während der Monopoese an der C/EBPβ-Proteinexpression beteiligt sind. Die generelle Regulation der C/EBPβ-Expression war bereits oft Gegenstand der Forschung. Je nach untersuchtem Zelltyp wurden verschiedene Signalwege identifiziert, die C/EBPβ beeinflussen. Zwei bedeutende Ergebnisse waren, dass die alternative Translation der drei C/EBPβ-Proteinisoformen durch PKR und eIF2α reguliert wird, wie es in Adipozyten gezeigt werden konnte (Calkhoven et al. 2000) und dass der MEK-ERK-RSK- (MAPK1/2-) Signalweg die C/EBPβ-Proteinsynthese in THP-1-Zellen beeinflusst (Huber et al. 2015). Ergebnisse der Arbeitsgruppe haben weiterhin gezeigt, dass eIF4B in PMA-stimulierten THP-1-Zellen MAPK1/2-Signalweg abhängig aktiviert und für die C/EBPβ-Synthese benötigt wird.
Zudem konnte in diesen Zellen eine Beteiligung des mTOR-S6K-Weges ausgeschlossen werden (Panterodt 2015). Die genannten und die in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Ergebnisse (siehe Abschnitt 3.5) deuten darauf hin, dass zwischen der PKR und der MAPK1/2- Signalkaskade ein bisher unbeschriebener funktionaler Zusammenhang besteht. Dies ist insofern von großer Bedeutung, da die MAPK1/2-Kaskade an der (LPS-induzierten) Immunantwort in MΦ und in monozytären Zelllinien (zsgf. in Rao 2001) sowie an der Differenzierung von Monozyten und MΦ beteiligt ist (Hu et al. 2000, Miranda et al. 2002, Panterodt 2015). Die gegenseitige Beeinflussung der PKR und des MAPK1/2-Signalwegs sowie ihre Wirkungen auf die C/EBPβ-Proteinsynthese sind in Abbildung 4.1 schematisch dargestellt.
Diskussion
Seite | 95 die eIF4B-Synthese in verschiedenen Zelltypen fördern kann (Zhang et al. 2005; The CREB target gene database). Allerdings hat diese Studie auch gezeigt, dass der CREB1-Phosphorylierungsstatus allein keinen Rückschluss auf die Zielgenbildung zulässt.
Ob MSK und CREB an der eIF4B-Proteinmengenerhöhung in PMA-stimulierten THP-1-Zellen beteiligt sind, können künftige siRNA- und Inhibitorexperimente zeigen. MSK-Inhibitoren sowie spezifische siRNAs für CREB und MSK sind kommerziell erhältlich.
Die Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass der PKR-Level differenzierender THP-1-Zellen gegenüber naiven Zellen deutlich erhöht ist und dass die Kinase in einem aktivierten Zustand vorliegt (Abb. 3.16). Darüber hinaus war die PKR an der Erhöhung der LAP*/LAP-Mengen beteiligt (Abb. 3.15).
Die PMA-vermittelte Aktivierung von PKR scheint durch PKC realisiert zu werden. Frühere Untersuchungen ließen eine indirekte Beeinflussung vermuten (Mundschau & Fallers 1995). Neuere Veröffentlichungen sprechen hingegen von einer direkten PKR-Aktivierung durch PKC-δ, welche in ATRA- und Arsen(III)-oxidstimulierten AML-Zelllinien nachgewiesen wurde (Ozpolat et al. 2012).
Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sprechen aber dafür, dass die PKR im hier verwendeten Monopoesemodell hauptsächlich RSK-abhängig aktiviert wird. Wurde RSK in differenzierenden Zellen inhibiert, wurde auch keine PKR-Aktivierung in diesen Zellen beobachtet (Abb. 3.21). Eine direkte Stimulation der PKR durch PKC-δ ist daher eher unwahrscheinlich.
eIF4B wird nachweislich für die C/EBPβ-mRNA-Translation benötigt (Panterodt 2015). Zudem konnte in der vorliegenden Arbeit ein positiver funktioneller Zusammenhang zwischen eIF4B und der PKR in differenzierenden Zellen herausgearbeitet werden (Abb. 3.14). Daher ist es wahrscheinlich, dass die beobachtete PKR-abhängige Regulation der C/EBPβ-Proteinsynthese (Abb. 3.15) über die Aktivierung von eIF4B vermittelt wurde. Die direkte Aktivierung von eIF4B durch die PKR wurde jedoch bisher nicht beschrieben (Abb. 4.1, gestrichelter Bogenpfeil), weshalb untersucht wurde, ob die PKR Signalwege beeinflusst, die die Aktivität von eIF4B regulieren.
Wie bereits mehrfach erwähnt, wurde der MAPK1/2-Signalweg als ein wichtiger Regulator von eIF4B während der monozytären Differenzierung beschrieben. Um zu untersuchen, ob die PKR die MAPK1/2-Kaskade beeinflusst, wurden Inhibitorversuche durchgeführt, die diese Vermutung bestätigten (Abb. 3.20). Dabei wurde deutlich, dass die PKR an der Aktivierung von ERK1/2 beteiligt war: Die Inhibierung von PKR führte zu einer verminderten Phosphorylierung an ERK1/2-Thr202/Thr204, was sich negativ auf die Aktivität und die Gesamtproteinmenge von RSK auswirkte.
Aus den Ergebnissen wurde allerdings nicht ersichtlich, ob ERK1/2 direkt durch die PKR beeinflusst wird, oder ob PKR eines der ERK1/2-vorgeschalteten Glieder des MAPK1/2-Signalwegs beeinflusst.
Frühere Untersuchungen an PDGF-behandelten Mausfibroblasten (MEFs) ergaben z. B., dass STAT3 in diesen Zellen PKR-abhängig aktiviert wurde. Diese Regulation war dabei nicht direkt, sondern wurde
Seite | 96 durch ERK1/2 vermittelt (Deb et al. 2001). Außerdem konnten die Autoren zeigen, dass ERK1/2 in PDGF-stimulierten PKRko-MEFs weitaus schwächer aktiviert war, als in gleichbehandelten WT-MEFs.
Es ist also sehr wahrscheinlich, dass ERK1/2 direkt durch die PKR reguliert werden kann.
Eine mögliche direkte Beeinflussung könnte in einem in vitro-Experiment geprüft werden, bei dem ERK1/2 zusammen mit PKR und radioaktivmarkiertem ATP (γ-32P-ATP) inkubiert wird. In einem parallelen Kontrollansatz sollte eine ERK-Mutante eingesetzt werden, deren Kinasedomäne defekt ist. Dadurch könnte eine ERK-ERK-Phosphorylierung ausgeschlossen werden. Die Ansätze werden anschließend mittels Western-Blot-Analyse ausgewertet. Als bildgebende Verfahren kommen die autoradiographische Belichtung von Röntgenfilmen bzw. die Verwendung eines Phosphorimagers in Frage. Letzteres stellt die sensitivere Methode dar.
Die in dieser Arbeit präsentierten Inhibitorversuche sollten in Folgeexperimenten zur Bestätigung der Ergebnisse mittels siRNA-vermitteltem Gen-silencing (-knock down) verifiziert werden. Erste PKR-siRNA-Experimente konnten die PKR-Aktivität jedoch nicht effizient ausschalten (Daten nicht gezeigt).
Eine weitere Möglichkeit in diese Richtung bietet der clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) -CRISPR associated protein 9 (Cas9) -vermittelte Gen-knock out, welcher auf einer Virusabwehrstrategie von Bakterien und Archäen beruht (Doudna & Charpentier 2014, Xiong et al. 2015). Dabei wird die bakterielle DNA-Nuklease Cas9 gezielt mit Hilfe einer guide- bzw.
trans-acting (tracr) -RNA, die aus einem mRNA-Sequenzabschnitt des Zielgens sowie der CRISPR-mRNA besteht, zum Zielgen geleitet, wo das Enzym nahe der Erkennungssequenz die chromosomale DNA schneitet. Das zelleigene DNA-Reparatursystem erzeugt bei dem Versuch, den entstandenen DNA-Doppelstrangbruch zu schließen, eine Mutation, wodurch die Zielgenfunktion (statistisch) massiv gestört wird. Die mutagenisierten Zellen müssten anschließend identifiziert (einzelne Klone mittels PCR testen und sequenzieren) und expandiert werden und stünden nun für experimentelle Ansätze zur Verfügung. Neben der PKR sind auch die putativen RNA-bindenden Proteine (Ergebnisse 3.3.4, bzw. vorheriger Abschnitt), ERK, RSK, die Proteinphosphatase 2A (PP2A; Abschnitt 4.4) und das Glykoprotein p67 (Abschnitt 4.5) als Ziel dieser Methode denkbar, falls der siRNA-vermittelte knock down bei diesen fehlschlüge. Aufgrund möglicher sekundärer Effekte müssten die erhaltenen Ergebnisse mit Vorsicht interpretiert werden (O’Geen et al. 2015).
Der Einfluss von PKR auf die C/EBPβ-Expression lässt sich auch durch Verwendung spezifischer PKR-Stimulanzien überprüfen. Ein (möglicher) Vorteil wäre, dass durch diese Stimuli der MAPK1/2-Signalweg nicht direkt aktiviert werden würde. Als PKR-Aktivatoren kommen folgende Stimuli in Frage: polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)), Heparin, Dextransulfat, Chondroitinsulfat sowie poly-L-Glutamin (zsgf. in Sadler & Williams 2007). Initial müsste überprüft werden, ob die PKR in THP-1-Zellen durch diese Stimuli aktiviert wird und ob sie in den THP-1-Zellen (bspw.) morphologische
Diskussion
Seite | 97 Veränderungen (also eine Differenzierung) auslösen. Anschließend können das klassische PKR-Ziel eIF2α, einzelne Glieder des MAPK1/2-Signalwegs und natürlich C/EBPβ hinsichtlich ihrer Expression und Phosphorylierung/Aktivierung untersucht werden.
Eine weitere Versuchsreihe ergab, dass die Wechselwirkung zwischen der PKR und dem MAPK1/2-Signalweg nicht unidirektional war ‒ als Wirkung der PKR auf die Aktivität von ERK1/2 ‒ sondern dass die PKR ihrerseits durch RSK aktiviert wurde (Abb. 3.21). Bestätigt sich zudem die Vermutung, dass ERK1/2 durch die PKR phosphoryliert wird, würde in den Zellen eine bisher unbeschriebene positive Rückkopplungsschleife zwischen ERK, RSK und PKR etabliert werden können (Abb. 4.1 [3]). Frühere und die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse stützen diese Überlegung, da die Aktivierung und die Induktion von eIF4B sowie die Proteinsynthese von C/EBPβ im gleichen Maße von der RSK- (Panterodt 2015) und der PKR-Aktivität abhängig waren (Abb. 3.14 und 3.15).