Potentielle technische Probleme des transgenbasierten Sterilisierungssystems

Der Begriff der Kompetitivität eines Insektenorganismus’ umfaßt alle Parameter, die die Fitness beeinflussen. Dazu zählen die Fertilität, die Fekundität, der Paarungserfolg, die durchschnittliche Lebensspanne sowie die Fähigkeit zur Verbreitung im Ökosystem. Als mögliche

Ursachen für einen Verlust an Kompetitivität in transgenvermittelt sterilisierten Insekten kommen grundsätzlich in Betracht: die spezifische Transgeninsertion, durchlässige Expression des Transaktivator- bzw. Effektortransgens, die Produktion des Fluoreszenzmarkerproteins sowie der Gründereffekt, der eine genetische Flaschenhalssituation bezeichnet, die bei der Etablierung transgener Stämme, von einem einzigen transgenen Individuum ausgehend, durchlaufen wird.

Daß Transgene, die nur ein Transformationsmarkergen exprimieren, bereits einen massiven negativen Einfluß auf die Fitness haben können, wurde kürzlich an Malariamoskitos (Anopheles stephensi) demonstriert (Catteruccia et al., 2003). In Käfigexperimenten mit sowohl wildtypischen als auch bzgl. einer Transgeninsertion homozygoten Moskitos wurde die Frequenz des transgenen Allels im Verlauf der Generationen verfolgt. Bei vier unabhängigen transgenen Linien wurde ein starker Selektionsdruck gegen das transgene Allel festgestellt, so daß transgene Individuen aus der Population binnen 4 bis 16 Generationen verschwanden.

In dieser Arbeit generierte EL#42-Männchen wurden hinsichtlich ihres Paarungserfolges charakterisiert. Dabei wurde ein wesentlicher Einfluß der Augenpigmentierung nachgewiesen (Faktor 5; siehe Abb. 5.14). Das Ergebnis ist konsistent mit früheren Studien an D. melanogaster, die bereits auf einen erniedrigten Paarungserfolg in Augenpigmentierungsmutanten hinwiesen (Geer &

Green, 1962; Petit, 1958). Der Einfluß der Augenpigmentierung wurde experimentell eliminiert, indem EL#42- gegen white-Männchen, beide ohne Augenpigmentierung, um wildtypische Frauen konkurrierten. In dieser Situation besaßen EL#42-Männchen 56% Paarungserfolg. Eine Reduktion des Paarungserfolges von rund 50% wurde in Mittelmeerfruchtfliegen gefunden, die zum Einsatz in einem SIT-Programm bestrahlt worden waren (Calcagno et al., 2002; Lux et al., 2002). Dieser Verlust wird in SIT-Programmen zur Bekämpfung der Mittelmeerfruchtfliege toleriert. Allerdings können beide Werte nicht miteinander verglichen werden, denn die Experimente dieser Arbeit beziehen sich auf eine artifizielle Laborsituation, während der Paarungserfolg bestrahlter Mittelmeerfruchtfliegen gegenüber wildtypischen Artgenossen in Feldkäfigexperimenten gemessen wurde. Ob das Ausmaß des transgenbedingten Fitnessverlustes für eine SIT-Anwendung toleriert werden kann, wird erst die Analyse der Fitness transformierter Schadinsekten zeigen.

Bei der Konkurrenz zu wildtypischen Männchen wurde eine dichteabhängige Zunahme des Paarungserfolges steriler EL#42-Männchen festgestellt (siehe Tab. 5.5). Mehrere Ursachen für diese Dichteabhängigkeit sind vorstellbar: Erstens könnte die Polyandrie der Drosophila-Weibchen eine Rolle spielen: Drosophila-Weibchen verpaaren sich mehrere Male vor Beginn der Oviposition. Je mehr sterile EL#42-Männchen in der Population vorhanden sind, desto unwahrscheinlicher ist es, daß sich unter den Paarungspartnern eines Weibchens ein fertiles Männchen befindet und dieses Weibchen Eier legt, aus denen Larven schlüpfen. Dies würde bedeuten, daß transgene Spermien weniger erfolgreich sind als wildtypische Spermien. Zweitens könnte die Ursache darin liegen, daß bei Drosophila das Weibchen den Paarungspartner auswählt und dabei aktiv wildtypische, augenpigmen-tierte Männchen bevorzugt. Mit zunehmendem Überschuß steriler EL#42-Männchen sind wildtypische

84 Diskussion

Männchen jedoch unterrepräsentiert und die Wahrscheinlichkeit nimmt zu, daß ein Weibchen mit einem sterilen Männchen den Paarungsvorgang einleitet, bevor es einem bevorzugten wildtypischen Männchen begegnet.

Eine detailliertere Analyse der Kompetitivität ist in der Schadspezies sinnvoll, nachdem das System übertragen worden ist: In Feldkäfigexperimenten könnten die Ursachen für den Verlust an Kompetitivität aufgeschlüsselt werden. Um den in dieser Arbeit festgestellten negativen Einfluß der Augenpigmentierung a priori zu eliminieren, sollte ein wildtypischer Stamm der Schadspezies mit den Transgenen transformiert werden. Anschließend könnten die Kompetitivitätsfaktoren (Fertilität, Fekundität, Paarungserfolg, durchschnittliche Lebensspanne) in Referenz zu konventionell bestrahlten Schadinsekten und kontrolliert zu mehreren nicht transgenen wildtypischen Stämmen analysiert werden.

6.3.2 Stabilität der Transgene im industriellen Produktionsmaßstab

Eine SIT-Anwendung bedingt die Züchtung zur Sterilisierung bestimmter Insekten im Maßstab von Millionen Insekten pro Woche (siehe Tab. 6.1). In diesem Maßstab werden auch äußerst unwahrscheinliche Ereignisse eintreten. Sofern die Transgene zum Kompetitivitätsverlust beitragen, bedeutet die Entfernung der Transgene einen Selektionsvorteil für das Individuum. Ein solches Individuum würde sich im Stamm rasant durchsetzen und diesen zusammenbrechen lassen. Deswegen kann ein Selektionsdruck gegen die Transgenpräsenz angenommen werden.

In dieser Arbeit konstruierte Transgeninsertionen tragen flankierende Transposonsequenzen.

Die Transgene können somit prinzipiell zu neuen genomischen Loci mobilisiert und schließlich über chromosomale Segregation aus dem Genom entfernt werden. Diese Mobilisierungsreaktion erfordert jedoch die Aktivität einer zu den Zielstellen korrespondierenden Transposase. In dieser Arbeit verwendete piggyBac-Transformationsvektoren sind nicht autonom, denn das offene Leseraster des piggyBac-Gens ist deletiert (siehe Kap. 5.1.2). Transposaseaktivität kann daher nicht von den Transposonbereichen der Transgenkonstrukte stammen. Eine mögliche Transposasequelle könnte jedoch der Organismus selbst sein: piggyBac-Elemente konnten im Genom von drei Insektenspezies (von 50 über Southern-Hybridisierung untersuchten) nachgewiesen werden (Handler & McCombs, 2000; Handler, 2002). Während der Nachtschmetterling Trichoplusia ni ein intaktes piggyBac-Transposon enthält, wurden im Eulerfalter Spodoptera frugiperda und in der Orientalischen Fruchtfliege Bactrocera dorsalis nichtfunktionale Elemente gefunden. Ob piggyBac-Transposaseaktivität im Organismus genomisch kodiert ist, kann durch die Methode des Exzisionsassays (Coates et al., 1997) untersucht werden. Im Exzisionsassay wird gemessen, ob endogene Transposaseaktivität die plasmidale Exzision eines Transgenkonstruktes im Insektenembryo induzieren kann.

Selbst bei Abwesenheit des Transposontyps im Genom des Schadinsekts könnten Kreuzreaktionen mit verwandten, möglicherweise bislang nicht identifizierten Transposasen zur

Mobilisierung der Transgenkonstrukte führen. Zum Beispiel wurden Kreuzmobilisierungen von Hermes durch hobo, das ebenso wie Hermes zur hAT-Transposonfamilie zählt, nachgewiesen (Sundararajan et al., 1999). Diese Kreuzmobilisierungsereignisse können eine Destabilisierung von Hermes-Transgeninsertionen in hobo-haltigen Drosophila-Stämmen zur Folge haben (D. O’Brochta, pers. Mitteilung). Familien transposabler Elemente, insbesondere die Tc1/mariner-Superfamilie, zählen viele Mitglieder (Übersichtsartikel: O’Brochta & Atkinson, 1996; Atkinson et al., 2001;

Atkinson & James, 2002), deren Kreuzmobilisierungspotential weitgehend unbekannt ist.

Zur Erhöhung der Transgenstabilität könnten Transformationsvektoren konstruiert werden, die eine Entfernung mindestens eines der Transposonenden ermöglichen, nachdem das Transgen im Genom integriert ist. Die Abwesenheit von Zielstellen sollte transposasevermittelte (Kreuz-)Mobilisierungsereignisse unterbinden.

6.3.3 Mit dem Tet-System verbundene mögliche Anwendungshindernisse

Die Verwendung eines Antibiotikums zur Aufrechterhaltung permissiver Zuchtbedingungen setzt voraus, daß das Schadinsekt keine essentiellen bakteriellen Symbionten besitzt. Der Anteil an Insektenspezies, der neben transienten und parasitischen auch symbiontische Bakterien enthält, wird auf mehr als 10% geschätzt (Hurst, 1997). Auf diese Spezies könnte das Sterilisierungssystem in der beschriebenen Ausführung wahrscheinlich nicht übertragen werden.

Selbst wenn die Insektenspezies die Tetracyclingabe toleriert, stellt sich bei der großtechnischen Anwendung die Entsorgungsfrage Tc-haltigen Futters. Da Tc (und Dox) in der Humanmedizin gängige Breitband-Antibiotika sind, ist ihr Einsatz zum Zwecke der industriellen Insektenzucht (auch im Konzentrationsbereich von 10-100 mg/l Futter) als problematisch zu betrachten. Als Lösungsansatz dieser Problematik bieten sich Tc-Derivate an, die nur geringe oder keine antibiotische Aktivität besitzen (Schnappinger & Hillen, 1996). Diese müßten hinsichtlich ihrer Effizienz der tTA-Inaktivierung im Schadinsekt charakterisiert werden.