Simulation einer SIT-Situation und Analyse des Paarungserfolges steriler

kleinen Labormaßstab simuliert. Dabei wurde analysiert, ob EL#42-Männchen mit nicht transgenen, wildtypischen Männchen um den Paarungspartner konkurrieren können und mit welcher Effizienz sie die Nachkommenzahl erniedrigen.

Zunächst wurde eine Konkurrenzsituation zwischen fertilen und sterilen Männchen um jungfräuliche wildtypische Weibchen simuliert: In mehreren statistisch unabhängigen Ansätzen konkurrierte ein bestimmtes Verhältnis fertiler zu steriler Männchen um eine bestimmte Menge an

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wildtypischen Weibchen (Abb. 5.13; siehe auch Kap. 4.2.1.4). Die Negativkontrolle (ausschließlich sterile Männchen im Ansatz) brachte 0,07% der Nachkommenzahl der Positivkontrolle (ausschließlich fertile Männchen im Ansatz) hervor. Dies demonstriert erneut die Effizienz der transgenvermittelten Sterilisierung. Relativ zur Positivkontrolle konnte mit ansteigendem Überschuß an sterilen Männchen eine zunehmende Reduktion der Nachkommenzahl festgestellt werden. Bei 9fachem Überschuß an sterilen Männchen sank die Nachkommenschaft auf durchschnittlich 17% des Kontrollwertes. Dies indiziert, daß EL#42-Männchen in Konkurrenz zu wildtypischen Männchen die Nachkommenzahl effizient reduzieren können.

Abb. 5.13: Kompetition wildtypischer Männchen und steriler EL#42-Männchen um jungfräuliche wildtypische Weibchen.

Gezeigt ist die Abhängigkeit der Nachkommenzahl wildtypischer Weibchen von verschiedenen Verhältnissen (1:1 bis 1:9) fertiler wildtypischer zu steriler EL#42-Männchen. Kontrollansätze mit der gleichen Anzahl an fertilen Weibchen enthalten entweder nur sterile Männchen (-), nur fertile Männchen (+) oder die 10fache Menge an fertilen Männchen (++). Die Anzahl an Nachkommen aus einer Zweitagesablage auf Tc-freiem Futter wurde prozentual auf den Wert der Positivkontrolle normiert. Pro Verhältnis wurden 14 unabhängige Ansätze ausgewertet, Mittelwert und Standardfehler des Mittelwertes sind angegeben.

Ein Vergleich der experimentellen Werte zur theoretisch maximal möglichen Reduktion der Nachkommenzahl zeigt jedoch auch, daß wildtypische Männchen hinsichtlich des Paarungserfolges sterilen EL#42-Männchen überlegen sind: Ein 5facher Überschuß an sterilen Männchen ist erforderlich, um die Nachkommenzahl auf einen halbmaximalen Wert zu erniedrigen (Abb. 5.13). Als Parameter für den Paarungserfolg gibt der „Index des Paarungserfolges“ das Verhältnis der gemessenen zur erwarteten Reduktion der Nachkommenzahl an (Conforti et al., 1999). Wie in Tab. 5.5 gezeigt, hängt der Paarungserfolg steriler EL#42-Männchen von der Populationsdichte ab:

Mit zunehmendem Überschuß steriler Männchen nimmt der Index zu und erreicht bei 9fachem Überschuß mit 0,92 nahezu den Wert zu wildtypischen Männchen äquivalenten Paarungserfolges (1,0). Als mögliche Ursache für dieses Phänomen wurde der Einfluß streßbedingter Faktoren bei hoher Populationsdichte auf die Anzahl produzierter Nachkommen untersucht. Eine zusätzliche Positivkontrolle (++ in Abb. 5.13), welche einen gegenüber wildtypischen Weibchen 10fachen

Überschuß wildtypischer Männchen enthielt, zeigte jedoch nur eine geringfügige Reduktion der Nachkommenzahl, die statistisch nicht signifikant ist (P = 0,11 im t-test).

Verhältnis

wt ♂:EL#42 ♂ Reduktion,

gemessen (%) Reduktion,

erwartet (%) Index des Paarungserfolges

1:1 12 50 0,24 1:3 31 75 0,41 1:5 50 83 0,60 1:7 67 88 0,77 1:9 83 90 0,92

Tab. 5.5: Paarungserfolg von EL#42-Männchen in Konkurrenz zu wild-typischen (wt) Männchen.

Der Index des Paarungserfolges bezeichnet das Verhältnis gemessener zu erwarteter Reduktion der Nach-kommenzahl.

Die Ursache des geringeren Paarungserfolges könnte darin liegen, daß der EL#42-Stamm in einem nicht augenpigmentierten genetischen Hintergrund (Drosophila-Stamm white) konstruiert wurde. Die Augen wildtypischer Taufliegen (Drosophila-Stamm OreR) hingegen sind intensiv pigmentiert. Möglicherweise wirken sich visuelle Einflüsse auf den Paarungserfolg aus. Um dies zu untersuchen, wurde der Genotyp von Embryonen bestimmt, welche aus Kreuzungsansätzen mit wildtypischen Jungfrauen und einer gleichen Anzahl an (i) wildtypischen und EL#42-Männchen oder (ii) white und EL#42-Männchen entstanden (Abb. 5.14). Die Präsenz der hid^Ala5- und tTA-Transgene wurde dabei in Einzelembryonen-Mulitplex-PCR-Experimenten nachgewiesen, positiv kontrolliert durch die Präsenz eines genomischen Amplifikats (siehe Kap. 4.1.4.1).

Abb. 5.14: Einzelembryonen-Multiplex-PCR zur Bestimmung des Genotyps.

Linke Spur: 100 bp DNA-Längenmarker (New England Biolabs). Mittlere Spur: Für tTA (191 bp) und hid^Ala5 cDNA (253 bp) spezifische Amplifikate indizieren Fertilisation des Embryos durch ein EL#42-Spermium.

Rechte Spur: Das Fehlen der Amplifikate indiziert wildtypische Vaterschaft. Ein 0,7 kb genomisches cdc2c-Amplifikat kontrolliert den Erfolg der DNA-Präparation und der PCR.

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Standen wildtypische und EL#42-Männchen im 1:1 Verhältnis in Konkurrenz, dann konnte für 5,6% der Embryonen (n=144) die EL#42-Vaterschaft ermittelt werden. Dies entspricht einem Index des Paarungserfolges von 0,11. Eine Untersuchung des Paarungserfolges in der Mittelmeerfruchtfliege zeigte, daß white-Männchen, welche im 1:1-Verhältnis mit wildtypischen Männchen um wildtypische Weibchen konkurrierten, einen vergleichbaren Index des Paarungserfolges von 0,125 aufweisen (Conforti et al., 1999). Standen hingegen nicht pigmentierte white und EL#42-Männchen in Konkurrenz, besaßen EL#42-Männchen in 28,2% (n=124) die Vaterschaft. Dies entspricht einem Index des Paarungserfolges von 0,56. Das Fehlen der Augenpigmentierung erniedrigte demnach den Paarungserfolg der EL#42-Männchen um einen Faktor 5.

Abb. 5.15: Zeitverlauf der Kompetition von EL#42-Männchen um bereits befruchtete Weibchen.

Zu Beginn der Zeitserie (Tag 0) wurde zu white-Frauen und white-Männchen, die bereits für vier Tage die Gelegenheit zur Befruchtung hatten, ein 9facher Überschuß an sterilen EL#42-Männchen hinzugefügt. Die Anzahl an adulten Nachkommen wurde ermittelt, die aus sechs aufeinanderfolgenden Zweitagesablagen dieses Ansatzes entstanden. Prozentuale Werte sind normalisiert auf den Wert der Positivkontrolle (Ansatz ohne EL#42-Männchen) und stellen den Mittelwert (Standardfehlerbalken sind angegeben) dreier unabhängiger Zeitserien dar (siehe Kap. 4.2.1.4).

In einer zweiten Serie an Kompetitionsexperimenten wurden bereits befruchtete white-Frauen verwendet. Hierbei wurde untersucht, ob und in welchem Zeitraum EL#42-Männchen die Nachkommenzahl polyandrischer Taufliegen-Weibchen erniedrigen können (Abb. 5.15). Ein 9facher Überschuß an sterilen EL#42-Männchen stand dabei in Konkurrenz zu einer einfachen Menge an white-Männchen um eine einfache Menge an white-Frauen (siehe Kap. 4.2.1.4). Die Nachkommen-zahl, welche für sukzessive Zweitagesablagen aufgezeichnet wurde, sank bereits in den ersten drei Ablagen signifikant auf ein Plateau von 60-70% ab. In den beiden Zweitagesintervallen 8-10 und 10-12 Tage nach Hinzufügen steriler EL#42-Männchen erniedrigte sich die Nachkommenzahl auf nur 12-14% des Wertes der Positivkontrolle. Dies indiziert den Paarungserfolg steriler EL#42-Männchen

in einer Konkurrenzsituation mit fertilen Männchen um bereits fertilisierte Weibchen des gleichen genetischen Hintergrunds (white).

Die Kompetitionsexperimente wurden mit einer Drosophila-Laborkultur und, damit verbunden, unter artifiziellen Bedingungen durchgeführt. Dennoch demonstrieren sie die Praktikabilität der Grundidee, mittels transgenvermittelt sterilisierter SIT-Männchen die Nachkommenzahl sogar bereits befruchteter polyandrischer Weibchen zu reduzieren.

5.2.7 Kompatibilität des Systems embryonaler Letalität mit einem transgenbasierten