Weiterentwicklung des Systems insektenuniversell einsetzbarer

Im Fokus dieser Arbeit stehen Entwicklungen auf dem Gebiet der Sterilen Insekten Technik.

Um die Voraussetzung zur Anwendung konstruierter und im Modellinsekt Drosophila melanogaster evaluierter Systeme zu schaffen, wurden entsprechende Konstrukte in ein potentiell universell in Insektenspezies einsetzbares Keimbahntransformationssystem eingegliedert (Horn & Wimmer, 2000).

Weiterentwicklungen der Transformationsvektoren sollen zunächst dargestellt werden.

5.1.1 Etablierung diskriminierbarer Transformationsmarker für genetische Multikomponentensysteme

Genetische Werkzeuge basieren oftmals auf mehreren Transgenkomponenten. Während in Drosophila die simultane Präsenz unterschiedlicher Transgene durch verschiedene speziesendogene Phänotypenmarker nachgewiesen werden kann, könnten in weniger gut charakterisierten Insekten-spezies unterscheidbare, fluoreszierende Transformationsmarker diesen Zweck erfüllen.

Zusätzlich zu den bereits erfolgreich eingesetzten und diskriminierbaren Spektralvarianten EYFP und ECFP (Horn, 1999; Horn & Wimmer, 2000) wurde DsRed, das rot fluoreszierende Protein einer Spezies der Seeanemonengattung Discosoma (Matz et al., 1999), als möglicher weiterer Transformationsmarker untersucht (die biophysikalischen Eigenschaften der Fluoreszenzproteine sind beschrieben in Kap. 4.3.1). Dazu wurden Taufliegen mit Konstrukten, die das Transformations-markergen 3xP3-DsRed exprimieren, transformiert.

Im unpigmentierten Komplexauge zeigen bzgl. 3xP3-DsRed transgene Taufliegen ein leicht und eindeutig erkennbares Fluoreszenzsignal (Abb. 5.1B und Abb. 5.2B). DsRed-Fluoreszenz kann (im Gegensatz zu EGFP-Fluoreszenz) durch die Kopfkutikula hindurch erkannt werden (vergleiche Abb. 5.1B und Abb. 5.1C). Der Grund hierfür liegt möglicherweise in der Tatsache, daß biologische Gewebe im längerwelligen sichtbaren Spektralbereich weniger Energie absorbieren.

Abb. 5.1: DsRed und EGFP als unabhängig nachweisbare Transformationsmarker.

Bzgl. der Transformationsmarkergene 3xP3-DsRed und 3xP3-EGFP transgene Fliegenköpfe wurden mit einer Kaltlichtquelle (A) oder mit Anregungslicht und den Filtersystemen Cy3.5/DsRed (B) und YellowGFP (C) beobachtet.

40 Ergebnisse

Da DsRed eine Reifungszeit von Tagen besitzt (Baird et al., 2000), wurde der Frage nachgegangen, ob der Transformationsmarker 3xP3-DsRed im Vergleich zu 3xP3-EGFP in Stadien der Drosophila-Entwicklung zeitlich verzögert nachweisbar ist. DsRed-Fluoreszenz konnte frühestens im letzten Stadium der Embryogenese (im Bolwig’schen Organ, dem larvalen Lichtsinnesorgan) erkannt werden und ist gegenüber der frühesten Nachweisbarkeit des EGFP-Signals (Horn et al., 2000) verzögert. Für larvale und pupale Stadien hingegen konnte das für 3xP3-EGFP beschriebene Expressionsmuster (Horn, 1999; Horn et al., 2000) bestätigt werden.

Im Drosophila-Komplexauge lassen sich DsRed und EGFP mit Hilfe der Filtersysteme Cy3.5/DsRed und YellowGFP eindeutig unterscheiden (vergleiche Abb. 5.1B und Abb. 5.1C), was mit den spektralen Eigenschaften der beiden Fluorophore übereinstimmt (siehe Abb. 4.2). Somit können DsRed und EGFP als unabhängig voneinander nachweisbares Markerduo verwendet werden.

Abb. 5.2: ECFP, EYFP und DsRed als unabhängig nachweisbares Markertrio.

Bzgl. Bac{3xP3-DsRed}, Bac{3xP3-EYFP} und Her{3xP3-ECFP} transgene Fliegenköpfe wurden mit einer Kaltlichtquelle (A) oder mit Anregungslicht (B-F) beobachtet unter Verwendung der Bandpassfiltersysteme Cy3.5/DsRed (B), YellowGFP (C) bzw. CyanGFP (D) oder der Langpassfiltersysteme GFP2 (E) bzw. V (F). Mit den Bandpassfiltersystemen können die Fluorophore ECFP, EYFP und DsRed jeweils spezifisch im Komplexauge nachgewiesen werden.

Um zu untersuchen, ob sich DsRed auch unabhängig von EYFP und ECFP nachweisen läßt, wurden bzgl. 3xP3-DsRed, 3xP3-EYFP und 3xP3-ECFP transgene Fliegenköpfe mit unterschiedlichen Bandpass- (Cy3.5/DsRed, YellowGFP, CyanGFP) und Langpassfiltersystemen (GFP2, V) beobachtet (Abb. 5.2). Die verwendeten Bandpassfiltersysteme erwiesen sich als spezifisch für die jeweilige Spektralvariante: Der Cy3.5/DsRed-Filter für DsRed (Abb. 5.2B), der YellowGFP-Filter für EYFP (Abb. 5.2C) sowie der CyanGFP-Filter für ECFP (Abb. 5.2D). Hingegen scheinen im GFP2-Filter (Abb. 5.2E) neben EYFP auch ECFP und DsRed etwas durch und auch im V-Filter (Abb. 5.2F) sind alle drei Markerproteine sichtbar.

Mit 3xP3-ECFP, 3xP3-EYFP und 3xP3-DsRed liegt somit ein Trio an unabhängig voneinander nachweisbaren Transformationsmarkern vor. Die Integration dieser Markergene in Transformationsvektoren schafft die Voraussetzung zur Markierung unterschiedlicher Transgene in komplexen genetischen Multikomponentensystemen.

5.1.2 Modifikationen der insektenuniversell einsetzbaren Transformationsvektoren

Ein Satz von neun Transformationsvektoren, die auf den Transformationsmarkergenen 3xP3-EGFP, 3xP3-EYFP und 3xP3-ECFP sowie auf den Breitband-Transposons piggyBac, Hermes und mariner basieren, wurde bereits detailliert dokumentiert (Horn, 1999; Horn & Wimmer, 2000). Die initiale Version der piggyBac- und mariner-Transformationsvektoren trug eine Insertion des Transformationsmarkergens innerhalb der transposasekodierenden Sequenz. Eine einfache Insertionsinaktivierung schließt jedoch die Rekonstitution eines funktionellen Transposasegens nicht aus (z.B. über kryptische Spleißstellen oder genetische Umlagerungsprozesse). Daher wurde eine modifizierte Serie dieser Transformationsvektoren hergestellt (bezeichnet mit dem Appendix „afm“;

siehe Kap. 4.1.2.1.1). In diesen Vektoren sind 0,8 kb (piggyBac) bzw. 0,6 kb (mariner) des offenen Leserasters des Transposasegens deletiert. Die Funktionalität dieser Transformationsvektoren wurde exemplarisch für pBac{3xP3-ECFPafm} und pMos{3xP3-EYFPafm} mittels Drosophila- Keimbahntransformation nachgewiesen. Mit pMos{3xP3-EYFPafm} wurden dabei G₀-Männchen, welche transgene Nachkommen hervorbrachten, mit einer im Vergleich zu nichtmodifizierten mariner-Transformationsvektoren höheren Frequenz erhalten (10% vs. 4%; bezogen auf die Gesamtzahl fertiler G0-Männchen). Hermes-basierte Transformationsvektoren (Horn, 1999; Horn &

Wimmer, 2000) wurden nicht modifiziert, da sie Derivate des Konstruktes pHermes[EGFP]

(Pinkerton et al., 2000) darstellen, in dem bereits 1,5 kb des Hermes-Transposasegens deletiert sind.

In der vorliegenden Arbeit wurden über bereits beschriebene Vektoren (Horn, 1999; Horn &

Wimmer, 2000) hinausgehend auf dem Transposon Minos (Franz & Savakis, 1991) sowie auf dem Transformationsmarkergen 3xP3-DsRed basierte Transformationsvektoren hergestellt (siehe Kap.

4.1.2.1.2) und verwendet.

42 Ergebnisse

5.1.3 Erweiterung der

piggyBac-Transformationsvektoren um Isolatorelemente

Um die Möglichkeit der Abschirmung von Transgenen gegenüber der Wirkung am genomischen Integrationslocus aktiver Enhancer zu bieten, wurden piggyBac-Transformations-vektoren mit Isolatorelementen ausgestattet (siehe Kap. 4.1.2.1.3): Zum einen wurde dazu ein Isolatorelement in ECFP- und EYFP-markierte piggyBac-Vektoren integriert, welches die konstitutive 5’ DNaseI-hypersensitive Stelle (5’HS4) aus der Locus-Kontrollregion der γ-Globin-Domäne des Huhns umfaßt. 5’HS4 vermittelt Isolierung eines Transgens gegenüber Enhanceraktivierung sowohl in Humanzellkultur als auch in Drosophila (Chung et al., 1993). Zum anderen wurde die Isolatorregion des D. melanogaster gypsy Retrotransposons (Geyer & Corces, 1992) in einen DsRed-markierten piggyBac-Vektor eingegliedert. Mit Isolatorelementen flankierte finale Transgenkonstrukte sind gekennzeichnet (>> symbolisiert eine Tandemwiederholung der 5’HS4-Sequenz; > bezeichnet das gypsy-DNA-Element). Der vollständige, aktualisierte Satz an zur Verfügung stehenden universellen Transformationsvektoren ist in Abb. 5.3 schematisch dargestellt.

Abb. 5.3: Aufbau universeller Transformationsvektoren und Prinzip der Zwei-Schritt-Klonierungs-prozedur. Auf piggyBac, Hermes, mariner bzw. Minos basierende Transformationsvektoren sind dargestellt. >

symbolisiert das gypsy-, >> das 5’HS4-Isolatorelement. Komplexe Transgenkonstrukte können nach einer Zwei-Schritt-Klonierungsstrategie konstruiert werden: Vorstufen werden im ersten Schritt im „Shuttle-Vektor“

pSLfa1180fa (Horn & Wimmer, 2000) zusammengesetzt. Die multiple Klonierungsstelle (MCS) des pSLfa1180fa baut sich aus allen statistisch möglichen palindromischen Hexamersequenzen auf. Flankierend zur MCS trägt pSLfa1180fa Oktamer-Schnittstellen der Restriktionsenzyme FseI und AscI. Da universelle Transformationsvektoren ebenfalls FseI und AscI-Klonierstellen tragen, können Vorstufen im zweiten Schritt aus dem „Shuttle-Vektor“ flexibel in einen oder mehrere der Transformationsvektoren übertragen werden.

5.2 Ein System supprimierbarer embryonaler Letalität zur Erzeugung steriler

Im Dokument Entwicklung transgenbasierter Systeme zur Anwendung im Rahmen der Sterilen Insekten Technik, einer ökologisch verträglichen Schädlingsbekämpfungsmethode (Seite 57-61)