Konstrukte für SIT-Systeme

4.1.2.2.1.1 sry α -tTA und nullo-tTA Konstrukte

pBac{3xP3-EYFPafm; n1-tTA} = n1-tTA: Das 2,5 kb XbaI-FseI Fragment, das die tTA kodierende Region und den K10-Transkriptionsterminator trägt, wurde aus pSLfa_p-tTA-K10_fa isoliert. Die nullo-Nukleotidsequenz -413 bis +110 (n1; relativ zur Transkriptionsstartstelle) wurde mit den Primern CH44R und CH45F von dem Konstrukt pCNFHA38 (Hunter et al., 2002) amplifiziert und das PCR-Produkt mit AscI-XbaI geschnitten. Beide Fragmente wurden in den AscI-FseI geschnittenen Transformationsvektor pBac{3xP3-EYFPafm} kloniert, so daß das nullo- und das tTA-Fragment am ATG-Startkodon fusionierten. Die Integrität der n1-Region wurde durch Sequenzierung mit CH_6dm3_hstTAFWD bestätigt.

pBac{3xP3-EYFPafm; n2-tTA} = n2-tTA: Erzeugt analog zu n1-tTA, aber mit der nullo Nukleotidsequenz -133 bis +110, welche mit den Primern CH44R und CH46F von dem Konstrukt pCNFHA38 (Hunter et al., 2002) amplifiziert wurde. Die Integrität der n2-Region wurde durch Sequenzierung mit CH_6dm3_hstTAFWD bestätigt.

pBac{3xP3-EYFPafm; s1-tTA} = s1-tTA: Das 2,5 kb XbaI-FseI Fragment wurde aus pSLfa_p-tTA-K10_fa isoliert. Die sry α-Nukleotidsequenz -276 bis +46 (s1; relativ zur Transkriptionsstartstelle) wurde mit den Primern CHsryaRev und CHsrya2Fwd von dem Konstrukt pNRsry α (Vincent et al., 1986) amplifiziert und das PCR-Produkt mit AscI-XbaI geschnitten. Beide Fragmente wurden in den AscI-FseI geschnittenen Transformationsvektor pBac{3xP3-EYFPafm} kloniert, so daß das sry α- und das tTA-Fragment am ATG-Startkodon fusionierten. Die s1-Sequenz wurde mit CHsrya2Fwd als Sequenzierprimer verifiziert.

pBac{3xP3-EYFPafm; >>s1-tTA>>} = >>s1-tTA>>: Erzeugt analog zu s1-tTA, aber durch Klonierung der sry α- und tTA-Fragmente in den isolatorflankierten Transformationsvektor pBac{3xP3-EYFP>>af>>}. Der Vektor wurde in STBL2^TM kompetenten Zellen propagiert. Die s1-Sequenz wurde mit CHsrya2Fwd als Sequenzierprimer verifiziert.

pBac{3xP3-EYFPafm; s2-tTA} = s2-tTA: Erzeugt analog zu s1-tTA, aber mit der sry α-Nukleotidsequenz -181 bis +46, welche mit den Primern CHsryaRev und CHsrya1Fwd von dem Konstrukt pNRsry α (Vincent et al., 1986) amplifiziert wurde.

pBac{3xP3-EYFPafm; >>s2-tTA>>} = >>s2-tTA>>: Erzeugt analog zu s2-tTA, aber durch Klonierung der sry α- und tTA-Fragmente in den isolatorflankierten Transformationsvektor pBac{3xP3-EYFP>>af>>}. Der Vektor wurde in STBL2^TM kompetenten Zellen propagiert. Die s2-Sequenz wurde mit CHsrya1Fwd als Sequenzierprimer verifiziert.

pBac{3xP3-EYFPafm; s3-tTA} = s3-tTA: Erzeugt analog zu s1-tTA, aber mit der sry α-Nukleotidsequenz -143 bis +46, welche mit den Primern CHsryaRev und CH40F von dem Konstrukt pNRsry α (Vincent et al., 1986) amplifiziert wurde. Die Integrität der s3-Region wurde durch Sequenzierung mit CH_6dm3_hstTAFWD bestätigt.

pBac{3xP3-EYFP; s4-tTA} = s4-tTA: Das 1,7 kb AscI Fragment aus pSLfa_s4-tTA_fa wurde in den Transformationsvektor pBac{3xP3-EYFPafm} kloniert. Zur Keimbahntransformation wurde die Insertion mit tTA und dem Transformationsmarkergen in gleicher Orientierung gewählt.

pSLfa_s4-tTA_fa: Das 1,7 kb XhoI-HindIII Fragment, das die tTA kodierende Region unter Kontrolle des minimalen hsp70-Promotors und mit dem SV40-Transkriptionsterminator trägt, wurde aus pSL_fa-TRE-hs43-tTA-SV40_fa isoliert. Die sry α-Nukleotidsequenz -131 bis -34 (s4; relativ zur Transkriptionsstartstelle) wurde mit den Primern CH42R und CH41F von dem Konstrukt pNRsry α (Vincent et al., 1986) amplifiziert und das PCR-Produkt mit EcoRI-XhoI geschnitten. Beide Fragmente wurden in den EcoRI-HindIII geschnittenen Vektor pSLfa1180fa kloniert, so daß die sry α-Enhancerregion an den heterologen hsp70-Promotor fusionierte. Die Integrität der s4-Region wurde durch Sequenzierung mit M13R bestätigt.

pBac{3xP3-EYFP; s5-tTA} = s5-tTA: Erzeugt analog zu s4-tTA, aber aus pSLfa_s5-tTA_fa.

pSLfa_s5-tTA_fa: Erzeugt analog zu pSLfa_s4-tTA_fa, aber mit der sry α-Nukleotidsequenz -131 bis -49, welche mit den Primern CH43R und CH41F von dem Konstrukt pNRsry α (Vincent et al., 1986) amplifiziert wurde. Die Integrität der s5-Region wurde durch Sequenzierung mit M13R bestätigt.

pSL-fa-TRE-hs43-tTA-SV40-fa: Das 0,25 kb Asp718 Fragment (Schnittstellen mit Klenow aufgefüllt) wurde aus pCaSpeRhs43AUGβgal (Thummel & Pirotta, 1992) isoliert und in das Konstrukt pSLfa_TRE-tTA-SV40_fa kloniert, das zuvor mit EcoRI-(Schnittstelle mit Klenow aufgefüllt)-StuI geöffnet worden war. Durch diesen Klonierschritt wurde der hCMV-Basalpromotor gegen den hsp70-Basalpromotor (hs43) ausgetauscht. Die richtige Orientierung der TRE-hs43-Fusion wurde durch einen KspI-Verdau verifiziert.

pSLfa_TRE-tTA-SV40_fa: Das 1,0 kb EcoRI-BamHI Fragment aus pTet-Off (Clontech, Palo Alto, USA) wurde in das Konstrukt pSLfa_TRE-SV40_fa kloniert.

pSLfa_TRE-SV40_fa: Das 0,9 kb XhoI-(Schnittstelle mit Klenow aufgefüllt)-HindIII Fragment wurde aus pUHD10-3 (Gossen & Bujard, 1992) isoliert und in pSLfa1180fa kloniert, der zuvor mit EcoRI-(Schnittstelle mit Klenow aufgefüllt)-HindIII geöffnet worden war.

20 Materialien und Methoden

4.1.2.2.1.2 FBE-tTA Konstrukte

pBac{3xP3-EYFPafm; FBE-tTA}: Das 1,7 kb XhoI-FseI Fragment, das die tTA kodierende Region unter Kontrolle des minimalen hsp70-Promotors und mit dem SV40-Transkriptionsterminator trägt, wurde aus pSL_fa-TRE-hs43-tTA-SV40_fa isoliert. Die Sequenz des „Fat Body Enhancers-(FBE)“ der intergenischen Region der D. melanogaster Dotterproteingene Yp1 und Yp2 (-322 bis -197 relativ zur Yp1 Transkriptions-startstelle; Garabedian et al., 1986) wurde mit den Primern CH_FBE_FWD und CH_FBE_REV von genomischer Drosophila-DNA amplifiziert. Das Amplifikat wurde mit AscI-XhoI geschnitten. Beide Fragmente wurden in den AscI-FseI geschnittenen Transformationsvektor pBac{3xP3-EYFPafm} kloniert, so daß der FBE an den heterologen hsp70-Promotor fusionierte. Die Sequenz des FBE wurde durch Sequenzierung mit CH_6dm3_hstTAFWD verifiziert.

DsRedaf; >FBE-tTA>}: Das 1,8 kb AscI Fragment mit der FBE-tTA Sequenz aus pBac{3xP3-EYFPafm; FBE-tTA} wurde in den isolatorflankierten Transformationsvektor pBac{3xP3-DsRed>af>} kloniert.

4.1.2.2.2 Effektorkonstrukte

pBac{3xP3-ECFPaf; >>TREp-hid^Ala5>>}: Das 5,0 kb AscI Fragment aus pSLfa_TREp-hid^Ala5_fa wurde in den isolatorflankierten Transformationsvektor pBac{3xP3-ECFP>>af>>} kloniert. Zur Keimbahntransformation wurde die Insertion mit hid^Ala5 in entgegengesetzter Orientierung zu den Tandemwiederholungen des 5’HS4-Isolatorelements gewählt. Der Vektor wurde in STBL2^TM kompetenten Zellen propagiert.

pBac{3xP3-ECFPafm; TREp-hid^Ala5}: Das 5,0 kb AscI Fragment aus pSLfa_TREp-hid^Ala5_fa wurde in den Transformationsvektor pBac{3xP3-ECFPafm} kloniert. Zur Keimbahntransformation wurde die Insertion mit hid^Ala5 und dem Transformationsmarkergen in gleicher Orientierung gewählt. Das Effektorkonstrukt trägt die hid^Ala5 kodierende Region (Bergmann et al., 1998) unter Kontrolle der heptamerisierten Tet-Operatorsequenz fusioniert an den basalen P-Promotor.

pSLfa_TREp-hid^Ala5_fa: Die hid^Ala5 kodierende Region wurde als 3,9 kb ClaI-BamHI Fragment aus pBluescriptSK-hid^Ala5 (Geschenk von A. Bergmann) isoliert. Der P-Basalpromotor wurde mit den Primern CH_5'PIAsp718_2 und CH_3'PIClaI_2 von pSLfa_UASp_fa (Horn et al., 2003) als 0,2 kb Fragment amplifiziert und mit Asp718-ClaI nachgeschnitten. Beide Fragmente wurden in das Asp718-BamHI geschnittene Konstrukt pSLfa_TRE-SV40_fa ligiert.

pBac{3xP3-ECFPaf; >>TREhs43-hid^Ala5>>}: Das 5,0 kb AscI Fragment aus pSLfa_TREhs43-hid^Ala5_fa wurde in den isolatorflankierten Transformationsvektor pBac{3xP3-ECFP>>af>>} kloniert. Zur Keimbahntrans-formation wurde die Insertion mit hid^Ala5 in entgegengesetzter Orientierung zu den Tandemwiederholungen des 5’HS4-Isolatorelements gewählt. Der Vektor wurde in STBL2^TM kompetenten Zellen propagiert.

pSLfa_TREhs43-hid^Ala5_fa: Die hid^Ala5 kodierende Region wurde als 3,9 kb ClaI-BamHI Fragment aus pBluescriptSK-hid^Ala5 (Geschenk von A. Bergmann) isoliert. Der hsp70-Basalpromotor („hs43“-Fragment) wurde mit den Primern CH_5'hs43Asp718 und CH_3'hs43ClaI von pCaSpeR/hs43/AUG/βgal (Thummel &

Pirrotta, 1992) als 133 bp Fragment amplifiziert und mit Asp718-ClaI nachgeschnitten. Beide Fragmente wurden in das Asp718-BamHI geschnittene Konstrukt pSLfa_TRE-SV40_fa ligiert.

pBac{3xP3-ECFPafm; TRE(hCMV)-hid^Ala5}: Das 4,9 kb AscI Fragment aus pSLfa_TRE(hCMV)-hid^Ala5_fa wurde in den Transformationsvektor pBac{3xP3-ECFPafm} kloniert. Nur die Orientierung, in der die beiden SV40-Terminatoren maximalen Abstand zueinander einnehmen, wurde erhalten. Das Effektorkonstrukt trägt die hid^Ala5 kodierende Region (Bergmann et al., 1998) unter Kontrolle des TRE-hCMV-Promotors (Nukleotide 319-438 aus pUHD10-3, Gossen & Bujard, 1992).

pSLfa_TRE(hCMV)-hid^Ala5_fa: Das 3,9 kb EcoRI Fragment aus pBluescriptSK-hid^Ala5 (Geschenk von A. Bergmann) wurde in pSLfa_TRE-SV40_fa kloniert. Die Orientierung, in der das 5’ hid^Ala5-Ende an den hCMV-Basalpromotor fusioniert ist, wurde gewählt.

4.1.2.2.3 Konstrukte in pBluescript zur Herstellung markierter RNA

Die Vektoren pBluescriptSK und pBluescriptKS (Stratagene, Amsterdam) enthalten flankierend zur multiplen Klonierstelle Promotoren für die T3- oder T7-RNA-Polymerasen, so daß die Synthese (markierter) RNA (in vitro Transkription) in Sinn- oder Antisinn-Richtung zur DNA-Sequenz eines einklonierten Fragmentes möglich ist.

pBluescriptSK-hid^Ala5 (Geschenk von A. Bergmann): Enthält die hid^Ala5 kodierende Region als EcoRI Fragment in pBluescriptSKII.

pBluescriptKS-tTA: Das 1,0 kb EcoRI-BamHI Fragment aus pTet-Off, welches die tTA kodierende Region trägt, wurde in pBluescriptKSII kloniert.