Tierärztliche Hochschule Hannover
Erprobung einer Kombinationstherapie aus dem Histondeacetylaseinhibitor Valproat und dem mTOR-
Inhibitor Temsirolimus für das fortgeschrittene Prostatakarzinom in vitro und am Nacktmausmodell.
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Lisa Krahn
Bremen
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. Ralph Brehm Anatomisches Institut
Tierärztliche Hochschule Hannover
2. PD Dr. Paul Thelen
Urologische Klinik und Poliklinik Universitätsmedizin Göttingen
1. Gutachter: - Prof. Dr. Ralph Brehm
2. Gutachter: - Prof. Dr. Bernd Schröder
Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2012
Meiner Familie
V
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ... XI Abbildungsverzeichnis ... XIV Tabellenverzeichnis ... XV
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 3
2.1 Das Prostatakarzinom ... 3
2.1.1 Epidemiologie ... 3
2.1.2 Ätiologie ... 4
2.1.3 Klinik ... 4
2.1.4 Früherkennung ... 5
2.1.5 Das Prostataspezifische Antigen ... 6
2.1.6 Stadieneinteilung ... 8
2.1.7 Therapie ... 8
2.2 Der Androgenrezeptor und das kastrationsresistente ... 10
Prostatakarzinom ... 10
2.3 Das IGF-System ... 14
2.3.1 IGF-1 ... 14
2.3.2 IGF-2 ... 15
2.3.4 IGF-Rezeptoren ... 15
2.3.5 IGF-Bindungsproteine (IGF-BP) ... 16
2.3.6 IGF-BP Proteasen ... 17
2.3.7 Das IGF-System und Tumorentstehung ... 17
VI
2.4 Histone und Epigenetik ... 19
2.4.1 Aufbau der Chromosomen ... 19
2.4.2 Epigenetik ... 20
2.5 Histondeacetylasen und Valproat ... 21
2.5.1 Histonacetyltransferasen und Histondeacetylasen ... 21
2.5.2 Histondeacetylasen im Prostatakarzinom ... 22
2.5.3 Histondeacetylaseinhibitoren ... 23
2.5.3.1 Valproat ... 23
2.6 Mammalian target of rapamycin (mTOR) ... 25
2.6.1 mTOR-Inhibitoren und Temsirolimus ... 27
2.7 Zelllinien ... 28
2.8 Mausmodell ... 28
3 Material und Methoden ... 30
3.1 Geräte ... 30
3.2 Gebrauchsmaterialien ... 31
3.3 Molekularbiologische Agenzien ... 31
3.4 Lösungen/Fixantien ... 33
3.5 Primer ... 34
3.6 Zellkultur ... 35
3.6.1 Zelllinie ... 35
3.6.2 Kultivierung der Zelllinie ... 35
3.6.3 Passagieren der Zellkultur ... 35
3.6.4 Behandlung der LNCaP-Zellen mit Valproat und Temsirolimus ... 36
3.6.5 Vitalitätstest ... 37
VII
3.6.5.1 Prinzip des Alamar Blue Assays ... 37
3.6.5.2 Protokoll des Alamar Blue Assays ... 38
3.6.6 Proliferationstest ... 38
3.6.6.1 Prinzip des BrdU-ELISA ... 38
3.6.6.2 Protokoll des BrdU-ELISA ... 39
3.6.7 RNA-Extraktion aus der Zellkultur ... 40
3.6.7.1 Allgemeines Arbeiten mit RNA ... 40
3.6.7.2 Prinzip der RNA-Extraktion aus der Zellkultur ... 40
3.6.7.3 Protokoll zur RNA-Extraktion aus der Zellkultur ... 41
3.7 Tierversuch ... 42
3.7.1 Versuchstiere... 42
3.7.2 Vorbereiten der LNCaP-Zellen zur Injektion ... 42
3.7.3 Medikation der Versuchstiere ... 42
3.7.4 Erfassung der Ergebnisse ... 43
3.7.5 Aufbereitung der Tumorgewebeproben ... 44
3.7.5.1 Fixierung und Einbettung des Tumorgewebes ... 44
3.7.5.2 Herstellung der Paraffinschnitte ... 44
3.7.5.3 HE-Färbung ... 44
3.7.5.3.1 Protokoll der HE-Färbung ... 45
3.7.5.4 Ki-67 Immunhistochemie ... 45
3.7.5.4.1 Prinzip der Ki-67 Färbung... 46
3.7.5.4.2 Protokoll der Ki-67 Immunhistochemie ... 46
3.7.5.5 Berechnung des Proliferationsindex ... 47
3.7.6 PSA-Messung... 48
3.7.6.1 Prinzip der PSA-Messung ... 48
3.7.6.2 Protokoll zur PSA- Messung ... 47
3.7.7 RNA-Extraktion aus Tumorgewebe ... 50
3.7.7.1 Prinzip der RNA-Extraktion aus Tumorgewebe... 50
3.7.7.2 Protokoll zur RNA-Extraktion aus Tumorgewebe ... 50
VIII
3.8 RNA-Quantifizierung mittels Agilent 2100 Bioanalyzer ... 51
3.8.1 Prinzip der RNA-Quantifizierung... 51
3.8.2 Protokoll der RNA-Quantifizierung ... 52
3.8.3 Auswertung der Messungen ... 53
3.9 cDNA-Synthese ... 54
3.9.1 Prinzip der cDNA-Synthese ... 54
3.9.2 Protokoll der cDNA-Synthese ... 55
3.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ... 57
3.10.1 Prinzip der PCR ... 57
3.10.2 Real Time RT-PCR ... 58
3.10.2.1 Real Time RT-PCR Amplifikationsdiagramm ... 59
3.10.2.2 Protokoll zur SYBR Green PCR ... 60
3.10.2.3 iCycler Programm ... 62
3.10.2.4 Auswertung der Messungen ... 62
3.11 Statistik ... 63
4 Ergebnisse ... 64
4.1 Ergebnisse der Zellversuche ... 64
4.1.1 Ergebnisse der RNA-Quantifizierung ... 64
4.1.2 Ergebnisse des Vitalitätstests ... 67
4.1.3 Ergebnisse des Proliferationtests ... 68
4.1.4 Veränderung der Genexpression nach Behandlung mit Valproat, Temsirolimus oder einer Kombination der beiden Medikamente ... 69
4.1.4.1 Expression von KLK3: ... 70
4.1.4.2 Expression von IGF-1: ... 71
4.1.4.3 Expression von IGF-1-R: ... 72
4.1.4.4 Expression von IGF-BP-3: ... 73
IX
4.2 Ergebnisse des Tierversuchs ... 74
4.2.1 Verwendete und ausgewertete Mäuse ... 74
4.2.2 Das Tumorwachstum ... 75
4.2.3 Der Proliferationsindex ... 82
4.2.4 PSA-Sekretion ... 92
4.2.5 Veränderung der Genexpression nach Behandlung mit Valproat, Temsirolimus oder einer Kombination der beiden Medikamente ... 94
4.2.5.1 Expression von KLK3: ... 95
4.2.5.2 Expression von IGF-1: ... 96
4.2.5.3 Expression von IGF-1-R: ... 97
4.2.5.4. Expression von IGF-BP-3: ... 98
5 Diskussion ... 99
5.1 Ergebnisse der Zellversuche ... 99
5.1.1 Vitalität und Proliferation der Zellen ... 99
5.1.2 Veränderung der Genexpression von KLK3, IGF-1, IGF-1-R und IGF-BP-3 ... 101
5.2 Ergebnisse des Tierversuchs ... 107
5.2.1 Anwachsen der Tumoren ... 107
5.2.2 Wachstum der Tumoren ... 108
5.2.3 PSA im Serum der Mäuse ... 112
5.2.4 Veränderung der Genexpression von KLK3, IGF-1, IGF-1-R und IGF-BP-3 ... 113
6 Schlussfolgerung ... 115
7 Zusammenfassung ... 116
8 Abstract ... 118
X
9 Literaturverzeichnis ... 120
XI
Abkürzungsverzeichnis
% Prozent
°C Grad Celsius
µl Mikroliter
µMol Mikromolarität ADP Adenosindiphosphat
ARP Acidic ribosomal phosphoprotein
bp Basenpaare
BPH Benigne Prostatahyperplasie BrdU Bromodeoxyuridine
BSA Bovines Serum Albumin
ca. circa
cdk Cyclin dependent kinase
cDNA Complementary deoxyribonucleic acid CRPC
Ct
Castration-Resistant Prostate Cancer Threshold-Cycle
d Day
dest. destilliert
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate e. V. eingetragener Verein
EDTA Ethylendiamintetraacetat EGF Epidermal growth factor
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay EMEA European Medicine Agency
FCS Fetal calf serum
FDA Food and Drug Administation F-Primer Forward-Primer
FSH Follikelstimulierendes Hormon
FU Fluoreszenz
GH Growth hormon
H Histon
XII HAT Histonacetyltransferasen HDAC Histondeacetylasen
HDACi Histondeacetylaseinhibitoren HE-Färbung Hämatoxylin-Eosin-Färbung i. v. Intra venös
IGF Insulin like growth factor
IGF-1-R Insulin like growth factor 1 receptor IGF-BP Insulin like growth factor binding protein
kg Kilogramm
Ki-67 Kiel-67
KLK3 Kallikrein 3
L Liter
LNCaP Lymph node cacinoma of the prostate
M6P Mannose-6-Phosphat
ml Milliliter
mm Millimeter
mMol Millimolarität
mRNA messenger Ribonucleic acid mTOR mammalian target of rapamycin
mTORC mammalian target of rapamycin complex NaCL Natriumchlorid
ng Nanogramm
nm Nanometer
NMRI nu/nu Naval Medical Research Institute nude/nude
Nr. Nummer
PBGD Porphobilinogen-deaminase PBS Phosphate buffered saline
PC Prostate Cancer
PI3K Phosphoinositid-3-Kinase
PIN prostatische intraepitheliale Neoplasie PSA Prostata spezifisches Antigen
PTEN Phosphatase und tensin homolog RFU Relative fluorescence units RKI Robert Koch Institut
XIII RPMI Roswell Park Memorial Institute R-Primer Reverse-Primer
rRNA Ribosomal Ribonucleic acid
RT-PCR reverse transkriptase Polymerase-Kettenreaktion
s Sekunde
S Svedberg
SIR Silent Information Regulator TBS Tris buffered Saline
Tem Temsirolimus
TIMP tissue inhibitor of metalloproteinase TNM Tumor Lymphknoten Metastasen tRNA Transfer Ribonucleic acid
TSA Trichostatin A
u. a. unter anderem
u. Und
UICC Union internationale contre le cancer UPM Umdrehungen pro Minute
USA United States of America
VEGFRs Vascular endothelial growth factor receptors
VPA Valproat
z.B. zum Beispiel
XIV
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Möglichkeiten der Entwicklung des kastrationsresistenten
Prostatakarzinoms durch Reaktivierung des Androgenrezeptors ... 13
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Zusammenhänge des IGF-Systems mit dem Androgenrezeptor und PSA ... 19
Abbildung 3: Amplifikationsdigramm einer Real Time RT-PCR ... 60
Abbildung 4: Repräsentatives Elektropherogramm der isolierten RNA ... 65
Abbildung 5: Repräsentative Darstellung der Elektrophorese ... 66
Abbildung 6: Darstellung der Vitalität der behandelten Zellen. ... 67
Abbildung 7: Proliferationsaktivität der behandelten Zellen ... 68
Abbildung 8: Expression von KLK3 ... 70
Abbildung 9: Expression von IGF-1 ... 71
Abbildung 10: Expression von IGF-1-R ... 72
Abbildung 11: Expression von IGF-BP-3 ... 73
Abbildung 12: Durchschnittliches Wachstum der Tumoren ... 76
Abbildung 13 A-D: Wachstum der Tumoren der Mäuse. ... 80
Abbildung 14 A-B: Tumorgewebe der Gruppe 0 ... 83
Abbildung 15 A-D: Tumorgewebe der Gruppen 0-3 ... 88
Abbildung 16 A,B: Tumorgewebe der Gruppe 3 ... 90
Abbildung 17 A-B: Tumorgewebe der Gruppe 0 ... 92
Abbildung 18: PSA Menge gemessen im Serum der Mäuse ... 93
Abbildung 19: PSA-Sekretion der Tumoren ... 94
Abbildung 20: Expression von KLK3 im Tumorgewebe der Mäuse ... 95
Abbildung 21: Expression von IGF-1 im Tumorgewebe der Mäuse ... 96
Abbildung 22: Expression von IGF-1-R im Tumorgewebe der Mäuse ... 97
Abbildung 23: Expression von IGF-BP-3 im Tumorgewebe der Mäuse ... 98
Abbildung 24: Schematische Darstellung der möglichen Effekte von IGF-1 und IGF- 1-R auf den Androgenrezeptor und mTOR ... 103 Abbildung 25: Schematische Darstellung der möglichen Effekte von IGF-1 und IGF- 1-R auf den Androgenrezeptor sowie mTOR und eines möglichen Feedback
XV
Mechanismus von mTOR-Inhibitoren. ... 105
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Verwendete Primerpaare, Schmelzpunkte und Fragmentgrößen. ... 34Tabelle 2: Schema der Behandlung der LNCaP-Zellen ... 37
Tabelle 3: Schema der Behandlung der Mäuse ... 43
Tabelle 4: RNA-Konzentrationen der behandelten LNCaP-Zellen ... 66
Tabelle 5: Übersicht über die Anzahl der injizierten Mäuse, die Anzahl der Mäuse mit Tumorwachstum und die Anzahl der auswertbaren Mäuse. ... 75
Tabelle 6: Anzahl der Tiere pro Gruppe mit starkem, mäßigem oder geringem Tumorwachstum. ... 81
Tabelle 7: Durchschnittlicher Proliferationsindex ... 84
1
1 Einleitung
Das Prostatakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung des Mannes in westlichen Gesellschaften. Zwei Drittel der Karzinome sind bei Diagnosestellung auf die Prostata beschränkt und können erfolgreich behandelt werden (BÖRGERMANN et al., 2009). Das letzte Drittel kann jedoch auf Grund der Ausbreitung des Karzinoms nicht mehr erfolgreich operiert werden. Die Therapie der Wahl für diese Patienten ist der vollkommene Androgenentzug. Im Anschluss an die Remission von 2-4 Jahren, erfolgt jedoch die Entwicklung des kastrationsresistenten Prostatakarzinoms. Dieses kann nur noch palliativ behandelt werden. Die verwendeten Medikamente verringern die Schmerzen und erhöhen die Lebensqualität, verlängern das Leben aber nur um ein paar Monate (TANNOCK et al., 2004). Aus diesem Grund werden neue Medikamente benötigt, die auf karzinomspezifische Signalwege abzielen.
Das Ziel dieser Arbeit ist, zu untersuchen, ob die Behandlung von Prostatakarzinomzellen (LNCaP, Lymph node cacinoma of the prostate) und Prostatakarzinomzelltumoren mit dem Histondeacetylaseinhibitor Valproat und dem mTOR-Inhibitor Temsirolimus einen synergistischen Effekt auf die Proliferation der Tumorzellen zeigt und in wie weit das IGF-System dabei eine Rolle spielt.
Zu diesem Zweck wurden zum einen in einem Zellversuch LNCaP-Zellen mit Valproat, Temsirolimus oder einer Kombination aus beiden Stoffen behandelt.
Anschließend wurden die Vitalität der Zellen mit einem Alamar Blue Assay und die Proliferationsaktivität mit einem BrdU-ELISA gemessen. Die mRNA der Zellen wurde extrahiert und die Expression verschiedener Gene mittels Real Time RT-PCR bestimmt.
Zum anderen wurden LNCaP-Zellen in immunsupprimierte Nacktmäuse (NMRInu/nu) implantiert. Die Mäuse wurden mit Valproat per os, Temsirolimus intravenös oder der Kombination aus beiden Medikamenten behandelt. Eine Gruppe blieb unbehandelt und diente als Kontrolle. Das Wachstum der entstehenden Tumoren wurde zweimal die Woche vermessen. Nach sieben Wochen oder sobald es aus Tierschutzgründen
2
notwendig war, wurden die Mäuse getötet. Die mRNA aus einem Teil des Tumors wurde extrahiert und ebenfalls die Expression verschiedener Gene mittels Real Time RT-PCR bestimmt. Ein weiterer Teil des Tumors wurde histologisch aufbereitet und eine HE-Färbung sowie eine Immunhistochemie gegen den Proliferationsmarker Ki- 67 angefertigt.
3
2 Literaturübersicht
2.1 Das Prostatakarzinom
2.1.1 Epidemiologie
Das Prostatakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung des Mannes in Deutschland. Die Zahl der jährlichen Neuerkrankungen lag 2002 bei ca. 48650.
Damit handelt es sich bei knapp einem Viertel (22,3%) aller Krebsneuerkrankungen des Mannes um Prostatakrebs (Quelle: Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V. und das RKI, 2006).
Das mittlere Erkrankungsalter liegt bei 69 Jahren. Etwa 90 % aller Erkrankten sind älter als 60 Jahre. Bei unter 50-Jährigen werden kaum Prostatakarzinome beobachtet.
Die Anzahl der Neuerkrankungen stieg seit 1980 kontinuierlich an. Die altersstandardisierten Erkrankungsraten haben zwischen 1980 und 2004 um ca. 150
% zugenommen. Dies liegt zum einen an der demografischen Entwicklung und der damit ständig steigenden Lebenserwartung, zum anderen an einer verbesserten Früherkennung (ROHDE et al., 2007).
Die Sterberate ist seit 1970 fast unverändert. Wohingegen die Überlebensaussichten für Erkrankte sich seit 1980 verbessert haben. Anfang der 1980er-Jahre betrug die 5- Jahres-Überlebensrate ca. 70% (SCHÖN et al., 1999). Seit 1990 liegt die 5-Jahres- Überlebensrate bei über 80% (ROHDE et al., 2007).
Als Ursache für die verbesserten Überlebensaussichten spielen zum einen eine Verbesserungen der Therapiemöglichkeiten sowie eine Verbesserung der Heilungschancen durch häufigere Entdeckung von Tumoren in früheren Stadien mit frühzeitigerem Behandlungsbeginn eine Rolle. Zum anderen führt die frühere Entdeckung durch verbesserte Früherkennung rein rechnerisch zu verbesserten Überlebensaussichten, selbst wenn der Sterbezeitpunkt unbeeinflusst bliebe.
4
2.1.2 Ätiologie
Es werden verschiedene Risikofaktoren diskutiert, jedoch ist die genaue Ätiologie des Prostatakarzinoms nicht bekannt.
Das Alter des Patienten ist der wichtigste Risikofaktor. Etwa 90% der Erkrankten sind älter als 60 Jahre.
Zudem scheinen genetische Faktoren eine Rolle zu spielen. Dies stützt sich auf die Tatsache, dass das Risiko, an Prostatakrebs zu erkranken, deutlich steigt, wenn ein Verwandter erkrankt ist. So verdoppelt sich das Risiko, wenn ein Verwandter ersten Grades (Bruder, Vater) erkrankt ist und erhöht sich um das fünf- bis elffache wenn zwei oder mehr Verwandte ersten Grades oder zwei Verwandte vor dem 55.
Lebensjahr erkrankt sind (ROHDE et al., 2007).
Ebenfalls eine Rolle spielen hormonelle Faktoren. So erkranken Eunuchen nach einer Kastration vor der Pubertät nicht am Prostatakarzinom (historisch, z.B.
italienische Sänger im 17. und 18. Jahrhundert). Im Tierversuch konnte man Prostatakarzinome durch chronische Östrogen- und Androgengaben induzieren. Es ist jedoch nicht bekannt, ob Androgene auch beim Menschen eine Induktion oder Promotion auslösen (HAUTMANN u. HULAND, 2006).
Auch die Ernährung und Lebensweise können die Entstehung von Prostatakarzinomen beeinflussen. Dies wird aus der Beobachtung gefolgert, dass die Inzidenz für Prostatakrebs in Asien deutlich geringer ist als in Europa oder Nordamerika. Asiaten, die in die USA ausgewandert sind, haben jedoch ab der 2.
Generation das gleiche Risiko an Prostatakrebs zu erkranken wie andere Amerikaner. Dies wird auf die Änderung der Lebens- und Ernährungsweise zurückgeführt. Es wird diskutiert ob tierische Fette und Eiweiße dabei eine Bedeutung haben (WHITTEMORE et al., 1995).
2.1.3 Klinik
Die frühen Stadien des Prostatakarzinoms verlaufen oft völlig asymptomatisch. Etwa 90% der Karzinome haben ihren Ursprung in der peripheren Zone der Prostata und liegen somit entfernt von der Harnröhre. Diese Karzinome werden meist als
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Zufallsbefund nach einer Operation der gutartigen Prostatahyperplasie oder während einer Autopsie gefunden.
Erst im fortgeschrittenen Stadium kann es zu Obstruktionssymptomen und Hämaturie kommen.
In manchen Fällen zeigen sich klinische Symptome auch erst wenn das Karzinom bereits gestreut hat. Der bevorzugte Ort für eine hämatogene Metastasierung ist das Skelettsystem. Am häufigsten betroffen sind die Lendenwirbelkörper, der Oberschenkelknochen und das Becken. Patienten können über tiefe Rückenschmerzen, Ischiasbeschwerden und ziehende Schmerzen im Rücken klagen (HAUTMANN u. HULAND, 2006).
2.1.4 Früherkennung
Die Früherkennung mit guten Heilungschancen des Prostatakarzinoms ist mit einigen Schwierigkeiten verbunden. Einerseits ist eine kurative Therapie nur möglich solange das Karzinom auf die Prostata beschränkt ist und sich noch nicht extrakapsulär ausgebreitet hat. Das Karzinom muss also so früh wie möglich entdeckt werden. Von den 40 % der Männer in den westlichen Industrieländern, die das Risiko tragen im Laufe ihres Lebens ein Prostatakarzinom zu entwickeln, werden jedoch nur 10 % symptomatisch und nur 3 % versterben an diesem Karzinom (SCARDINO et al., 1992). Durch verbesserte Früherkennung besteht also auch immer die Gefahr der Überbehandlung.
Dies zeigt sich auch daran, dass bei Autopsien von über 80-Jährigen Männern in mehr als 60% der Fälle ein vorher nicht bekanntes Prostatakarzinom gefunden wird, an welchem diese Männer aber nicht verstorben sind. Durch das vermehrte Screening nach einem Prostatakarzinom im Rahmen der Vorsorge steigt auch das Risiko, dass Männer behandelt werden, die bis zu ihrem Lebensende nichts von ihrem Krebs erfahren hätten (SÖKELAND et al., 2007).
Im Rahmen des gesetzlichen Krebsfrüherkennungsprogramms haben gesetzlich versicherte Männer ab dem 45. Lebensjahr ein Anrecht auf eine jährliche
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Vorsorgeuntersuchung. Diese beinhaltet eine Untersuchung der Genitalorgane und eine digital-rektale Tastuntersuchung der Prostata.
Im Jahr 2004 beteiligten sich 18,3% der Männer ab 45 Jahren an Krebsfrüherkennungsuntersuchungen (Quelle: BUNDESMINISTERIUM FÜR GESUNDHEIT UND SOZIALE SICHERUNG, 2005). 2-5% der Prostatakarzinome werden durch die jährliche Vorsorgeuntersuchung entdeckt (ITO et al., 2001). Die Deutsche Gesellschaft für Urologie vertritt in einer aktuellen Leitlinie jedoch die Meinung, dass die alleinige digital-rektale Untersuchung der Prostata ohne Bestimmung des Prostataspezifischen Antigens (PSA) als Früherkennungsuntersuchung nicht ausreichend ist (WIRTH et al., 2009).
Mit der Tastuntersuchung können nur oberflächliche Tumoren erkannt werden, die schon eine gewisse Größe erreicht haben. Die Treffsicherheit sinkt weiter, wenn der Tumor auf der dem Darm abgewandten Seite der Prostata liegt. Außerdem ist das Untersuchungsergebnis stark von der Erfahrung und den Fähigkeiten des Untersuchers abhängig.
Laut der Leitlinie soll eine PSA-Bestimmung nur Männern empfohlen werden, die den Wunsch nach Früherkennung haben, da es derzeit noch keinen Nachweis gibt, dass eine PSA-Screeninguntersuchung zu einer Verlängerung des krankheitsspezifischen Überlebens führt (WEINMANN et al, 2005; ANDRIOLE et al., 2009; SCHRÖDER et al., 2009; WIRTH et al., 2009). Die betroffenen Männer müssen von ihrem behandelnden Arzt über die Risiken von möglichen diagnostischen und therapeutischen Behandlungen und über die Folgen von falsch-positiven und falsch- negativen Ergebnissen aufgeklärt werden.
Das zukünftige Ziel von Vorsorgeuntersuchungen muss daher sein, behandlungs- bedürftige Prostatakarzinome zu finden und die Gefahr der Überbehandlung zu minimieren.
2.1.5 Das Prostataspezifische Antigen
Das PSA ist ein Glykoprotein, welches durch das Gen KLK3 codiert wird. PSA wird ausschließlich in den Ausführungsgängen der Prostata gebildet und trägt zur
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Verflüssigung des Ejakulats bei. In geringen Mengen tritt PSA auch ins Blut über und kann im Serum nachgewiesen werden. Ein Prostatakarzinom kann zu einer Erhöhung des PSA-Wertes führen, jedoch zeigen 20% aller entdeckten Karzinome einen normalen PSA-Wert (HAUTMANN u. HULAND, 2006). Andererseits gibt es auch viele andere patientenabhängige Einflussgrößen, die den PSA-Wert unabhängig von einer Karzinomerkrankung erhöhen können. So spielen neben Alter, Prostatagröße und Ethnie auch therapeutische und diagnostische Eingriffe am unteren Harntrakt, Leberfunktionsstörungen sowie Prostatitis und benigne Prostatahyperplasie eine Rolle (LEIN, 2002; STROHMAIER, 2002).
Im Allgemeinen werden Werte im Serum unter 4 ng/ml als Normalwert angegeben (CATALONA et al., 1994).
Um die Aussagekraft des PSA-Tests zu erhöhen, kann die PSA- Anstiegsgeschwindigkeit gemessen werden. Durch ein Prostatakarzinom steigt die PSA-Serumkonzentration jährlich deutlich stärker als bei Patienten mit gutartigen Prostataerkrankungen. Der Grenzwert liegt bei 0,75 ng/ml/Jahr (CARTER et al., 1992).
Zusätzlich kann noch die PSA-Dichte gemessen werden. Dabei wird der PSA-Wert in Relation zum Prostatavolumen gestellt, da mit zunehmender Größe der Prostata durch benigne Prostatahyperplasie der PSA-Wert ebenfalls steigt. Eine PSA-Dichte über 0,15 gilt als verdächtig (HAUTMANN u. HULAND, 2006).
Laut der Leitlinie der Deutschen Gesellschaft für Urologie soll im Rahmen einer Vorsorgeuntersuchung eine Prostatabiopsie empfohlen werden, wenn einer der folgenden Punkte zutrifft:
1. Kontrollierter PSA-Wert > 4 ng/ml
2. Karzinomverdacht bei digital-rektaler Untersuchung 3. Auffälliger PSA-Anstieg
(WIRTH et al., 2009).
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2.1.6 Stadieneinteilung
Prostatakarzinome können durch verschiedene Bewertungssysteme in Entwicklungsstadien eingeteilt werden. Bei der TNM-Klassifikation der UICC (Union internationale contre le cancer) wird das Karzinom anhand der Ausdehnung des Primärtumors, der betroffenen regionalen Lymphknoten und der vorhandenen Fernmetastasen beurteilt (SOBIN et al., 2009).
Weltweite Anwendung findet die Einteilung nach Gleason. Dieses System wurde zwischen 1960 und 1975 von dem Pathologen Donald F. Gleason entwickelt und basiert auf der histologischen Beurteilung von HE (Hämatoxylin Eosin) gefärbten Prostatakarzinompräparaten. Dabei wird der Differenzierungsgrad der am häufigsten und am zweithäufigsten vorkommenden Zellpopulation beurteilt und mit 1 bis 5 bewertet. Beide Werte werden addiert und bilden den so genannten Gleason-Score.
Dabei beschreibt z.B. der Score 2 die am besten differenzierten Tumoren, Score 10 die am wenigsten differenzierten Tumoren (GLEASON, 1966; MELLINGER et al., 1967).
2.1.7 Therapie
Bei der Wahl der richtigen Therapie spielen Tumorstadium, Differenzierungsgrad, Allgemeinzustand und biologisches Alter des Patienten eine Rolle (SÖKELAND et al., 2007).
Ist ein Tumor weder zu tasten noch im bildgebenden Verfahren darstellbar und wurde er nur zufällig z.B. im Rahmen einer Behandlung der benignen Prostatahyperplasie histologisch diagnostiziert, kann abgewartet werden. In solchen Fällen wird der Patient regelmäßig untersucht und der PSA-Wert bestimmt. Nach 10 Jahren haben 15-20% der betroffenen Männer mit einem behandlungsbedürftigen Tumor zu rechnen.
Bei lokalisierten Karzinomen, die nur auf die Prostata beschränkt sind, ist die radikale Prostatektomie die Therapie der Wahl. In diesen Fällen kann die Therapie kurativ, dass heißt heilend, sein. Allerdings sollten die Patienten noch eine mittlere Lebenserwartung von mehr als 10 Jahren haben. Die Lebenserwartung ist zu
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berücksichtigen, weil durch das langsame Wachstum des Tumors ein 70-jähriger ein Risiko von 10% hat in den nächsten 10 Jahren an dem Karzinom zu sterben aber ein 50%iges Risiko durch eine andere Ursache zu versterben.
Die wichtigsten Risiken der Operation sind Impotenz mit bis zu 100%, Inkontinenz (5%) oder Harnröhrenstriktur (5%) (HAUTMANN u. HULAND, 2006).
Eine Alternative stellt die Strahlentherapie dar. Bei dieser Therapie wird entweder von außen bestrahlt oder durch das Einbringen von strahlendem Material (Brachytherapie) von innen. Die Brachytherapie hat den Vorteil, dass eine höhere Strahlendosis genutzt werden kann, ohne benachbarte Gewebe zu schädigen.
Die wichtigste Nebenwirkung ist auch bei der Bestrahlung die Impotenz (ROHDE et al., 2007).
Im Falle eines fortgeschrittenen Prostatakarzinoms, bei dem der Tumor bereits extrakapsulär ausgebreitet ist und Metastasen vorhanden sind, steht die antiandrogene Therapie im Vordergrund. Diese beruht auf der Tatsache, dass 80%
der Karzinome hormonsensitiv sind. Bei diesen Patienten wird mit einer Remission, dass heißt einem Rückgang des Tumors, innerhalb von 2-4 Jahren gerechnet. Die Therapie ist aber niemals heilend sondern nur palliativ. Auf die Remission folgt ein erneutes Wachstum von kastrationsresistenten Karzinomzellen.
20% der Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakarzinom zeigen kein Ansprechen auf eine Hormontherapie. Bei Ihnen handelt es sich ebenfalls um ein kastrationsresistentes Prostatakarzinom (HAUTMANN u. HULAND, 2006).
Bei der Therapie des kastrationsresistenten Prostatakarzinoms handelt es sich um eine symptomatische Therapie, die zum Ziel hat, die Lebensqualität der Patienten zu erhalten oder zu verbessern. Als Therapieoptionen stehen Chemotherapie und Schmerztherapie zur Verfügung. Bei asymptomatischen Patienten besteht auch die Möglichkeit des Abwartens, da ein Überlebensvorteil bei frühzeitig begonnener Chemotherapie im Vergleich zum Beginn bei Symptomen nicht erwiesen ist (WIRTH et al., 2009).
Patienten mit einer symptomatischen, fortschreitenden Erkrankung, die sich in einem guten Allgemeinzustand befinden, sollte eine Therapie mit dem Zytostatikum Docetaxel in Kombination mit Prednisolon empfohlen werden. Für diese
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Medikamentenkombination ist eine Verbesserung der Schmerzen und Lebensqualität erwiesen. Außerdem wurde eine Verlängerung des Gesamtüberlebens nachgewiesen. Diese beträgt allerdings nur wenige Monate (TANNOCK et al., 2004).
2.2 Der Androgenrezeptor und das kastrationsresistente Prostatakarzinom
Der Androgenrezeptor gehört zur Familie der nuklearen Steroidrezeptoren und vermittelt die Wirkung der männlichen Sexualhormone. Solange diese den Rezeptor noch nicht erreicht haben, befindet er sich diffus verteilt im Zytoplasma (TYAGI, et al., 2000). Dort ist er inaktiv und zur Stabilisierung an sog. Chaperone (u.a.
Hitzeschock-Proteine) gebunden (CENTENERA et al., 2008).
Der Ligand des Androgenrezeptors in gesunden Prostatazellen und Prostatakarzinomzellen ist Dihydrotestosteron, welches durch die 5α-Reduktase aus Testosteron gebildet wird. Testosteron besitzt ebenfalls die Fähigkeit, an den Androgenrezeptor zu binden. Seine Affinität ist jedoch geringer, als die des Dihydrotestosterons (PENNING et al., 2008).
Erreicht der Ligand den Androgenrezeptor kommt es zu einer Konformationsänderung: Die Hitzeschock-Proteine lösen sich vom Androgenrezeptor ab und dieser wandert in den Zellkern (CENTENERA et al., 2008). Dort bindet der Androgenrezeptor zusammen mit Coaktivatoren als Transkriptionsfaktor an spezifische DNA-Sequenzen und bewirkt die Expression von verschiedenen Genen, welche u. a. eine Rolle für das Zellwachstum und das Überleben der Zellen spielen (KNUDSEN u. PENNING, 2010). Außerdem gehört zu ihnen das KLK3, welches für das PSA-Protein codiert. Durch die Messung des PSA im Serum besteht also indirekt die Möglichkeit, die Aktivität des prostataspezifischen Androgenrezeptors zu bestimmen (YOUNG et al., 1991; LUKE u. COFFEY, 1994).
In gesunden Prostatazellen besteht ein Gleichgewicht zwischen Zellwachstum und Zelltod. In der Karzinomzelle ist dieses Gleichgewicht jedoch gestört. Durch
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Veränderungen im Signalweg des Androgenrezeptors wirken die Androgene nicht mehr über einen parakrinen Signalweg, der zu einer Wachstumshemmung führt, sondern erhalten die Fähigkeit, autokrin zu wirken. Über diesen autokrinen Signalweg bewirken die Androgene eine Stimulation der Proliferation, was zu unkontrolliertem Wachstum und letztendlich zur Tumorentstehung führt. (GAO et al., 2001). Deshalb ist die Therapie der Wahl bei einem fortgeschrittenen Prostatakarzinom die antiandrogene Therapie. Das Antiandrogen verdrängt das Dihydrotestosteron vom Androgenrezeptor, so dass. dieser nicht mehr in den Zellkern eindringen kann und somit seine Wirkung ausbleibt. Bei erfolgreicher Behandlung geht der Tumor in Regression (HAUTMANN u. HULAND, 2006). Leider bewirken die Antiandrogene aber keine dauerhafte Regression des Tumors und damit Heilung. Fast alle Tumoren beginnen nach 2-4 Jahren wieder zu wachsen. Ab diesem Zeitpunkt spricht man von einem kastrationsresistenten Karzinom, da der Tumor trotzt chemischer oder organischer Kastration weiter wächst. Dabei steigt das PSA im Blut wieder an, was u. a. darauf hindeutet, dass der Androgenrezeptor wieder als Transkriptionsfaktor arbeitet.
Es existieren verschiedene Wege durch die der Androgenrezeptor reaktiviert werden kann (Abbildung 1).
1. Veränderungen am Androgenrezeptor
a) Durch Überexpression des Androgenrezeptorgens kommt es zu einem Über- schuss von Androgenrezeptor–Molekülen in der Zelle (LINJA et al., 2001). Es wird vermutet, dass dadurch zum einen die Wirkung von antiandrogenen Medikamenten, die den Androgenrezeptor blockieren sollen (z.B. Bicalutamid), geschwächt wird, da mehr Androgenrezeptoren vorhanden sind, die blockiert werden müssen. Zum anderen erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass Spuren von Testosteron, welche trotz chemischer oder chirurgischer Kastration zurückbleiben, einen Androgenrezeptor finden, den sie aktivieren können.
b) Mutationen des Androgenrezeptorgens können dazu führen, dass das Spektrum der möglichen Liganden erhöht wird. So können dann auch andere Steroidhormone, wie z.B. Progesteron oder Cortisol, den Androgenrezeptor
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aktivieren (BERREVOETS et al., 1993). Eine solche Mutation besitzt auch die in dieser Arbeit verwendete Prostatakarzinomzelllinie LNCaP. Durch eine Punktmutation am Androgenrezeptorgen kommt es zu einem Wechsel der Aminosäure Threonin zu Alanin in der Ligandenbindungsdomäne des Androgenrezeptors. Dadurch können nicht nur Androgene sondern auch Östrogen und Anti-Androgene den Androgenrezeptor der LNCaP-Zelle stimulieren (VELDSCHOLTE et al., 1990).
c) Durch alternatives Spleißen der prä-mRNA des Androgenrezeptors verändert sich die Struktur des Rezeptors. Seine Liganden-bindende Region geht verloren und er erhält die Fähigkeit, auch ohne Liganden dauerhaft aktiv zu sein (DEHM et al., 2008; GUO et al., 2009).
d) Veränderungen der Phosphorylierung am Androgenrezeptorprotein können die Rezeptor-Aktivität erhöhen. Ponguta et al. wiesen nach, dass eine Deregulierung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) zu einer Phosphorylierung des Androgenrezeptors am Serine-578 führen kann. Dies führte zu einer erneutem Aktivität des Androgenrezeptors und damit zu Zellproliferation (PONGUTA et al., 2008).
2. Veränderungen der Androgenrezeptor-Cofaktoren
Es wird vermutet, dass eine Deregulierung von Co-Aktivatoren oder ein vermindertes Vorhandensein von Co-Repressoren die Aktivität des Androgenrezeptors erhöht (KNUDSEN u. PENNING, 2010). So konnte gezeigt werden, dass eine verminderte Expression des Co-Repressors Prohibitin die Aktivität des Androgenrezeptors erhöht (DAI et al., 2008; DART et al., 2009).
3. Tumoreigene Liganden Synthese
Als Anpassung an eine antiandrogene Therapie kann das kastrationsresistente Prostatakarzinom mit einer tumoreigenen Androgensynthese reagieren. Diese führt zu einer erhöhten Androgenrezeptor-Aktivität (LOCKE et al., 2008; MONTGOMERY et al., 2008 A).
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(modifiziert nach KNUDSEN u. PENNING, 2010) Abbildung 1: Möglichkeiten der Entwicklung des kastrationsresistenten Prostatakarzinoms durch Reaktivierung des Androgenrezeptors. (ii) Reaktivierung des Androgenrezeptors durch Androgenrezeptorgen-Amplifikation und -Überexpression, Mutationen am Androgenrezeptorgen, Veränderungen der Phosphorylierung am Androgenrezeptor, alternatives spleißen, Deregulation von Co-Aktivatoren oder ein vermindertes Vorhandensein von Co-Repressoren und tumoreigene Liganden Synthese. (iii) Wachstum des kastrationsresistenten Tumors mit steigendem PSA Wert. AC:
Acetylierung, AR: Androgen Rezeptor, CoAct: Co-Aktivatoren, CoR: Co-Repressoren, CRPC:
Kastrationsresistentes Prostatakarzinom, GF: Growth Factor, P: Phosphorylierung, Src: Sarcoma, Sumo: Sumoylierung.
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2.3 Das IGF-System
Das Insulin-like growth factor System (IGF-System) ist ein komplexes System. Es besteht aus zwei Wachstumsfaktoren (IGF-1 und IGF-2), zwei IGF-Rezeptoren (IGF- 1-R und IGF-2-R), sechs IGF-Bindungsproteinen (IGF-BP-1 bis 6) und IGF-BP spaltenden Proteasen.
IGF sind Mediatoren des Wachstumshormons (Growth Hormone, GH) und stimulieren ähnlich wie Insulin die Glukoseaufnahme in Fett- und Muskelzellen (GANTEN u. RUCKPAUL, 2006). Darüber hinaus spielen sie eine wichtige Rolle in der Zellproliferation, -differenzierung, -apoptose und -transformation (MOSCHOS u.
MANTZOROS, 2002).
2.3.1 IGF-1
IGF-1 ist ein Peptidhormon bestehend aus 70 Aminosäuren. Er kann in nahezu allen Körperzellen gebildet werden, seine Hauptbildungsstelle ist jedoch die Leber. Dort wird die Produktion vor allem von GH beeinflusst (SCHWANDER et al.,1983). Die Serumkonzentration von IGF-1 ist jedoch von vielen Faktoren abhängig und kann u.
a. auch von Sexualhormonen (MURPHY u. FRIESEN, 1988) und durch mangelnde Kalorienzufuhr (EMLER u. SCHALCH, 1987) beeinflusst werden. Wie wichtig IGF-I für das Wachstum und die Organentwicklung ist, wurde anhand von IGF-1 knock-out Mäusen gezeigt. Diese Mäuse wogen zum Zeitpunkt ihrer Geburt nur 60% des Gewichts von gleichalten Wildtyp Mäusen. Außerdem zeigten sie eine hohe perinatale Sterblichkeit, unterentwickelte Muskeln und Lungen, sowie Unfruchtbarkeit (BAKER et al., 1993; LIU et al., 1993, POWELL-BRAXTON et al., 1993). Obwohl die Leber der Hauptbildungsort von IGF-1 ist, scheint für Wachstum und Entwicklung auch die Bildung in allen anderen Körperzellen eine große Rolle zu spielen. Mäuse bei denen nur die leberspezifische Produktion von IGF-1 ausgeschaltet wurde, zeigten keine signifikanten Unterschiede im Wachstum (SJOGREN et al., 1999).
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2.3.2 IGF-2
IGF-2 besteht aus 67 Aminosäuren und kann genauso wie IGF-1 in fast allen Körperzellen gebildet werden. Die Serumkonzentration von IGF-2 ist höher, als die von IGF-1 und wird nicht von GH reguliert (MOSCHOS u. MANTZOROS, 2002). IGF- 1 und IGF-2 werden beide über den IGF-1-R vermittelt und haben beide eine proliferative und antiapoptotische Wirkung. IGF-2 kann darüber hinaus noch an den IGF-2-Rezeptor binden (O'DELL u. DAY, 1998). IGF-2 spielt eine wichtige Rolle in der embryonalen und fetalen Entwicklung. In der postnatalen Phase ist er jedoch weniger wichtig, da er dort von IGF-1 ersetzt werden kann (BAKER et al., 1993).
2.3.4 IGF-Rezeptoren
Der IGF-1-R ist ein Glykoprotein welches sich auf der Oberfläche fast jeder Zelle befindet. Er gehört zu der Superfamilie der Tyrosinkinase-Rezeptoren und bindet IGF-1, IGF-2 und Insulin mit abnehmender Affinität (MOSCHOS u. MANTZOROS, 2002; STEELE-PERKINS et al., 1988).
IGF-1-R ist verbunden mit verschiedenen intrazellulären "second messenger"
Systemen und ist über diese an der Proliferation und Differenzierung von normalen Zellen, aber auch an der Entwicklung von Krebszellen beteiligt (SELL et al., 1993;
SELL et al., 1994). Eine Aktivierung von IGF-1-R führt zu einem Fortschreiten des Zellzyklus, DNA Synthese und vermehrter Translation (WERNER u. LE ROITH, 1997).
Die Expression von IGF-1-R wird von vielen Tumorsuppressoren wie z.B. p53 (WERNER et al., 1996; PRISCO et al., 1997) vermindert, wohingegen die meisten Wachstumsfaktoren (ROSENTHAL et al., 1991; RUBINI et al., 1994), Steroide (Östrogene, Kortikosteroide) (DAWS et al., 1996; CLARKE et al., 1997) und hypophysäre Hormone (GH, FSH,) seine Expression erhöhen (HERNANDEZ, 1995).
Der IGF-2/Mannose-6-Phosphat-Rezeptor (M6P) ist ein Bindungsprotein, das ebenfalls auf der Zelloberfläche vieler Zellen vorkommt. Er bindet M6P tragende lysosomale Enzyme und IGF-2. Der IGF-2-R beeinflusst den Transport von
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lysosomalen Enzymen von ihrem Ort der Synthese, dem Golgi-Apparat, zu den Lysosomen (CHEN et al., 1997) sowie die extrazelluläre Konzentration von IGF-2 indem er die Endozytose und Proteolyse von IGF-2 in den Lysosomen vermittelt (OKA et al., 1985; KIESS et al., 1987).
Außerdem wird vermutet, dass es sich bei dem IGF-2-R um einen Tumorsuppressor handelt, da er in verschiedenen Tumoren vermindert exprimiert wird (HANKINS et al., 1996).
2.3.5 IGF-Bindungsproteine (IGF-BP)
Zu dem IGF-System gehören weiterhin 6 IGF-Bindungsproteine, die die biologische Wirkung der IGF positiv wie negativ beeinflussen können und auch IGF-unabhängige Wirkungen zeigen (DE MELLOW u. BAXTER, 1988; BLAT et al., 1989; MCCUSKER et al., 1990; FRANKLIN et al., 2003; HAN et al., 2011).
IGF-BP spielen eine große Rolle für die IGF-Bioverfügbarkeit. Durch die Bindung von IGF-1 und IGF-2 an IGF-BP erhöht sich die biologische Halbwertszeit der IGF erheblich. Freier IGF im Serum hat eine Halbwertszeit von ca. 10 Minuten, wohingegen an IGF-BP gebundener IGF eine Halbwertszeit von 20-30 Minuten besitzt (GULER et al., 1989). 99% der zirkulierenden IGF ist an IGF-BP gebunden, davon liegen 75 bis 90% gebunden an IGF-BP-3 vor. IGF-BP-3 und -5 assoziieren nach der Bindung von IGF noch mit einer säurelabilen Untereinheit und haben dann eine Halbwertszeit von 12-15 Stunden (BAXTER, 1988; GULER et al., 1989; JOGIE- BRAHIM et al., 2009).
IGF-BP besitzen neben IGF- abhängigen auch IGF-unabhängige Wirkungen. So kann IGF-BP-3 über einen IGF-unabhängigen Weg Apoptose induzieren (HAN et al., 2011; FRANKLIN et al., 2003). Außerdem wurde gezeigt, dass durch den Tumorsuppressor p53 die Expression von IGF-BP-3 erhöht wird (GRIMBERG et al., 2005).
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2.3.6 IGF-BP Proteasen
Die IGF-BP Proteasen sind eine heterogene Gruppe von Molekülen, die alle die Fähigkeit haben, IGF-BP zu spalten. Zu ihnen gehören z.B. Kallikreine und Matrixmetalloproteine (FOWLKES et al., 1994), Cathepsine und das PSA (COHEN et al., 1992; KOISTINEN et al., 2002). Durch die Proteolyse der IGF-BP entstehen Fragmente mit einer geringeren Affinität für IGF (RAJAH et al., 1995). Die IGF dissoziieren von den IGF-BP und stehen dem IGF-1-R als Reaktionspartner zur Verfügung. Die Rolle des PSA als IGF-BP Protease könnte für die zukünftige Behandlung von Prostatakarzinomen wichtig sein. Das PSA spaltet die IGF-BP-3 und -5 und erhöht damit die Verfügbarkeit von IGF für den IGF-1-R, welcher seine proliferative und antiapoptotische Wirkung vermehrt entfalten kann (MOSCHOS u.
MANTZOROS, 2002).
2.3.7 Das IGF-System und Tumorentstehung
Welche Rolle das IGF-System bei der Entstehung von verschiedenen Tumoren spielt, ist Gegenstand intensiver Forschung. Es existieren Hinweise, dass ein enger Zusammenhang zwischen dem IGF-System und dem Wachstum von Prostatakrebs besteht. IGF-1 und IGF-1-R werden von gesunden Prostatazellen ebenso exprimiert wie von Zellen der benignen Prostatahyperplasie und von den meisten Prostatakarzinom-Zelllinien (COHEN et al., 1991; IWAMURA et al., 1993; KIMURA et al., 1996). IGF hat einen proliferativen Effekt auf normale und transformierte Prostataepithelzellen (COHEN et al., 1991; IWAMURA et al., 1993). Eine Inhibition von IGF-1 und des IGF-1-R reduzieren die Proliferation, sowie die Migration und das invasive Verhalten von Prostatakrebszellen (BURFEIND et al., 1996; MARELLI et al., 1999; MARELLI et al., 2007). Es wurde gezeigt, dass IGF-BP-3 das Wachstum von LNCaP-Zellen inhibiert (BOYLE et al., 2001).
In in vivo Versuchen zeigte sich eine Zunahme der Expression von IGF-1 und IGF-1- R bei der Entwicklung von androgenabhängigen Prostatatumoren hin zu androgenunabhängigeren und damit maligneren Tumoren (NICKERSON et al., 2001). Mäuse, die durch eine Mutation eine verringerte IGF-1 Produktion aufwiesen,
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zeigten ein verringertes Wachstum von LNCaP-Tumoren (TAKAHARA et al., 2011).
In mehreren epidemiologischen Studien wurde versucht, zu ermitteln, in wie weit ein Zusammenhang zwischen IGF-1 Konzentration und Tumorrisiko besteht. Dabei wurde gezeigt, dass hohe IGF-1 Konzentrationen im Serum und/oder niedrige IGF- BP-3 Konzentrationen mit einem erhöhten Risiko für verschiedene Tumoren assoziiert sind, darunter auch Prostatakrebs. Diese Ergebnisse weisen auf eine schützende Funktion des IGF-BP-3 hin, einerseits über die Verringerung der Verfügbarkeit von freiem IGF und andererseits über IGF-unabhängige Mechanismen (CHAN et al., 1998; STATTIN et al., 2000; ALLEN et al., 2005). Jedoch gibt es auch Studien mit gegenteiligen Ergebnissen, die einen entgegengesetzten oder keinen Zusammenhang zwischen IGF-1 und IGF-BP-3 Konzentration und Tumorrisiko zeigen (SEVERI et al., 2006).
Kürzlich wurden verschiedene Interaktionen zwischen dem Androgenrezeptor und IGF-1 nachgewiesen. So erhöht eine androgene Stimulierung die Expression von IGF-1-R in Prostataepithelzellen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass IGF-1 den Androgenrezeptor dabei unterstützt, in Abwesenheit von Androgenen in den Zellkern zu gelangen. Dieser Effekt konnte durch einen IGF-1-R inhibierenden Antikörper wieder aufgehoben werden (WU et al., 2006).
Abbildung 2 fasst die Wechselwirkungen des IGF-Systems mit dem Androgenrezeptor sowie PSA zusammen:
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Abbildung 2: Schematische Darstellung der Zusammenhänge des IGF-Systems mit dem Androgenrezeptor und PSA. IGF-1 aktiviert den IGF-1-R und führt damit zu Proliferation von Zellen.
Zusätzlich unterstützt IGF-1 den Androgenrezeptor dabei in Abwesenheit von Androgenen in den Zellkern zu gelangen, wo dieser die Expression von PSA stimuliert. PSA spaltet IGF-BP, welche dadurch mehr IGF-1 zur Verfügung stellen.
AR: Androgenrezeptor, : spaltet, : führt zu, : vermehrte Expression.
Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass das IGF-System eine wichtige Rolle im Prostatakarzinom spielt und dass ein Zusammenhang zwischen dem IGF- System und dem Androgenrezeptor besteht. Damit stellt das IGF-System ein mögliches Therapieziel des Prostatakarzinoms und des kastrationsresistenten Prostatakarzinoms dar.
2.4 Histone und Epigenetik
2.4.1 Aufbau der Chromosomen
Die DNA im Zellkern bildet zusammen mit den Histonen Untereinheiten des Chromatins, die sog. Nukleosomen. Ein Nukleosom besteht aus ca. 146 Basenpaaren der DNA, die um ein Histon-Oktamer gewunden ist. Jedes Histon- Oktamer besteht aus je zwei Kopien der vier Proteine H2A, H2B, H3 und H4
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(KORNBERG, 1977; MARKS et al., 2001; GRAW, 2010). Diese Proteine sind evolutionär hoch konserviert und besitzen je einen lysinreichen N-Terminus. Ein weiteres Histon, H1, wird als „linker-Histon“ bezeichnet und lagert sich den Nukleosomen an. Es verbindet die Nukleosomen untereinander bis zur maximal kondensierten Form der DNA, den Chromosomen (MARKS et al., 2001; GRAW, 2010).
2.4.2 Epigenetik
Unter Epigenetik versteht man vererbbare Änderungen, die nicht auf einer Änderung der Erbsubtanz beruhen (WATSON et al., 2010).
Pluripotente, embryonale Stammzellen besitzen die Fähigkeit, sich zu verschiedenen Zelltypen zu differenzieren und ihre spezifischen Funktionen auch beizubehalten.
Damit z.B. aus der gleichen Erbinformation eine Leber- oder Nierenzelle entsteht, ist es wichtig, dass entsprechende Gene in der richtigen Zelle zur richtigen Zeit abgelesen werden. Mechanismen, die diese Transkription regulieren, werden unter dem Sammelbegriff Epigenetik zusammengefasst (WAGNER u. JUNG, 2010).
Ein wichtiges Element der epigenetischen Genregulation ist die Modifikation von Histonen. Diese Modifikation findet überwiegend an den N-Termini der vier Histone H2A, H2B, H3 und H4 statt und betrifft vor allem die basischen Aminosäuren Lysin und Arginin (WU u. GRUNSTEIN, 2000). Dabei sind die angeknüpften oder abgespaltenen Gruppen sehr vielfältig. Es handelt sich um Acetyl-, Methyl- und Phosphatgruppen sowie um größere Moleküle wie Ubiquitin und ADP-Ribose (BIEL et al., 2005). Durch die verschieden modifizierten Histone entsteht ein Code, der von Proteinen und Multiproteinkomplexen abgelesen werden kann und so zu Genaktivierung und/oder –inaktivierung führt (STRAHL u. ALLIS, 2000; MARKS et al., 2001).
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2.5 Histondeacetylasen und Valproat
2.5.1 Histonacetyltransferasen und Histondeacetylasen
Eine Form der epigenetischen Veränderung ist die Acetylierung. Sie wird beeinflusst durch die Histonacetyltransferasen (HAT) und die Histondeacetylasen (HDAC).
Diese Enzyme katalysieren die Acetylierung und Deacetylierung an der Aminosäure Lysin am N-Terminus der Histone (XU et al., 2007).
Durch die Acetylierung kommt es zu einer Abnahme der positiven Ladung am Histon und dadurch zu einer schwächeren Bindung mit der negativ geladenen DNA. Die Chromatinstruktur wird gelockert und dadurch die Transkriptionsaktivität erhöht.
Folglich führt eine Acetylierung zu einer erhöhten Genexpression. Die HDAC bewirken somit durch die Deacetylierung eine Festigung der Chromatinstruktur und ein Ruhen der Transkriptionsaktvität (XU et al., 2007).
Neben den Histonen wurden mehr als 50 andere Proteine als Reaktionspartner der HDAC identifiziert. Zu ihnen gehören Proteine mit regulatorischen Funktionen bei Zellproliferation, Zellmigration und Zelltod (DOKMANOVIC et al., 2007), wie z.B. das Tumorsuppressorprotein p53 (JUAN et al., 2000), das Hitzeschockprotein 90 (BALI et al., 2005) und α-Tubulin (HUBBERT et al., 2002). Die Reaktion der HDAC mit diesen Proteinen kann zu einer Veränderung der Proteinstabilität führen oder die Interaktion zwischen diesen Proteinen und anderen beeinflussen (MARKS u. XU, 2009).
Im menschlichen Organismus wurden bislang 18 HDAC identifiziert und klassifiziert.
Sie werden in vier Klassen eingeteilt. Klasse I beinhaltet HDAC1, HDAC2, HDAC 3 und HDAC8 (RUNDLETT et al., 1996; TAUNTON et al., 1996). Klasse II ist aufgeteilt in die Klassen IIa (HDAC 4, HDAC5 und HDAC7) und IIb (HDAC6 und HDAC10) (XU et al., 2007). Zu der Gruppe III gehören sieben Enzyme. (BLANDER u. GUARENTE, 2004). Zur Klasse IV gehört nur HDAC11 (GAO et al., 2002).
Die wichtige Rolle der HDAC in der Entwicklung, konnte anhand von Knock-out- Mäusen gezeigt werden. Tiere, denen die HDAC 1, HDAC 3 oder HDAC 7 fehlten,
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starben bereits während der frühen embryonalen Entwicklung (LAGGER et al., 2002;
CHANG et al., 2006; MONTGOMERY et al., 2008 B).
Waren HDAC 2 oder HDAC 4 ausgeschaltet, wurden die Tiere nur wenige Tage alt (VEGA et al., 2004; MONTGOMERY et al., 2007). Nur Tiere, denen HDAC 5, HDAC 6 oder HDAC 9 fehlten, überlebten (CHANG et al., 2004; ZHANG et al., 2008).
2.5.2 Histondeacetylasen im Prostatakarzinom
Verschiedene Studien setzten sich bereits mit der Rolle der HDAC im Prostatakarzinom auseinander. In diesen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass verschiedene HDAC in Prostatakrebszellen höher exprimiert werden als im gesunden Prostatagewebe (HALKIDOU et al., 2004; WEICHERT et al., 2008; WANG et al., 2009).
Wang et al. untersuchten Gewebeproben von 98 Männern. Sie verglichen die Expression von verschiedenen HDAC in Primärtumoren, rezidiven Tumoren und Metastasen im Vergleich zu gesundem Prostatagewebe. Dabei zeigte sich eine Überexpression von verschiedenen HDAC im malignen Gewebe (WANG et al., 2009).
Außerdem korreliert in einer anderen Studie, durchgeführt an 192 Tumorgewebeproben, eine hohe HDAC-Expression mit Tumordedifferenzierung und verstärkter Proliferation (WEICHERT et al., 2008).
Das Gewebe der benignen Prostatahyperplasie (BPH) unterschied sich in einer weiteren Studie in der Expression der HDAC1 nicht von gesundem Prostatagewebe (HALKIDOU et al., 2004). Allerdings wurde in drei von fünf untersuchten Proben der BPH eine „low grade PIN“ (Prostatische Intraepitheliale Neoplasie) gefunden. Diese PIN Läsion gilt als Vorläufer des Prostatakarzinoms und zeigte ein vollkommen anderes Expressionsprofil mit erhöhter Expression von HDAC1. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Expression von HDAC1 mit der Entwicklung des malignen Phänotyps verbunden ist. In den Primärtumoren dieser Studie und noch stärker in den kastrationsresistenten Prostatakarzinomen konnte ebenfalls eine deutliche Hochregulierung der HDAC1 gefunden werden (HALKIDOU et al., 2004).
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Durch die vermehrte HDAC-Expression und der damit verbundenen verminderten Histonacetylierung kommt es zu einer Verfestigung der Chromatinstruktur. Die dadurch verringerte Transkriptionsaktivität führt zu einer veränderten Expression verschiedener Gene, die für die Differenzierung und geregelte Proliferation von gesunden Zellen wichtig sind. So wird z.B. das antiproliferativ wirkende p21-Gen in Tumoren mit erhöhter Expression von HDAC vermindert gebildet und erst eine Behandlung mit Histondeacetylaseinhibitoren (HDACi) führt wieder zu einer erhöhten Expression von p21 (SAMBUCETTI et al., 1999; RICHON et al., 2000).
2.5.3 Histondeacetylaseinhibitoren
HDACi hemmen die Wirkung der HDAC und führen über eine vermehrte Acetylierung an den Histonen zu einer erhöhten Transkriptionsaktivität. HDACi werden nach ihrer chemischen Struktur in mehrere Gruppen eingeteilt. Dazu gehören (DOKMANOVIC et al., 2007):
Hydroxamsäuren (z.B. Trichostatin A, Vorinostat) Zyklische Peptide (z.B. Apicidin)
Kurzkettige Fettsäuren (z.B. Valproat) Benzoamide (z.B. MS-275).
2.5.3.1 Valproat
Eines der Medikamente, dessen Wirkung auf das fortgeschrittene Prostatakarzinom in dieser Arbeit untersucht worden ist, ist das Valproat.
Valproat wird seit den 60er Jahren des 20. Jahrhunderts in der Epilepsietherapie als Antikonvulsivum eingesetzt. Es ist das Mittel der Wahl bei primär generalisierter sowie unklassifizierbarer Epilepsie und wird auch zur Migränetherapie eingesetzt (WAGNER et al., 2010).
Göttlicher et al. konnten zeigen, dass es sich bei Valproat außerdem um einen HDACi handelt. Sie wiesen nach, dass Valproat die Aktivität von HDAC hemmt und
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zu einer Hyperacetylierung an den Histonen führt (GÖTTLICHER et al., 2001).
Die Aktivität von Valproat liegt im millimolaren Bereich und es zählt damit zu den schwach wirksamen HDACi. Jedoch stehen diesem Nachteil für die klinische Anwendung einige Vorteile gegenüber. Durch die langjährige Erfahrung mit der Substanz ist das Nebenwirkungsprofil gut bekannt und es bestehen wenig Bedenken hinsichtlich der Sicherheit. Außerdem ist Valproat oral zu nahezu 100% verfügbar (KUENDGEN u. GATTERMANN, 2007; WAGNER et al., 2010).
Die Wirkung von Valproat auf Krebszellen ist Gegenstand intensiver Forschung. An verschiedenen Krebszelllinien wurden die tumorhemmenden Eigenschaften von Valproat nachgewiesen. Brustkrebszellen (MT-450) reagieren auf eine Behandlung mit Valproat mit der Initiation von Apoptose. An einem in vivo Modell dieser Zelllinie führte die Applikation von Valproat zu einem verringerten Tumorwachstum (GÖTTLICHER et al., 2001). Neuroblastomzellen (SH-SY5Y) reagieren auf eine Applikation von Valproat mit der Induktion von Zelldifferenzierung (YUAN et al., 2001). Prostatakrebszellen (LNCaP, DU-145 und PC-3) werden von Valproat in ihrem Wachstum gehemmt (ABDUL u. HOOSEIN, 2001). Diese Inhibition der Proliferation kann dadurch erklärt werden, dass Valproat zu einer veränderten Expression von verschiedenen Genen führt, die Proliferation oder Apoptose beeinflussen. So führte die Behandlung der Prostatakrebszelllinie LNCaP mit Valproat zu einer erhöhten Expression des Metalloproteinase inhibitors 3 (TIMP-3) und IGF-BP-3 (THELEN et al., 2004). TIMP-3 ist in verschiedenen Krebszellen beteiligt an der Induktion von Apoptose (BAKER et al., 1999; BOND et al., 2002).
IGF-BP-3 wirkt dem proliferativ wirkendem IGF entgegen und hat selber proapototische Eigenschaften (COHEN et al., 1991; IWAMURA et al., 1993; BOYLE et al., 2001). PSA wurde durch die Behandlung von LNCaP-Zellen mit Valproat vermindert exprimiert (THELEN et al., 2004). PSA spaltet IGF-BP-3 und erhöht damit die Verfügbarkeit von IGF für den IGF-1-R. Deshalb wirkt auch eine verringerte Expression von PSA dem proliferativ wirkenden IGF entgegen. Es wurde gezeigt, dass Valproat zu einer erhöhten Expression des Östrogenrezeptors ß führt und auf diesem Wege die aufgezeigten Expressionsveränderungen entstehen können (STETTNER et al., 2007).
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Valproat führt weiterhin zu einer Apoptoseinduktion in LNCaP-Zellen. An diesem Vorgang beteiligt ist die erhöhte Expression des Apoptose-induzierenden Rezeptors Fas und seines Liganden (ANGELUCCI et al., 2006).
Xia et al., konnten in einem in vitro Experiment zeigen, dass eine Behandlung der Prostatakarzinomzelllinie LNCaP mit Valproat die Acetylierung am Histon H3 erhöht.
Außerdem wurde die Expression des Tumorsuppressors p21 erhöht und die Proliferation der Zellen reduziert. In einem in vivo Versuch wurde das Tumorwachstum von LNCaP-Zellen in immunsupprimierten Nacktmäusen gehemmt.
(XIA et al., 2006).
Desweiteren führt Valproat zu einer Hemmung des Zellzyklus von LNCaP-Zellen und verringert die Expression der Cyclin abhängigen Kinase (Cdk1), was zu einer Abnahme des Androgenrezeptors auf DNA- und Proteinebene führt (CHEN et al., 2006; WEDEL et al., 2011).
2.6 Mammalian target of rapamycin (mTOR)
Neben Valproat wurde die Wirkung eines weiteren Medikaments auf das fortgeschrittene Prostatakarzinom in dieser Arbeit untersucht. Dabei handelt es sich um den mTOR-Inhibitor Temsirolimus.
mTOR ist der Name einer Serin/Threonine Kinase, die in allen Säugetierzellen vorkommt (SHAW u. CANTLEY, 2006). Seinen Namen erhielt das Protein, weil es als Zielstruktur des Immunsuppressivums Rapamycin im Säugetier erkannt wurde.
Über verschiedene Signalkaskaden beeinflusst mTOR das Überleben, das Wachstum und den Metabolismus von Zellen (GANTEN u. RUCKPAUL, 2008).
Dabei stellt mTOR ein Schlüsselprotein dar, welches evolutionär hoch konserviert vorliegt (BJORNSTI u. HOUGHTON, 2004). Bei fehlerhafter Ausbildung des Proteins durch embryonale Mutationen kommt es zum Tod des Organismus (HENTGES et al., 2001). mTOR wirkt als Sensor für zellulären Stress, der zum Beispiel durch Nährstoff- oder Wachstumsfaktormangel entsteht und das Zellwachstum bezüglich der Verfügbarkeit von Energie und Nährstoffen koordiniert. Kommt es zu einer
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Mangelsituation hemmen mTOR und seine nachgeschalteten Signalwege die Proteinbiosynthese der Ribosomen, verringern die Zellgröße und führen im Extremfall zum Zelltod durch Autophagie und Apoptose, gleichzeitig stimulieren sie die Zellproliferation bei günstigen Wachstumsbedingungen (GANTEN u.
RUCKPAUL, 2008; YUAN et al., 2009).
mTOR liegt, gebunden an andere Proteine, als Komplex vor. Dabei kann man zwei verschiedene Komplexe unterscheiden (LOEWITH et al., 2002). mTOR complex 1 (mTORC1) wird durch das Immunsuppressivum Rapamycin und seine Analoga gehemmt und fördert die Proteintranslation. mTOR complex 2 (mTORC2) wird nicht durch Rapamycin und seine Analoga beeinflusst und reguliert das Zytoskelett, die Zellmotilität und aktiviert den AKT-Signalweg (Proteinkinase B) (RUSSELL et al., 2011). Der AKT-Signalweg vermittelt die Proliferation von Zellen (GANTEN u.
RUCKPAUL, 2008).
Die Aktivität von mTOR wird durch verschiedene positive und negative Signale reguliert. Positiv wirken Wachstumsfaktoren wie IGF-1 und sein Rezeptor IGF-1-R, HER (human epidermal growth factor receptor) mit Liganden und VEGFRs (vascular endothelial growth factor receptors) mit Liganden. Diese positive Wirkung wird durch den PI3K-AKT Signalweg vermittelt. PI3K (Phosphoinositid-3-Kinase) vermittelt aktivierende Signale von Zelloberflächenrezeptoren an nachgeschaltete Signalwege im Inneren der Zelle (YUAN et al., 2009).
Negativer Regulator vom PI3K-AKT Signalweg und damit auch von mTOR ist PTEN (Phosphatase und Tensin Homolog; WU et al., 1998; RAMASWAMY et al., 1999).
PTEN ist ein Tumorsuppressor, der im aktivierten Zustand den Zelltod durch Einleitung der Apoptose verursacht (SALMENA et al., 2008). Mutationen an diesem Enzym begünstigen die unkontrollierte Zellvermehrung und sind bei vielen Tumoren zu finden (LI et al., 1997; STECK et al., 1997). Auch im Prostatakarzinom konnte nachgewiesen werden, das PTEN in Karzinomzellen, im Gegensatz zu normalem Prostatagewebe, vermindert exprimiert wird (KREMER et al., 2006).
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2.6.1 mTOR-Inhibitoren und Temsirolimus
mTOR spielt somit bei der Entstehung von verschiedenen Tumoren eine wichtige Rolle. Aus diesem Grund wurden und werden mTOR-Inhibitoren intensiv erforscht, mit dem Ziel, neue Medikamente in der Tumortherapie zu entwickeln.
Die Substanz Rapamycin (Sirolimus) wurde 1975 auf der Insel Rapa Nui aus dem Bakterium Streptomyces hygroscopicus isoliert (VÉZINA et al., 1975). Anfangs war nur ihre immunsuppressive Wirkung bekannt. Sirolimus wird in der Transplantationsmedizin zur Vorbeugung von Abstoßungsreaktionen eingesetzt (PASCUAL, 2006). 1981 wurde erstmals die antitumoröse Wirkung von Sirolimus beschrieben (DOUROS u. SUFFNESS, 1981). Durch die Entwicklung von Sirolimus- ähnlichen Substanzen konnten die pharmakologischen Eigenschaften der mTOR- Inhibitoren verbessert werden, so dass heute mehrere mTOR-Inhibitoren in der Tumortherapie eingesetzt werden (YUAN et al., 2009).
Bei dem Medikament Temsirolimus handelt es sich um einen Ester des Rapamycins.
Es wurde als ein intravenös zu applizierender mTOR-Inhibitor entwickelt (YU et al., 2001).
Temsirolimus wurde 2007 von der US Food and Drug Administation (FDA) und der European Medicine Agency (EMEA) für die Behandlung des fortgeschrittenen Nierenzellkarzinoms zugelassen. Zuvor hatte eine Phase III Studie an 626 Patienten mit fortgeschrittenem Nierenzellkarzinom gezeigt, dass Temsirolimus das Überleben der Patienten verlängert (HUDES et al., 2007).
In der Prostatakrebsforschung bewirkten mTOR-Inhibitoren wie Temsirolimus und RAD001 (Everolimus) in in vitro Versuchen einen antiproliferativen Effekt. LNCaP- Zellen, die mit Temsirolimus behandelt wurden, zeigen einen Rückgang von Proliferation und eine Hemmung des Zellzyklus (FUNG et al., 2009). Dies konnte ebenfalls für RAD001 nachgewiesen werden (WEDEL et al., 2011).
Widersprüchliche Ergebnisse existieren dagegen zur Wirkung von mTOR-Inhibitoren in in vivo Versuchen. Die Behandlung von induzierten Prostatakarzinomen mit dem mTOR-Inhibitor Rapamycin zeigte einen Rückgang des Tumorwachstums (ZHANG et al., 2009). LNCaP-Tumoren reagierten dagegen nicht auf eine Behandlung mit
28 RAD001 (SCHAYOWITZ et al., 2010).
2.7 Zelllinien
Verschiedene Zelllinien sind verfügbar, um das Prostatakarzinom zu untersuchen.
DU-145 wurde aus einer Gehirnmetastase isoliert. Diese Zelllinie wächst androgenunabhängig, exprimiert keinen Androgenrezeptor und kein PSA (STONE et al., 1978; MITCHELL et al., 2000).
PC-3 wurde aus einer Knochenmetastase isoliert und wächst ebenfalls androgenunabhängig, exprimiert keinen Androgenrezeptor und kein PSA (KAIGHN et al., 1979; MITCHELL et al., 2000).
VCaP (vertebral-cancer of the prostate) wurde aus einer Knochenmetastase eines Wirbelkörpers isoliert und wächst androgenabhängig. Sie exprimiert PSA und den
„wildtypischen“ Androgenrezeptor (KORENCHUK et al., 2001).
LNCaP wurde aus einer humanen Lymphknotenmetastase isoliert. Sie wächst androgenabhängig, exprimiert den Androgenrezeptor und PSA (HOROSZEWICZ et al., 1980; HOROSZEWICZ et al., 1983). Die LNCaP-Zellen besitzen eine Punktmutation in der Ligandenbindungsstelle des Androgenrezeptors. Diese ermöglicht die Stimulation des Androgenrezeptors nicht nur durch Androgene sondern auch durch Östrogene und Antiandrogene (VELDSCHOLTE et al., 1990).
Eine solche Mutation stellt für Karzinomzellen eine Möglichkeit dar, eine antiandrogene Therapie zu umgehen und sich somit zu kastrationsresistenten Karzinomzellen zu entwickeln. Aus diesem Grund wurde für die vorliegende Studie die LNCaP-Zelllinie als Modell eines kastrationsresistenten Prostatakarzinoms gewählt.
2.8 Mausmodell
Zur Untersuchung des Prostatakarzinoms in vivo können zwei verschiedene Formen von Mausmodellen unterschieden werden. Zum einen die Gruppe der
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Xenotransplantationen. Dabei werden Prostatakarzinomzellen subkutan in immunsupprimierte Nacktmäuse implantiert. An der Implantationsstelle wächst dann in der Regel ein subkutaner Tumor. Alle oben genannten Zelllinien können für Xenotransplantationen verwendet werden (DU-145 (MICKEY et al., 1980), PC-3 (WARE et al., 1982), VCaP (KORENCHUK et al., 2001), LNCaP (HOROSZEWICZ et al., 1983).
Desweiteren wird das sogenannte Tramp (transgenic adenocarcinoma of the mouse prostate) Modell zur Untersuchung von Prostatakarzinomen verwendet. Dabei handelt es sich um eine transgene Mauslinie, die Karzinome in ihrer eigenen Prostata entwickelt (GREENBERG et al., 1995).
Das Ziel dieser Arbeit war, die additive Wirkung von Valproat und Temsirolimus auf LNCaP-Zellen als Modell für ein kastrationsresistentes Prostatakarzinom zu untersuchen. Um eine gute Vergleichbarkeit zwischen in vitro und in vivo Versuchen zu gewährleisten, wurde das Modell der Xenotransplantation von LNCaP-Zellen gewählt.
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3 Material und Methoden
3.1 Geräte
Gerät Hersteller
Agilent Bioanalyzer 2100 Agilent Technologies, Waldbronn (D)
CO2- Auto-Zero Heraeus, Hanau (D)
Gefrierschrank (-20°C) Liebherr, Biberach, (D) Gefrierschrank (-80°C) GFL, Burgwedel (D)
GenAmp PCR System 2400 PerkinElmer, Rodgau-Jügesheim (D) Homogenisator Ultra-Turrax IKA Labortechnik, Staufen (D)
iCycler BioRad, München (D)
Kühlschrank, Silkafrost comfort Siemens, München (D) Kulturbank, Hera Safe Heraeus, Düsseldorf (D)
Labofuge 400 R Heraeus, Hanau (D)
LabofugeGL Heraeus, Hanau (D)
Leica TP1020 Leica, Wetzlar (D)
Linear Stainer II Sakura, Staufen (D)
Mikroskop ID 03 Zeiss, Jena (D)
Mozaic Färbeautomat Zymed Laboratories, San Francisco (USA)
MS1 Minishaker IKA, Staufen (D)
Omnifuge 2.0 RS Heraeus, Hanau (D)
Pipetus Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt (D)
Schlittenmikrotom Hn 40 Reichert & Jung, Heidelberg (D) Tissue Block Dispender PAG 12 Medite, Burgdorf (D)
Tissue-Tek Film Eindeckautomat Sakura, Staufen (D)
Vortexer IKA, Staufen (D)
