4 Materialien und Methoden
6.2 Anwendungspotential des transgenbasierten Sterilisierungssystems
Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit lag in der Konstruktion und Analyse einer alternativen Methode zur konventionellen physikalischen Sterilisierung von Schadinsekten. Dazu wurde ein transgenbasierter Ansatz, der supprimierbare embryospezifische Letalität vermittelt, im Modellinsekt Drosophila realisiert. In diesem Abschnitt soll das Anwendungspotential dieser neuartigen Sterilisierungsmethode diskutiert werden.
6.2.1 Schadinsekten von Bedeutung für SIT-Anwendungen
Obwohl sich die SIT als ökologisch verträgliche und wirtschaftlich sinnvolle (Enkerlin &
Mumford, 1997; Mumford, 2000) genetische Kontrollmaßnahme erwiesen hat, ist ihre Anwendung gegenwärtig auf wenige Schädlinge beschränkt (Übersicht in: IAEA, 2003; Tab. 6.1).
Schadspezies Produktionskapazität (Millionen Puppen pro Woche)
Diptera: Tephritidae Ceratitis capitata 2300
Bactrocera spp. 440
Anastrepha spp. 340
Diptera: Calliphoridae Cochliomyia hominivorax 500
Diptera: Anthomyiidae Delia antiqua 7,5
Diptera: Culicidae Anopheles albimanus 7
Diptera: Glossinidae Glossina spp. 0,13
Lepidoptera: Gelechiidae Pectinophora gossypiella 84 Lepidoptera: Tortricidae Cydia pomonella 15
Tab. 6.1: Weltweite Produktionskapazitäten zur Erzeugung von sterilen Insekten für SIT-Kampagnen.
(Quelle: World-Wide Directory of SIT Facilities: http://www-ididas.iaea.org/ididas/start.htm)
Mit durchschlagendem Erfolg wird die SIT zur Bekämpfung der Mittelmeerfruchtfliege Ceratitis capitata eingesetzt. Dieser Erfolg geht zum einen auf die Anwendung eines klassisch-genetischen Systems zur Abtötung der Weibchen zurück (siehe Kap. 6.5.1; Franz et al., 1994;
Hendrichs et al., 1995; Robinson, 2002a). Zum anderen konnte für die Mittelmeerfruchtfliege ein Bestrahlungsprotokoll etabliert werden, das eine irreversible Sterilisierung ermöglicht, ohne dabei die Fitness übermäßig zu beeinträchtigen (siehe Kap. 6.3.1; Calcagno et al., 2002; Lux et al., 2002). Für Dipterenspezies, insbesondere für die Mittelmeerfruchtfliege, wird ein Wechsel zur transgenbasierten Sterilisierungstechnologie nur dann in Frage kommen, wenn diese hinsichtlich Fitnesserhaltung dem strahlungsbasierten Ansatz überlegen sein sollte.
Eine andere Situation liegt bei Insekten der Ordnung Lepidoptera vor, zu denen einige der ärgsten Schädlinge agrarwirtschaftlicher Produkte zählen (Pedigo, 2002). Die SIT als Kontrollmaßnahme spielt hier bislang eine untergeordnete Rolle, abgesehen von wenigen Spezies wie
dem Roten Kapselwurm (Pectinophora gossypiella) oder dem Apfelwickler (Cydia pomonella) (Tab.
6.1; Walters et al., 2000; Robinson, 2002b). Zur irreversiblen Sterilisierung von Lepidopteren mit holozentrischen Chromosomen sind hohe Strahlungsdosen erforderlich (siehe Kap. 3.4.2; LaChance et al., 1967), die die Kompetitivität massiv erniedrigen. Als Alternative zur Sterilisierung der freizusetzenden Generation ist das Konzept der Induktion von F1-Sterilität vorgeschlagen worden (Proverbs & Newton, 1962): Dabei wird die Spezies mit einer substerilisierenden Dosis an γ-Strahlen behandelt, so daß die F1-Generation überlebt, aber aufgrund akkumulierter Mutationen steril ist. F1 -sterilisierte Lepidopteren erwiesen sich als hinreichend kompetitiv (Studie zur F1-Sterilität des Apfelwicklers: Bloem et al., 1999). Dennoch fand dieses Konzept bislang keine über Pilotversuche hinausgehende Anwendung (Carpenter & Gross, 1993; Robinson, 2002b), da nach der Freisetzung die entstehende F1-Generation den agrarwirtschaftlichen Schaden zunächst verstärken würde. Bei Lepidopteren besteht demnach ein erhebliches Optimierungspotential hinsichtlich einer wirksamen Sterilisierungstechnologie.
6.2.2 Übertragbarkeit des transgenbasierten Sterilisierungssystems auf Schadinsekten
Das transgenbasierte Sterilisierungssystem könnte direkt auf eine Schadspezies übertragen werden, sofern die Funktionen aller Einzelkomponenten von Drosophila zur Schadspezies hin phylogenetisch konserviert sind. In diesem Abschnitt wird die Datenlage zur Übertragbarkeit des Transformationssystems, des Tet-Systems, des hid-Gens sowie der regulatorischen Sequenzen von Zellularisierungsgenen dargestellt.6.2.2.1 Übertragbarkeit des Transformationssystems
Transgene wurden mittels eines Keimbahntransformationssystems im Drosophila-Genom verankert, das auf dem Breitband-Transposon piggyBac und den Transformationsmarkergenen 3xP3-ECFP und 3xP3-EYFP beruht (Horn, 1999; Horn & Wimmer, 2000). In Abb. 6.1 ist der gegenwärtige Stand der Insekten-Transformationstechnologie zusammengefaßt. Keimbahntransformation konnte bereits für einige der SIT-relevanten Spezies (Tab. 6.1) etabliert werden. Im Vergleich zu den Transposons Hermes-, mariner- und Minos- wurden insbesondere piggyBac-Transformationsvektoren mit Fluoreszenzmarkern, zu denen auch 3xP3-basierte Marker zählen, mit großem Erfolg eingesetzt (Übersichtsartikel: Horn et al., 2002). Es sei an dieser Stelle angemerkt, daß das transgenbasierte Sterilisierungssystem dieser Arbeit nicht vom 3xP3-Marker abhängig ist. Sollte sich ein anderes Transformationssystem in einer Schadspezies bewährt haben, können beschriebene Transgen-konstrukte auch mit diesem im Genom integriert werden.
80 Diskussion
Abb. 6.1: Transformationstechnologie für Insektenspezies.
Auf piggyBac, Hermes, Minos und mariner basierte Keimbahntransformationen sind durch Pfeile dargestellt.
Die Verwendung speziesspezifischer Augenpigmentierungsmarker (rot), einer PCR-basierten Strategie (schwarz) oder fluoreszierender Proteine (grün) zum Transformationsnachweis ist angegeben. Innerhalb der Fluoreszenz-marker werden 3xP3-basierte (durchgezogene Linie) von auf anderen Promotoren basierten (gepunktete Linie) Transformationsmarkern unterschieden. Die Zugehörigkeit der Spezies zu den Familien oder Superfamilien der Tephritidae, Drosophilidae, Muscidae, Calliphoridae, Culicidae, Gelechiidae, Bombycidae, Tenebrionidae und Coccinellidae (von oben nach unten) ist durch Grauschattierung hervorgehoben. Referenzen zu den einzelnen Transformationsexperimenten finden sich in Handler (2002), Atkinson & James (2002) und Horn et al. (2002).
6.2.2.2 Übertragbarkeit des Tet-Systems
Die Funktionalität des Tet-Systems konnte in einem breiten Organismenspektrum demonstriert werden, das Hefen (Saccharomyces cerevisiae; Candida spp.), eine kollektive Amoebe (Dictyostelium discoideum), Taufliegen (Drosophila melanogaster), Mäuse, Ratten sowie Pflanzen (Arabidopsis thaliana) umfaßt (Übersichtsartikel: Baron & Bujard, 2000; Gossen & Bujard, 2002). Da das Tet-System in verschiedenen Phyla des Tierreichs funktioniert, sollte es grundsätzlich von Drosophila auf eine Schadinsektenspezies übertragbar sein (unter der Voraussetzung, daß die Spezies keine obligaten bakteriellen Endosymbionten trägt, siehe Kap. 6.3.3).
Neben dem klassischen tTA sind Derivate des Transaktivators entwickelt worden (Knott et al., 2002), von denen tTA2 eine minimalisierte VP16-Transaktivierungsdomäne besitzt (Baron et al., 1997). tTA2 wird in Säugerzellkultur in höheren intrazellulären Konzentrationen als tTA toleriert (Baron et al., 1997). Somit könnte tTA2 zum Einsatz kommen, falls die Insektenspezies sensitiv auf eine transiente frühembryonale tTA-Expression reagiert.
6.2.2.3 Übertragbarkeit von HID als letalitätsvermittelndem Effektor
Das HID-Protein übt proapoptotische Funktion in Zellinien aus, die von Drosophila (SL2), von der Lepidopteren Spodoptera frugiperda (SF9; SF21) oder vom Menschen (HeLa; T-Zellinen) abgeleitet sind (Bergmann et al., 1998; Vucic et al., 1998; Haining et al., 1999; Varghese et al., 2002).
Zumindest auf Ebene der Zellkultur kann konstatiert werden, daß HID über den Arthropodenstamm hinausreichend funktionell ist. Dies läßt vermuten, daß hid- oder hidAla5-basierte Transgene in weiteren Insektenspezies Zelltod auslösen können und somit als letalitätsverursachende Effektorgene einsetzbar sind.
6.2.2.4 Übertragbarkeit von regulatorischen Sequenzen der Zellularisierungsgene
Als zentrale Komponente zur Erzeugung des frühembryonalen Transkriptionspulses fungieren in dem vorgestellten System 5’ genregulatorische Sequenzen der Zellularisierungsgene sry α und nullo (siehe Kap. 5.2.1). In Drosophila wurden bislang vier Gene genauer charakterisiert, deren Produkte am Zellularisierungsprozeß beteiligt sind und die zygotisch exprimiert werden: Neben den bereits erwähnten Genen sry α (Schweisguth et al., 1989) und nullo (Simpson & Wieschaus, 1990) sind dies bottleneck (bnk; Schejter & Wieschaus, 1993) und slow-as-molasses (slam; Lecuit et al., 2002).
Diesen vier Genen ist ein blastodermspezifisches Transkriptprofil gemeinsam (Vincent et al., 1986;
Rose & Wieschaus, 1992; Schejter & Wieschaus, 1993; Lecuit et al., 2002; Stein et al., 2002). Zudem wurden Sequenzähnlichkeiten innerhalb der sry a- und nullo- 5’ genregulatorischen Regionen festgestellt (siehe Abb. 5.5; Ibnsouda et al., 1993). Diese Daten weisen auf eine gemeinsame transkriptionelle Regulation hin.
Die Spezies D. melanogaster und D. virilis sind phylogenetisch mindestens 60 Millionen Jahre voneinander getrennt (Beverley & Wilson, 1984). In D. virilis werden sowohl das sry α- als auch das nullo-Genhomologe blastodermspezifisch exprimiert (Ibnsouda et al., 1995; Hunter et al., 2002). Cis-regulatorische Motive, die in D. melanogaster als notwendig für die Blastodermspezifität der Expression identifiziert wurden, sind in D. virilis konserviert (Ibnsouda et al., 1995). Darüber hinaus komplementiert ein genomisches D. virilis nullo-Konstrukt, wenn in D. melanogaster Embryonen exprimiert, den Phänotyp einer nullo Mutante (Hunter et al., 2002). Die Interspezieskomplementation ist konsistent mit der Vorstellung, daß sowohl die Funktion cis-regulatorischer Kontrollelemente als auch die Proteinfunktion dieses Zellularisierungsgens innerhalb der Familie Drosophilidae konserviert sind.
82 Diskussion
Ob cis-regulatorische Sequenzen der Zellularisierungsgene aus D. melanogaster außerhalb der Drosophilidae blastodermspezifische Expression vermitteln können, ist bislang nicht untersucht.
Bedeutsame Dipterenschädlinge der Familie Tephritidae (siehe Tab. 6.1) sind phylogenetisch von Drosophila melanogaster etwa doppelt so weit entfernt wie Drosophila virilis (z.B. sind Mittelmeerfruchtfliege und Taufliege ungefähr 120 Millionen Jahre voneinander getrennt (Beverley &
Wilson, 1984)). Aufschluß über die phylogenetische Konservierung der sry α- und nullo-Trans-aktivatorkonstrukte könnte über ein Keimbahntransformationsexperiment und nachfolgend über die in situ Analyse des embryonalen Expressionsmusters in transgenen Linien erhalten werden.
Eine Alternativstrategie zur direkten Übertragung der Transaktivatorkonstrukte besteht in der Klonierung der Gene aus dem Schadinsekt, die zu sry α, nullo, bnk oder slam ortholog sind. Bei den meisten Insektenspezies wird zu Beginn der Embryogenese superfizielle Furchung durchlaufen (Anderson, 1972; Mazumdar & Mazumdar, 2002), so daß Zellularisierungsgene mit zu sry α, nullo, bnk oder slam homologen Funktionen vermutet werden können. Zur Klonierung der sry α und nullo-Orthologen könnten bereits vorhandene Sequenzinformationen aus Drosophila-Spezies Hilfestellung geben: SRY α aus D. melanogaster zeigt zu seinem Homologen aus D. virilis 42% Identität der Aminosäuresequenz (Ibnsouda et al., 1998). Nullo aus D. melanogaster zeigt zu seinem Homologen aus D. virilis 47% Identität der Aminosäuresequenz, wobei die C-terminale Hälfte hochkonservierte Blöcke aufweist (Hunter et al., 2002). Mittels geeigneter Sonden läßt sich möglicherweise die Sequenz des zu sry α, nullo, bnk oder slam orthologen Gens aus der Schadspezies identifizieren. Nachfolgend müßte die regulatorische Region des Gens isoliert und daraufhin analysiert werden, ob sie blastodermspezifische Expression vermitteln kann.
Datenbankanalysen des sequenzierten Genoms des Malariamoskitos Anopheles gambiae (Holt et al., 2002) ergaben jedoch, daß von den vier genannten Zellularisierungsgenen lediglich sry α aus D. melanogaster ein Orthologes in A. gambiae zu haben scheint (E. Wimmer, pers. Mitteilung). Es ist daher fraglich, ob die Klonierung von Zellularisierungsgenen aus phylogenetisch von Drosophila weiter entfernten Schadspezies mittels einer Strategie möglich ist, die Sequenzähnlichkeiten voraussetzt. Geeignete cis-regulatorische Sequenzen könnten in einer Schadspezies auch unabhängig von Sequenzähnlichkeiten der Gene bzw. Proteine identifiziert werden: Ein zu diesem Zweck konstruiertes Enhancernachweissystem wurde in der vorliegenden Arbeit beschrieben (siehe Kap. 5.3) und wird in Kap. 6.6 diskutiert.