben wurden, wurde die Zellzahl mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. In einer 96-Well Platte wurden 5000 Zellen in 100µl RPMI-Medium aufgenommen und, wie in Tabelle 2 aufgeführt, behandelt. Pro Behandlungsgruppe wurden 6 Wells verwendet (n = 6).
Hinzufügen des Alamar Blue Reagenz
10µl des Alamar Blue Reagenz wurden auf jedes Well pipettiert und die Zellen für 4 Stunden im Brutschrank inkubiert.
Photometrische Messung
Die anschließende photometrische Messung erfolgte bei 570 und 600nm.
3.6.6 Proliferationstest
3.6.6.1 Prinzip des BrdU-ELISA
Es wurde ein BrdU (5-bromo-2‘-deoxyuridine) ELISA durchgeführt, um Aussagen bezüglich der Proliferationsaktivität der behandelten Zellen treffen zu können.
Bei BrdU handelt es sich um ein Pyrimidin Analog welches in die DNA proliferierender Zellen eingebaut wird und das natürliche Thymidin ersetzt. Nach einer entsprechenden Inkubationszeit wird die DNA der Zellen denaturiert. Nun bindet ein Anti-BrdU Antikörper, der wiederrum mit einer Peroxidase verbunden ist, an das BrdU in der neu synthetisierten DNA. Die Peroxidase führt zu einem Farbumschlag des zugegebenen Substrats. Dieser Farbumschlag wird photometrisch gemessen.
39 3.6.6.2 Protokoll des BrdU-ELISA
Behandlung der Zellen
Die Zellen wurden, wie in Punkt 3.6.3 beschrieben, passagiert. Bevor sie jedoch in eine frische Kulturflasche gegeben wurden, wurde die Zellzahl mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. In einer 96-Well Platte wurden 5000 Zellen in 100µl RPMI-Medium aufgenommen und, wie in Tabelle 2 aufgeführt, behandelt. Pro Behandlungsgruppe wurden 6 Wells verwendet (n = 6).
Hinzufügen des BrdU-labeling Reagenz
10µl des BrdU-labeling Reagenz wurden auf jedes Well pipettiert und die Zellen für weitere 2 Stunden im Brutschrank inkubiert.
Hinzufügen des FixDenat Reagenz
Die vorhandene Flüssigkeit wurde vorsichtig von den einzelnen Wells abgesaugt und je 200µl FixDenat Reagenz hinzugefügt. Es folgte eine Inkubationszeit von 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Hinzufügen von Anti-BrdU-Peroxidase
Das FixDenat Reagenz wurde vorsichtig entfernt und durch 100µl Anti-BrdU-Peroxidase ersetzt. Die Platte wurde bei Raumtemperatur für 90 Minuten stehen gelassen.
Hinzufügen der Substratlösung
Das Reagenz wurde von der Platte entfernt und jedes Well dreimal mit Waschlösung gewaschen. Dann wurden 100µl Substratlösung pro Well hinzugefügt.
Photometrische Messung
Sobald der Farbumschlag erfolgte, wurde die photometrische Messung bei einer Wellenlänge von 370nm durchgeführt.
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3.6.7 RNA-Extraktion aus der Zellkultur
3.6.7.1 Allgemeines Arbeiten mit RNA
RNA ist u. a. gefährdet durch RNasen. Diese Enzyme sind sehr beständig, weit verbreitet und bereits kleinste Mengen können RNA zerstören. Deshalb muss beim Arbeiten auf eine RNase freie Umgebung geachtet werden.
Während des Arbeitens wurden deshalb Latexhandschuhe getragen. Es wurden ausschließlich autoklavierte oder RNase-freie Materialien verwendet. Gefäße mussten, wann immer möglich, geschlossen werden und waren kühl zwischenzulagern. Die RNA-Extraktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Zur weiteren sofortigen Verwendung konnte die RNA auf Eis zwischengelagert werden.
Eine mittelfristige Lagerung erfolgte bei -20°C im Gefrierschrank.
3.6.7.2 Prinzip der RNA-Extraktion aus der Zellkultur
Die RNA-Extraktion wurde mit Hilfe des Zymo Research Mini RNA Isolation II Kit durchgeführt. Durch das RNA-Extraktionsverfahren kann RNA aus Zellen gewonnen werden. Dabei werden die selektiven Bindungseigenschaften einer mit Silikangel geschichteten Membran mit der Microspin-Technologie kombiniert. Es ist möglich, 100µg RNA mit einer Größe von mehr als 200 Basenpaaren an die Membran zu binden. Kleinere RNA insbesondere 5.8S rRNA, 5S rRNA und tRNA werden zusammen mit Proteinen und Zelllysat abgetrennt.
Beim Verfahren des Zymo Research Mini RNA Isolation II Kit werden die Zellen zunächst lysiert und homogenisiert, anschließend werden sie mit Guanidinisothiocyanat-Puffer behandelt. Auf diese Weise wird die Denaturierung erreicht und gleichzeitig alle RNasen inaktiviert, wodurch eine Isolation intakter RNA gewährleistet wird. In einem weiteren Schritt wird Ethanol verwendet, um optimale Bindungsvoraussetzungen für die Membran zu schaffen. Dann wird die Probe auf eine Zymo-Spin Column mit Collection Tube gegeben. An diese wird die RNA gebunden und restliche Zellbestandteile werden ausgewaschen. Die extrahierte RNA wird mit 30µl RNase-freiem Wasser eluiert.
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3.6.7.3 Protokoll zur RNA-Extraktion aus der Zellkultur Ernten der Zellen
Das Medium inklusive der zugesetzten Medikamente wurde entfernt. Damit waren die Zellen optimal vorbereitet für die Lyse. Aus jedem behandelten Well wurde einmal der RNA-Pool isoliert (n = 1).
Lyse
600µl des ZR-RNA-Puffers wurde pro Well auf die Zellen gegeben. Daduch lösten sich die Zellen vom Boden des Wells, die Plasmamembran und die Organellen der Zelle wurden lysiert und die in den Zellen befindliche RNA freigesetzt.
Zentrifugation
Die 600µl Probe pro Well wurde jeweils auf eine Zymo-Spin Column pipettiert und diese dann auf eine 2ml Eppendorf Gefäß gesetzt. Dann wurde 1 Minute bei 10000 Umdrehungen pro Minute (UPM) zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen.
Zugabe des RNA Waschpuffers
350µl RNA Waschpuffer wurde auf jede Säule gegeben. Dadurch wurden Zellbestandteile ausgewaschen ohne die Bindung der RNA zu gefährden. Die Säule wurde erneut 1 Minute bei 10000 UPM zentrifugiert. Dieser Schritt wurde nochmal wiederholt.
Elution
Die Zymo-Spin Column wurde auf ein frisches 1,5ml Eppendorf Gefäß überführt und 30µl RNase-freies Wasser auf die Membran pipettiert. Dann wurde wieder 1 Minute bei 10000 UPM zentrifugiert. Das Eluat konnte, auf Eis gelagert, sofort weiter verwendet werden oder bei -20°C zur mittelfristigen Verwendung aufbewahrt werden.
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