Angaben zu Fluoreszenzproteinen und zur Epifluoreszenzstereomikroskopie

Zur Entwicklung separierbarer Transformationsmarker wurden Gene für fluoreszierende Proteine mit verschiedenen biophysikalischen Eigenschaften (Tab. 4.2 und Abb. 4.2; Patterson et al., 2001) unter die Kontrolle des 3xP3-Promotors gestellt. In der Spektralvariante ECFP (Cubitt et al., 1999) sind sechs Aminosäuren gegenüber wildtypischem GFP (Prasher et al., 1992) substituiert (F64L, S65T, T66W, N146I, M153T, V163A). Das Emissionsmaximum wurde damit blauverschoben, die Leuchtstärke allerdings abgeschwächt. Bei der rotverschobenen Variante EGFP (Cormack et al., 1996; Yang et al., 1996) konnte die Leuchtstärke durch zwei Aminosäurenaustausche (F64L; S65T) gegenüber GFP gesteigert werden. Zudem sind sowohl Löslichkeit als auch thermische Stabilität erhöht. Die Spektralvariante EYFP (Cubitt et al., 1999) besitzt gegenüber GFP vier Aminosäurenaustausche (S65G, V68L, S72A, T203Y) und ein Fluoreszenzmaximum, das noch weiter in den gelbgrünen Spektralbereich rotverschoben ist. Die Leuchtstärke konnte in dieser Variante relativ zu EGFP erneut gesteigert werden. Schließlich vervollständigt das rot fluoreszierende Protein DsRed (Matz et al., 1999) die Abdeckung des sichtbaren Spektralbereichs. Im Gegensatz zu GFP, welches in vivo als Dimer vorliegt, bildet DsRed1, die in der vorliegenden Arbeit verwendete Variante, eine tetramere Quartärstruktur und neigt zudem zur Aggregation (Baird et al., 2000).

DsRed1 weist eine langsame Faltungskinetik und somit eine Reifungszeit von Tagen auf. Im vollständig aktiven Zustand besitzt DsRed1 jedoch einen hohen Extinktionskoeffizienten und eine effiziente Quantenausbeute (Tab. 4.2). Da zudem die Autofluoreszenz biologischer Gewebe (vorwiegend im gelben Spektralbereich) nur wenig mit der DsRed1-Fluoreszenz überlagert, kommt DsRed1 unter den hier zusammengestellten Varianten das günstigste Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu.

Fluoreszenz-protein Absorptions-maximum (nm)

Extinktionskoeffizient (ε(λ_max); M^-1 cm^-1)

Emissions-maximum (nm) Quantenausbeute relative Leuchtstärke ^a

ECFP 434 26000 477 0,40 0,47

EGFP 489 55000 508 0,60 1,49

EYFP 514 84000 527 0,61 2,32

DsRed1 558 72500 ^b 583 0,68 ^b 2,23

Tab. 4.2: Biophysikalische Eigenschaften der Fluoreszenzproteine ECFP, EGFP, EYFP und DsRed.

a Leuchtstärke ist definiert als Produkt aus maximalem Extinktionskoeffizienten und Quantenausbeute. Die Referenz ist wildtypisches GFP aus Aequorea victoria (Leuchtstärke = 1,0).

b Werte beziehen sich auf vollständig aktives DsRed1-Protein (Baird et al., 2000).

(nach Patterson et al., 2001)

34 Materialien und Methoden

Aus den Normalspektren der Fluoreszenzproteine (Abb. 4.2) kann abgeleitet werden, daß die Emissionsspektren von EGFP und DsRed nur minimal überlappen, so daß die physikalische Voraussetzung zur unabhängigen Nachweisbarkeit als gegeben erscheint. Dies trifft auch für die Emissionsspektren von EYFP und DsRed zu. Zudem überlagern sich die Absorptionsspektren von ECFP und EYFP nur geringfügig. Diese spektralen Eigenschaften sind die Grundlage des differentiellen Nachweises der drei Fluoreszenzproteine ECFP, EYFP und DsRed.

Abb. 4.2: Spektrale Eigenschaften der Fluoreszenzproteine ECFP, EGFP, EYFP und DsRed1.

Absorptionsspektren sind mit unterbrochenen, Fluoreszenzspektren mit durchgezogenen Linien dargestellt.

Modifiziert nach Living Colors^TM User Manuals (Protokolle PT2040-1 [PR8Z149] und PT3404-1 [PR9X217], Clontech, Palo Alto, USA).

4.3.2 Epifluoreszenzstereomikroskopie

4.3.2.1 Angaben zum Fluoreszenz-Stereomikroskop und zu verwendeten Filtersystemen

Fluoreszenzbeobachtungen wurden am Leica MZ FLIII Fluoreszenz-Stereomikroskop durchgeführt. Dieses Stereomikroskop besitzt drei Strahlengänge: Zwei separate von den beiden Okularen über das Hauptobjektiv zum Objekt und zusätzlich einen dritten Strahlengang für den Fluoreszenzilluminator. Als Anregungslicht für Fluoreszenzbeobachtungen dient das Emissions-spektrum einer Quecksilberdampflampe. Dieses passiert einen Anregungsfilter und trifft auf das Objekt. Von Fluorophoren des Objektes emittiertes Licht wird nach Durchgang durch einen Sperrfilter beobachtet, der entweder als Langpassfilter Licht oberhalb einer bestimmten Minimalwellenlänge oder als Bandpassfilter ein eingegrenztes spektrales Fenster passieren läßt (Abb. 4.3).

Abb. 4.3: Spektralbereich der verschiedenen Filtersysteme zur Anregung und Objektbeobachtung.

Gezeigt ist die Transmission von Licht im sichtbaren Spektralbereich bei den Langpassfiltersystemen V und GFP2 bzw. den Bandpassfiltersystemen CyanGFP, YellowGFP und Cy3.5/DsRed. Gezeichnet nach Herstellerangaben zu den spektralen Eigenschaften.

Anregungs- und Sperrfilter bilden ein Filtersystem, das spektral den Erfordernissen eines Fluorophors angepaßt ist. Die spektralen Eigenschaften der Langpassfiltersysteme (V, GFP2) und der Bandpassfiltersysteme (CyanGFP, YellowGFP, Cy3.5/DsRed), welche zur in vivo Fluoreszenz-beobachtung bzgl. 3xP3-EGFP, 3xP3-EYFP, 3xP3-ECFP bzw. 3xP3-DsRed transgener Taufliegen eingesetzt wurden, sind in Tab. 4.3 zusammengestellt.

Filtersystem Anregungsfilter

(λmax/spektrale Breite)

Sperrfilter

(λmin oder λmax/spektrale Breite) Hersteller und Produktbezeichnung

V 425 nm/40 nm 510 nm Leica, Bensheim

GFP2

(GFP Plus) 480 nm/40 nm 475 nm Leica, Bensheim

CyanGFP 436 nm/20 nm 480 nm/40 nm Chroma #31044v2; AHF Analysentechnik AG, Tübingen

YellowGFP 500 nm/20 nm 535 nm/30 nm Chroma #41028; AHF Analysentechnik AG, Tübingen

Cy3.5/DsRed 565 nm/30 nm 620 nm/60 nm Chroma #41021; AHF Analysentechnik AG, Tübingen (#F41-035)

Tab. 4.3: Spektrale Eigenschaften verschiedener Filtersysteme zur Fluoreszenzbeobachtung in vivo.

36 Materialien und Methoden

4.3.2.2 Fluoreszenzbeobachtung und -dokumentation in Drosophila melanogaster

Die Langpassfiltersysteme V und GFP2 bieten gegenüber den Bandpassfiltersystemen CyanGFP und YellowGFP den Vorteil höherer Luminosität und ermöglichen den sensitiven Nachweis von Fluoreszenzproteinen im Komplexauge von D. melanogaster. Das Bandpassfiltersystem Cy3.5/DsRed gewährleistet eine hohe Lichtstärke zum Nachweis von DsRed-Augenfluoreszenz.

Für Durchmusterungsanalysen (Identifizierung transgener Individuen nach Keimbahntransformationsexperimenten oder von Neuinsertionsereignissen im Rahmen der Pilot-Mutagenese) wurde generell ein Langpass- oder das Cy3.5/DsRed-Filtersystem verwendet. Der Nachweis adulter und larvaler Enhanceraktivität erfolgte unter Verwendung des GFP2-Filtersystems.

Zur individuellen Identifizierung einer einzelnen Transgenkomponente in Stämmen mit mehreren, unabhängig fluoreszenzmarkierten Transgenen wurden generell Bandpassfiltersysteme eingesetzt, die eine eindeutige Differenzierung von 3xP3-ECFP-, 3xP3-EYFP- oder 3xP3-DsRed-Augenfluoreszenz erlauben.

Adulte Fliegen wurden unter Verwendung des planachromatischen 0,5x Objektivs beobachtet.

Fliegenköpfe (Abb. 5.1; 5.2; 5.16; 5.18B,D; 5.19) sind mit diesem Objektiv und 5x finaler Vergrößerung dokumentiert. Larven, die den {GAL4∆+UAS}-Mutator tragen (Abb. 5.21), wurden zunächst in 20%iger (w/v) Glucoselösung von Futterbestandteilen getrennt, dann mit einer Pasteurpipette in ein Rundsieb mit feinmaschigem Gazeboden überführt, mit NaCl-Tx (0,7% (w/v) NaCl, 0,07% (w/v) Triton X) und anschließend mit Wasser gespült und in 96% Glycerin eingebettet.

Nach 5 min Inkubation des Präparats bei 65°C waren Larven immobilisiert. Die EYFP-Fluoreszenz wurde mit dem planapochromatischen 1,6x Objektiv beobachtet. Zur Dokumentation wurden eine aufsetzbare digitale Kamera (Axiocam HR, Zeiss, Jena) und das Computerprogramm Zeiss AxioVision 2.05 verwendet.