Die für die Erstellung dieser Arbeit verwendeten Laborgeräte und Materialien sind in Tabelle 2.1 aufgelistet.
Tabelle 2.1: Übersicht über verwendete Geräte und Materialien.
Bezeichnung Gerätetyp/Verwendung Hersteller
verwendete Geräte
Einmalkanalpipette Research Plus (0,1 bis 1.000 µl)
Kolbenhubpipette Eppendorf AG, Hamburg, D Transferpette®-12 electronic Mehrkanalpipette Brand GmbH & Co. KG,
Wertheim, D
Pipetboy acu 2 Pipettierhilfe Integra Biosciences GmbH,
Fernwald, D
Sprout Minizentrifuge Minizentrifuge Biozym Scientific GmbH,
Hessisch Oldendorf, D
Heraeus Pico 17 Tischzentrifuge Thermo Fisher Scientific Inc.,
Waltham, MA, Vereinigte Staaten von Amerika (USA)
Heraeus Fresco 17 Tischkühlzentrifuge Thermo Scientific
Centrifuge 5430R Tischkühlzentrifuge Eppendorf
Heraeus Multifuge 3SR+ Laborzentrifuge Thermo Scientific
Concentrator Plus Vakuumzentrifuge Eppendorf
M-power AZ 1502 Präzisionswaage Sartorius AG, Göttingen, D
RC 210 S Analysenwaage Sartorius
RH basic 2 IKAMAG Magnetrührer, beheizbar IKA-Werke GmbH & CO. KG, Staufen, D
Taumel-Schüttler 3015 Orbitalschüttler GFL – Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, D
Vortex Genie 2 Labor-Mixer Scientif Icindustries, Bohemia,
NY, USA
Thermomixer comfort Thermomixer Eppendorf
Digitaler Blockheizer HX-1 Heitzblock Peqlab Biotechnologie GmbH,
Erlangen, D
MW 17705 Mikrowellen-Herd Cinex Electronic GmbH,
Ascheberg, D Microprocessor-based pH/mV/°C Bench
Meter (pH211)
pH-Meter HANNA Instruments
Deutschland GmbH, Kehl, D
Kühlschränke Kühlschränke (4 °C) Liebherr-International AG,
Bulle, CH
Gefrierschränke Gefrierschränke (‒20 °C) Liebherr;
Siemens-Electrogeräte GmbH, München, D
MDF-U7386S freezer Gefrierschrank (‒80 °C) Sanyo/Panasonic Corporation Milli-Q Integral
Wasseraufbereitungssystem,
Reinstwasserherstellung Merck Millipore, Darmstadt, D
ZBE 30-10 Brucheismaschine Ziegra GmbH, Isenhagen, D
Systec VX-150 Autoklav Systec GmbH, Linden, D
CytoGROW Optimal Series Inkubator Panasonic Healthcare
Corporation, Osaka, Japan (JPN)
Material und Methoden
Herasafe™ KS (NSF) Class II, Type A2 Biological Safety Cabinets
Sterilbank Thermo Scientific
Maxisafe 2020 Class II Biological Safety Cabinets
Sterilbank Thermo Scientific
Aqualine AL 12 Wasserbad Lauda, Lauda-Königshofen,
Deutschland (D)
Televal 31 Lichtmikroskop Carl Zeiss AG, Oberkochen, D
IX81 Motorized inverted microscope
FACS Canto 2 Durchflusszytometer BD Biosciences, San Jose, CA,
USA Amaxa Nucleofector II Device Elektroporator/
Nukleofektor
Lonza Group AG, Basel, Schweiz (CH)
Sonoplus GM 2200 Sonifizierer Bandelin electronic GmbH & Co.
KG, Berlin, D Mastercycler Gradient Gradienten-Thermocycler Eppendorf
Light Cycler 480 Roche Deutschland Holding
GmbH, Grenzach-Wyhlen, D
PowerPac™ Basic Power Supply Stromversorgungsgerät Bio-Rad PerfectBlue™ Twin
Doppelgel-Elektrophoresesystem
Gelelektrophoresesystem Peqlab PerfectBlue™ Web™ Tank-Elektroblotter Tankblotsystem Peqlab Gel iX20 Imager: UV-Transilluminator
Curix 60 Film-Entwickler Agfa HealthCare, Greenville, SC,
USA
DNr Bio Imaging System, MF-Chem BIS 3.2 Chemilumineszenzdetektor Biostep GmbH,
Jahnsdorf/Erzgebirge, D NanoDrop Spectrophotometer ND-1000 Spektralphotometer Peqlab
ELx808 Microplate Reader Absorptionsmesser BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA Orion L Micoplate Luminometer Luminometer Titertek-Berthold/Berthold
Detection Systems GmbH, Pforzheim, D
Epson Perfection V10 Flachbild-Scanner Seiko Epson Corp., Nagano, JPN
Seite | 28
Reaktionsgefäße Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, D
Zentrifugenröhrchen (15 und 50 ml) Zentrifugenröhrchen Sarstedt; Greiner Bio-One Internat. AG, Kremsmünster, Österreich (A); Rhenus SE &
Co. KG, Holzwickede, D Pipettenspitze 10; 200 und 1250 µl Pipettenspitze Sarstedt
Filterspitze 2,5; 10; 200 und 1250 µl Filterspitze Sarstedt serolog. Filterpipette 5; 10; 25 und 50 ml Zellkultur Sarstedt
Aspirationsspitze 2 ml Zellkultur Sarstedt
Microcapillary pipet tip, round Mikrokapillarspitze VWR International, Radnor, PA, USA
Filtropur S 0,2 µm Sterilfiltration Sarstedt
Injekt Solo 20 ml Spritze B. Braun Melsungen AG,
Melsungen, D
Simax Loborflasche (25 bis 5.000 ml) Laborglasflasche Kavalierglass Co. Ltd, Sázava, Tschechische Republik (CZ) Simax Becherglas (250 bis 10.000 ml) Becherglas Kavalierglass
Messzylinder (250 bis 1.000 ml) Messzylinder Brand
T75 Cell Culture Flask (white cap) Zellkulturflasche Nunc/Thermo Scientific T75 Cell Culture Flask (green cap) Zellkulturflasche Sarstedt
T75 Cell Culture Flask (red cap) Zellkulturflasche Nunc/Thermo Scientific;
Rhenus
Platte 6-well susp. Zellkultur Sarstedt
Platte 6-well adh. Zellkultur Rhenus
Platte 12-well susp. Zellkultur Nunc/Thermo Scientific
Neubauer-Zählkammer Zählkammer Paul Marienfeld GmbH & Co.
KG, Lauda-Königshofen, D Blaubrand Neubauer Improved Bright-Line Zählkammer Brand
TPP-Zellschaber 13 mm Dispenser TPP Techno Plastic Products AG,
Trasadingen, CH
LightCycler 480 Multiwell Plates 96 reverse transcriptase, quan-titative PCR (RT-q-PCR)
Sarstedt Costar 96-well Assay Plate, flat, non
treated, white polysterene
Luciferase-Assay Corning Inc., Corning, NY, USA Platte 96-well, polystyrene, flat bottom Bradford-Assay Greiner
Trans-Blot Transfer Membran 0,45 µm Blotting-Membran Bio-Rad
Blotting-Papier MN218B Whatman-Papier Macherey-Nagel GmbH & Co.
KG, Düren, D
Amersham Hyperfilm ECL 18 x 24 cm Röntgenfilm GE Healthcare, Chalfont St.
Giles, United Kingdom (UK)
Material und Methoden
Seite | 29 2.2 Verwendete Pufferlösungen
Nachfolgend sind die Zusammensetzungen von verwendeten Pufferlösungen angegeben. Wenn nicht anders vermerkt, beziehen sich die Konzentrationsangaben auf die einsatzfähige Arbeitslösung.
Wässrige Lösungen wurden mit de-ionisiertem Reinstwasser (Milli-Q Integral) hergestellt.
6x-Bromphenolblau-DNA-Ladepuffer (50 ml)
0,2 M Ethylendiamintetraacetat (EDTA; AppliChem GmbH, Darmstadt, D); 10 g Ficoll (GE-Healthcare);
eine Spatelspitze Bromphenolblau (AppliChem).
Gesamtzellextraktpuffer C (Puffer C)
150 mM NaCl (Merck Millipore); 25 mM MgCl2 (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D); 50 mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) -HCl (pH 7,4; (AppliChem); 10 % Glyzerin (Merck Millipore);
1 % Nonidet P40 (NP-40; Roche).
Tris-gepufferte Salzlösung (TBS)
50 mM Tris-Base (AppliChem); 150 mM NaCl; pH 7,6.
TBST
1 x TBS; 0,1 % Tween 20.
4x Lämmli-Probenpuffer
250 mM Tris-HCl (pH 6,8); 275 mM Natriumdodezylsulfat (SDS; AppliChem); 200 mM Dithiothreitol (DTT; AppliChem); 40 % Glyzerin.
10x SDS-Laufpuffer
250 mM Tris-base; 1,92 M Glycin (AppliChem); 35 mM SDS.
1x Transferpuffer
1x 10-fach-Transferpuffer (250 mM Tris-Base; 1,92 M Glycin; pH 8,3); 20 % Ethanol (96 %, vergällt, BÜFA GmbH & Co. KG, Oldenburg, D).
Ponceau Rot-Färbelösung
18,36 mM Trichloracetat (Roth); 0,26 mM Ponceau S (Sigma-Aldrich).
50x Tris-Acetat-EDTA-Puffer (TAE)
2 M Tris-base; 50 mM EDTA; 17,5 % Eisessig (Merck Millipore).
Erythrozyten-Lysepuffer
155 mM NH4Cl (Merck Millipore); 16 mM Na2CO3 (Merck Millipore); 1 mM EDTA; pH 7,3; steril filtriert mit Filtropur S 0,2 µm und Injekt Solo 20 ml.
Seite | 30 2.3 Verwendete DNA und siRNA
Die in dieser Arbeit verwendeten Vektoren sind in Tab. 2.2 zusammengefasst. Auf die Mutagenese der C/EBPβ-3’UTR wird in den Abschnitten 2.10.2 und 2.12 näher eingegangen.
Tabelle 2.2: Übersicht über verwendete Plasmide.
Plasmid Charakterisierung Herkunft
pRL-TK TATA-Promotor, HSV-TK-Promotor, T7-Promotor, Rluc, SV40- late-poly(A)-Terminator, p-AmpR, AmpR, pBR22-ori
Promega, Madison, f1-ori, SV40-early-Promotor, SV40-ori, NeoR, SV40-early- poly(A)-Terminator, pUC-ori, AmpR
Invitrogen/Life Technologies (LT), Carlsbad, CA, USA pC/EBPβ-FL Vektor-Rückgrat wie bei pcDNATM3.1/ V5-His B (+). C/EBPβ-
5’UTR und -CS (Stopp-Codon mutiert) über EcoRI- und XhoI-Schnittstellen vor die Epitope V5 und (His)6 eingefügt.
C/EBPβ-3’UTR hinter die Epitope und dem vektoreigenen Stopp-Codon kloniert (PmeI-Schnittstelle).
In Tab. 2.3 sind die verwendeten Oligonukleotide aufgeführt (Hersteller: Sigma-Aldrich). Außerdem wurde in dieser Arbeit eine Negativ-Kontroll-small interfering RNA (siRNA) verwendet: AllStars Negative siRNA 3’Alexa-Fluor488 (Qiagen, Venlo, Niederlande [NL]).
Tabelle 2.3: Übersicht über verwendete Oligonukleotide.
hGAPDH/E2/116U18 AGG TCG GAG TCA ACG GAT hGAPDH/E4/338L18 TCC TGG AAG ATG GTG ATG
ß2M_84U22 TGT GCT CGC GCT ACT CTC TCT T
ß2M_200L21 CGG ATG GAT GAA ACC CAG ACA
C/EBPb SybrG Fw GAG CAA GGC CAA GAA GAC CGT GGA C/EBPb SybrG Rev ACC TTC TTC TGC AGC CGC TCG T
Material und Methoden
Die in dieser Arbeit verwendeten Antikörper sind in Tab. 2.4 zusammengestellt.
Western-Blot-Analysen (Abschnitt 2.13.4) wurden mit Antikörpern durchgeführt, die gegen humane Epitope gerichtet waren. Diese wiesen zudem eine Reaktivität zu äquivalenten Mausepitopen auf.
Die Antikörper wurden in TBST, 5 % bovinem Serumalbumin (BSA, Roche) bzw. in TBST, 5 % Mager-milchpulver (kurz: Milch; Merck Millipore) gelöst und mit 0,2 ‰ Natriumazid (Merck Millipore) versetzt. Antikörper, die bei der Durchflusszytometrie (Abschnitt 2.6) verwendet wurden, waren in PBS (Biochrom AG Biotechnologie, Berlin, D), 2 % BSA gelöst.
Tabelle 2.4: Übersicht über verwendete Antikörper. Die molekulare Größe der Zielproteine ist angegeben [kDa]. Antikörper für die Durchflusszytometrie wurden in PBS, 2 % FCS (PBS-F) gelöst.
T, TBST. B, 5 % BSA. M, 5 % Magermilch.
Bezeichnung Zielprotein [kDa] Herkunft Verdünnung Hersteller
Primäre Antikörper für die Western-Blot-Analyse
eIF2α Kaninchen 1 : 1.000 (T-B) Cell Signaling eIF2α (L57A5) Mouse
Seite | 32 Tabelle 2.4: Weiterführung.
Bezeichnung Zielprotein [kDa] Herkunft Verdünnung Hersteller
Primäre Antikörper für die Western-Blot-Analyse Anti-Actin Antibody Aktin 45 Kaninchen 1 : 10.000 (T-B) Sigma-Aldrich Anti-GAPDH Antibody GAPDH 37 Kaninchen 1 : 60.000 (T-B) Sigma-Aldrich Sekundäre Antikörper für die Western-Blot-Analyse
Anti-Mouse-IgG-HRP Maus-IgG ‒ Pferd 1 : 5.000 (T-M) Alexis Biochemicals/
Enzo Life Science 31-Lichtmikrsokop bei 100-facher Vergrößerung kontrolliert. Zählungen wurden mit einer Neubauer-Zählkammer (Tiefe 0,100 mm; Fläche 0,0025 mm2) vorgenommen.
Fotographische Dokumentationen erfolgten an einem motorisierten IX81 Laser-Inversmikroskop mit der Software CellR Version 3.2 (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster, D). Die Zellen wurden direkt in ihrem Kulturgefäß mikroskopiert. Zur Überprüfung der Transfektionseffizienz war es mit diesem Mikroskop ebenfalls möglich, exogen exprimiertes GFP in erzeugten Transfektanten nach-zuweisen (Transfektion: Abschnitt 2.7).
Material und Methoden
Seite | 33 2.5.2 Zelllinien
Auf der nächsten Seite sind in Tabelle 2.5 die verwendeten etablierten Zelllienen aufgeführt. Sie wurden bei der DSMZ GmbH (Braunschweig, D) erworben. Der THP-1-Klon THP-1(R) wurde freundlicherweise von Prof. Dr. M. Rehli (Universitätsklinikum Regensburg, Regensburg, D) zur Verfügung gestellt und wurde dort unter anderem für die Publikation Pham et al. (2007) verwendet.
Immortalisierte mMΦ von Wildtyp (WT) -mäusen (C57BL/6J) wurden unserer Arbeitsgruppe mit freundlicher Genehmigung von Frau Prof. Dr. Valeria Poli (Dipartimento di Genetica, Biologia e Biochimica, Universitá di Torino, Torino, Italien) zur Verfügung gestellt (Gorgoni et al. 2002).
Für mikrobiologische Arbeiten wurden chemisch kompetente Escherichia coli-Zellen verwendet: One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli.
HeLa Zervix-Karzinom DSMZ (ACC 57)
immortalisierte Mauszelllinien
Immortalisierung von mMΦ aus Milz via VN-11 Infektion (Righi et al. 1991)
AG Poli
Escherichia coli-Stamm
TOP10 F‒ mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG
Invitrogen/LT
2.5.3 Kultivierung tierischer Zellen
Die kommerziell erworbenen Zelllinien wurden entsprechend der Vorgaben der DSMZ kultiviert. Als Medium wurde RPMI1640 (Chemicon/Merck Millipore) verwendet, dem verschiedene Additive zugesetzt wurden (siehe Tab. 2.6, nächste Seite).
Sämtliche in dieser Arbeit verwendeten eukaryotischen Zellen wurden in einem CytoGROW Optimal Series Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2-Atmosphäre kultiviert. Als Puffer- und Waschlösung wurde
Seite | 34 PBS (Biochrom) verwendet. Zentrifugationen wurden mit einer Laborzentrifuge (Heraeus Multifuge 3SR+) bei 400 x g, 4 °C bzw. Raumtemperatur (RT), 5 min durchgeführt. Die Zellen wurden maximal bis zur zwanzigsten Passage verwendet.
Die Kultivierung von Suspensionszellen erfolgte in T75 Zellkulturflaschen. Dafür wurden diese mit einer Dichte von 1 * 105 Zellen/ml in 30 ml Medium ausgesät. Die Zellen wurden alle zwei bis vier Tage passagiert.
Für experimentelle Ansätze wurden Suspensionszellen einen Tag vor dem Experiment 1 : 2 passagiert und am Tag des Experiments mit einer Zelldichte von 5 * 105 Zellen/ml Medium in 6-well (2 bzw.
3 ml) oder in 12-well Zellkulturplatten (1 ml) ausgesät. Die Ernte erfolgte entsprechend des experimentellen Ansatzes zu unterschiedlichen Zeitpunkten (0 bis 72 h).
THP-1-Zellen wurden für Nukleofektionsversuche gemäß Schnoor und Maeß in speziellem Medium äquilibriert (RPMI1640) und regeneriert (IMDM, Lonza; Nukleofektion: Abschnitt 2.7.3; Maeß et al.
2011, Schnoor et al. 2009). Die Medienzusätze sind in Tab. 2.6 zusammengefasst.
Tabelle 2.6: Übersicht über verwendete Medienzusätze. Abkürzungen: FCS, fetal calf serum, fetales Kälberserum. P/S, Penicillin/Streptomycin. NEAA, not essential amino acids, nicht-essentielle Aminosäuren.
Na-Pyruvat, Natriumpyruvat. OPI, Oxaloacetat/Pyruvat/Insulin. Nuk, Nukleofektion. ZK, Zellkultur.
* mBMdC-Medium, kurz: BMDM.
Zusatz
Endkon-zentration Herkunft Suspensionszellen adhärente Zellen
THP-1
MM-6 32D HeLa mMΦ mBMdC*
ZK Nuk
FCS
x
10 % Biochrom; Lonza + + + + + + +P/S 100 U/ml Biochrom + + + + + + 50
U/ml
L-Glutamin 2 % Sigma-Aldrich + + +
Na-Pyruvat 1 % Sigma-Aldrich + +
NEAA 1 % Invitrogen/LT + + +
OPI 0,5 % Sigma-Aldrich +
mIL-3 2 ng/ml Sigma-Aldrich +
mM-CSF
(rekombin.) 20 ng/ml Biolegend, San
Diego, CA USA +
1x
Trypsin-EDTA 33 % Sigma-Aldrich + +
Adhärente Zellen wurden in T-75 Zellkulturflaschen kultiviert. Es wurden 6 * 105 Zellen in 30 ml Medium ausgesät. Die Zellen wurden alle drei bis vier Tage passagiert. Dafür wurde der Kulturüberstand mit einer Vacusafe-Absaugpumpe abgenommen und die Zellen einmal mit PBS (RT) gewaschen. Anschließend wurden sie mit 10 ml RPMI1640 überschichtet, mit 5 ml 1x
Trypsin/EDTA-Material und Methoden
Seite | 35 Lösung versetzt, für 5 min bei 37 °C inkubiert und letztlich durch vorsichtiges Klopfen der Kultur-flasche von dieser abgelöst. Die Zellen wurden dann vom Gefäßboden abgespült, zentrifugiert und in frischem Kulturmedium resuspendiert. Für ein Experiment wurden sie in einer Zelldichte von 5 * 104 Zellen/ml Medium in 6- oder 12-well Zellkulturplatten ausgesät. Die Ernte erfolgte entsprechend des experimentellen Ansatzes zu unterschiedlichen Zeitpunkten (0 bis 72 h).
2.5.4 Primäre Mauszellen
In dieser Arbeit wurde ein ex vivo-Differenzierungsmodel angewandt. Dazu wurden Mäusen (C57BL/6J; 8 bis 12 Wochen alte Männchen; The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) primäre mBMdCs entnommen, kultiviert und zu Monozyten/mMΦ differenziert (siehe unten). Die bereits getöteten Tiere wurden freundlicher Weise von Frau Prof. Dr. Kyong-Hee Lee (MHH) zur Verfügung gestellt (das Töten erfolgte gemäß dem deutschen Tierschutzgesetz durch Begasung mit CO2; TierSchG 1972).
Die mBMdCs wurden aus den gesäuberten Ober- und Unterschenkelknochen der Hinterläufe isoliert.
Die Zellen wurden nach der Entnahme mit kaltem PBS gewaschen und in einer 4 °C-temperierten Laborzentrifuge bei 350 x g für 5 min zentrifugiert. Zur Beseitigung von Erythrozyten wurden die Zellen für 3 min bei RT in Erythrozyten-Lysepuffer inkubiert. Durch Zugabe von kaltem bone marrow-derived cell medium (BMDM; Zusammensetzung siehe Tab. 2.6) wurde die Reaktion gestoppt. Nach einem Zentrifugationsschritt (wie oben) wurden die Zellen in 37 °C temperiertem BMDM resuspendiert und zu je 6 * 106 Zellen in 10 ml (Bakterienkulturschale) bzw. zu je 1 * 106 Zellen in 2 ml BMDM (6-well Platte) ausgesät. Durch Zugabe von 20 ng/ml mM-CSF differenzierten die mBMdCs im Zeitraum von sieben Tagen zu mMΦ. Die Progression der Differenzierung wurde mittels Mikroskopie (Abschnitt 2.5.1) und Durchflusszytometrie (Abschnitt 2.6) überwacht.
2.5.5 Stimulanzien und Inhibitoren
Als experimentelles monozytäres Differenzierungsmodell wurden prä-monozytäre THP-1-Zellen standardmäßig mit 100 nM PMA (Calbiochem/Merck Millipore; Stammlösung: 1 mM in Ethanol, absolut, J.T. Baker/Avantor) für mindestens 24 h differenziert (Aldo et al. 2013, Tsuchiya et al. 1982).
In dieser Arbeit wurden außerdem verschiedene spezifische Inhibitoren eingesetzt. Bspw. wurde die PKR mit 6,8-Dihydro-8-(1H-imidazol-5-ylmethylene)-7H-pyrrolo[2,3-g]benzothiazol-7-one inhibiert.
Der PKR-Inhibitor ist gegen die ATP-Bindestelle von PKR gerichtet und hemmt die Kinase sehr effizient (Jammi et al. 2003). Dieser und weitere verwendete Inhibitoren sind in Tab. 2.7 auf der nächsten Seite aufgelistet.
Seite | 36 Tabelle 2.7: Übersicht über verwendete Inhibitoren.
Bezeichnung Ziel der Inhibition Lösungsmittel Endkonzentration Herkunft
Cycloheximid, CHX Translationsapparat Ethanol, absolut 10 µg/ml Calbiochem/Merck Millipore
PKR-Inhibitor PKR DMSO 1 µM Calbiochem/Merck
Millipore
BI-D1870 RSK1-4 Ethanol, absolut 2,5 µM Axon Medchem BV,
Groningen, NL
2.5.6 Zellernte
Die Ernte von adhärenten Zellen wurde wie folgt durchgeführt: Die zu erntenden Zellen wurden, wenn möglich, enzymatisch vom Kulturgefäßboden abgelöst (Trypsin-EDTA) oder für 20 min auf Eis inkubiert und anschließend vorsichtig mittels Dispenser abgeschabt. Die Zellen wurden bei 400 x g, 4 °C für 5 min zentrifugiert, einmal mit kaltem PBS gewaschen und nach erneutem Pelletieren in einem geeigneten Erntepuffer suspendiert oder bis zur weiteren Verwendung als Zellpellet bei ‒20 °C aufbewahrt.
Suspensionszellen wurden nach der Ernte kurz auf Eis inkubiert und dann wie die adhärenten Zellen weiterbehandelt.
2.5.7 Kultivierung von prokaryotischen Mikroorganismen
Mikroorganismen wurden in lysogeny broth-Medium (LB; Luria Broth Base, Invitrogen/LT) bei 37 °C und 400 rounds per minute (Umdrehungen pro Minute, rpm) in einem Schüttelinkubator kultiviert.
Zur Selektion von plasmidtragenden Transformanten wurde dem Medium Ampicillin zugesetzt (Sigma-Aldrich; Endkonzentration 100 μg/ml; Transformation: Abschnitt 2.7.4). Für eine Plasmid-MiniPrep (Plasmid-Präparation: Abschnitt 2.8.1) wurden 4 ml Flüssigmedium mit den entsprechen-den Transformanten inokuliert. Eine Plasmid-MaxiPrep wurde mit 300 ml Hauptkultur durchgeführt.
Diese wurde mit einer 4 ml-Vorkultur inokuliert und über Nacht kultiviert.
Selektives Feststoffmedium wurde mit ImMedia Amp Agar (Invitrogen/LT) hergestellt.
2.6 Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie stellt eine Methode dar, bei der Zellmerkmale in Echtzeit und im hohen Durchsatz bestimmt werden können. Einerseits wurde die Methode verwendet, um die Progression der Differenzierung von primären mBMdCs zu mMΦ anhand ihrer Oberflächenmoleküle zu
Material und Methoden
Seite | 37 beurteilen (Abschnitt 2.5.3), andererseits konnte mit ihr die Transfektionseffizienz (Transfektion:
Abschnitt 2.7) bestimmt werden. Dafür wurden die Zellen mit dem GFP-Expressionsplasmid pmaxGFP transfiziert.
2.6.1 Antikörperbasierter Nachweis von Zelloberflächenmolekülen
Der Nachweis von Zelloberflächenproteinen bei der Überwachung der Differenzierung von mMΦ erfolgte per Antikörperfärbung. Die zu untersuchenden Zellen (mindestens 1 * 105) wurden hierzu einmal mit PBS gewaschen und anschließend in 100 µl PBS, 2 % FCS aufgenommen. Die Zellsuspension wurde mit fluoreszenzfarbstoffmarkierten Antikörpern versetzt (Tab. 2.4; Verdünnung 1 : 200) und für 30 min auf Eis inkubiert. Die Absorptions- und Emissionsmaxima der verwendeten Farbstoffe sind in Tabelle 2.8 zusammen gestellt.
Tabelle 2.8: Übersicht über die Absorptions- und Emissionsmaxima der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe.
Weitere Informationen zu den verwendeten Antikörpern: siehe Tab. 2.4.
Zielmolekül Farbstoff Absorptionmax [nm] Emissionmax [nm]
CD11b Allophycozyanin (APC) 651 662
CD11c Peridinin Chlorophyll (PerCP)/Cy5.5 483/675 694
Ly-6C Fluoresceinisothiozyanat (FITC) 494 518
Ly-6G (Gr-1) R-Phycoerythrin (PE) 500/568 578
DNA 4′,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) 358 461
Nach der 30-minütigen Antikörperinkubation wurde dem Ansatz 4′,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI;
1 : 200; Invitrogen/LT) zugegeben und für weitere 30 sek inkubiert. In dieser kurzen Zeit vermag der DNA-Farbstoff nur in tote Zellen einzudringen. Die DAPI-Färbung diente folglich der Diskriminierung von lebenden und toten Zellen (Dimmick 2011). Anschließend wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und letztlich in PBS, 2 % FCS aufgenommen und bis zur Messung auf Eis gelagert.
Die Durchflusszytometrie wurde mit einem FACS Canto 2 unter Verwendung der Software BD FACSDivaTM (BD Biosciences) durchgeführt. Zum Einstellen der Kanäle wurden unbehandelte Zellen sowie einfachgefärbte Präparate gemessen. Zusätzlich angefertigte Doppelfärbungen dienten der rechnerischen Korrektur (Kompensation) der zwei kombinierten Farbstoffe.
Durch das Setzen geeigneter Grenzen wurden von jeder Probe 1 * 105 Ereignisse gemessen, die als lebende Zellen angesehen werden konnten. Die Auswertung der prozentualen Verteilung der betrachteten Oberflächenproteine erfolgte mit der Anwendung Flowing Software Version 2.5.1.
Seite | 38 2.6.2 Nachweis von exogen exprimiertem maxGFP
Zur Ermittlung der allgemeinen Transfektionseffizienz wurden THP-1-Zellen mit pmaxGFP transfiziert (Transfektion: Abschnitt 2.7.2). Die Transfektanten wurden mit PBS gewaschen, mit 1 : 200 DAPI gefärbt (siehe oben), erneut gewaschen und in PBS, 2 % FCS aufgenommen. Die durchflusszyto-metrische Analyse erfolgte wie oben beschrieben. Der prozentuale Anteil GFP-positiver Zellen von der Gesamtzahl lebender Zellen entspricht der Transfektionseffizienz.
2.7 Genetische Manipulation von Zellen
In dieser Arbeit wurden verschiedene Protokolle angewandt, um eukaryotische Zellen transient mit Plasmid-DNA zu transfizieren. Die Beschreibung dieser Methoden wie auch die Transformation von chemisch kompetenten E. coli-Zellen sind Gegenstand dieses Abschnitts.
2.7.1 Transfektion von HeLa-Zellen
Für die Transfektion von HeLa-Zellen mit Plasmid-DNA wurde das nicht-liposomale X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent (Roche) verwendet. Einen Tag vor der Transfektion wurden die Zellen so ausgesät, dass sie am Tag der Transfektion eine Konfluenz von 70 bis 80 % aufwiesen. 0,4 µg Ziel-plasmid wurden zusammen mit 0,1 µg Renilla-Luciferase-exprimierendem ReporterZiel-plasmid pRL-TK in 97 µl OptiMEM I (Invitrogen/LT) verdünnt und mit 1,5 µl X-tremeGENE 9 Reagenz versetzt (das Verhältnis von eingesetzter DNA-Menge [µg] zum Transfektionsreagenz [µl] betrug 1 : 3). Der Trans-fektionsansatz wurde 15 min bei RT inkubiert und anschließend tropfenweise zu den Zellen gegeben.
Nach vierstündiger Inkubation im Kulturschrank wurde das Medium gewechselt. Die Zellen wurden am Folgetag weiter behandelt bzw. geerntet.
2.7.2 Transfektion von THP-1-Zellen
THP-1-Zellen wurden mit Hilfe des X-tremeGENE HD DNA Transfection Reagent (Roche) mit Plasmid-DNA transfiziert. Die transiente Transfektion erfolgte nach zwei Protokollen:
(1) 1 * 106 THP-1-Zellen wurden in 3 ml RPMI1640, 10 % FCS, ohne P/S in einer 6-well-Platte ausgesät. Der Transfektionsansatz, bestehend aus 0,9 µg Zielplasmid, 0,1 µg pRL-TK, 95 µl OptiMEM I sowie 3 µl X-tremeGENE HD Reagenz, wurde nach 15-minütiger Inkubation bei RT tropfenweise auf die Zellen gegeben. Das Medium wurde nach 4 h gewechselt. Am Folgetag wurden die Zellen weiter behandelt bzw. geerntet.
Material und Methoden
Seite | 39 (2) Das zweite Protokoll sah eine Aussaat von 2 * 105 Zellen in 500 µl P/S-freiem Medium in einer 12-well-Platte vor. Für jede Bedingung wurden 6 wells benötigt. In diese wurde der Transfektionsansatz, bestehend aus 100 ng Zielplasmid, 20 ng pRL-TK, 25 nM AllStars Negative siRNA 3’AlexaFluor488, 97 µl OptiMEM I sowie 0,3 µl X-tremeGENE HD Reagenz, tropfenweise gegeben. Die Zugabe von siRNA erhöhte die Transfektionseffizienz deutlich (nicht veröffentlichte Daten der Arbeitsgruppe). Am Folgetag wurden die Zellen weiter behandelt bzw. geerntet. Ansätze gleicher Bedingung wurden hierzu vereinigt.
2.7.3 Nukleofektion von THP-1
Eine weitere Möglichkeit Zellen mit Plasmid-DNA zu transfizieren besteht darin, die Zellen durch Anlegen einer elektrischen Spannung zu elektroporieren und die DNA in die Zelle zu transferieren.
Weil man bei den im Rahmen dieser Arbeit gewählten Bedingungen davon ausgeht, dass die DNA dabei unmittelbar in den Zellkern gelangt (Martinet et al. 2003), spricht man von einer Nukleofektion.
THP-1-Zellen wurden in dieser Arbeit mit einem Amaxa Nucleofector II Device gemäß Schnoor und Maeß nukleofiziert (Maeß et al. 2011, Schnoor et al. 2009). Für die Nukleofektion wurden die Reagenzien Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V sowie Human Monocyte Nucleofector Kit (beide Lonza) und die Nukleofektorprogramme U-013 und Y-001 verwendet. Vor dem Versuch wurden die Zellen für mindestens eine Passage in Nukleofektionsmedium auf der Basis von RPMI-1640 äquilibriert (siehe Tab. 2.6, THP-1 Nuk). Für eine Nukleofektion wurden 2,5 * 106 Zellen in 100 µl Reagenz aufgenommen, mit 400 ng Zielplasmid sowie 100 ng pRL-TK versetzt und nukleofiziert. Die Zellen konnten sich in Regenerationsmedium auf der Basis von IMDM für 4 h regenerieren (siehe Tab. 2.6, THP-1 Nuk). Anschließend wurde das Medium gewechselt, die Zellen über Nacht kultiviert und am Folgetag weiter behandelt bzw. geerntet.
2.7.4 Transformation von E. coli
Transformationen von chemisch kompetenten E. coli-Zellen mit Plasmid-DNA erfolgten entsprechend der von Hanahan beschriebenen Hitzeschock-Methode (Hanahan 1985). Dafür wurden die Zellen mit 20 bis 100 ng DNA (versetzt mit 10 % (v/v) 1,2 M NaCl; 0,06 M MgCl2, Invitrogen/LT) transformiert.
Nach der Hitzeschock-Transformation bei 42 °C, 30 sek, und der Regeneration in SOC-Medium (super optimal broth (SOB) -Medium mit 20 mM Glucose; Invitrogen/LT) wurden die Zellen bei 8.000 x g, RT, für 30 sek zentrifugiert, in 80 µl sterilem H2O resuspendiert und auf selektivem Feststoffmedium ausplattiert. Nach einer Inkubation bei 37 °C über Nacht wurden am Folgetag die erhaltenen Klone auf frischen Selektionsfeststoffmedien ausgestrichen und weiter untersucht.
Seite | 40 2.8 Präparation von Nukleinsäuren
2.8.1 Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli
Plasmidpräparationen aus E. coli-Flüssigkulturen wurden entsprechend der Herstellerangaben mit folgenden Kits durchgeführt:
QIAprep Miniprep/Spin Miniprep (Qiagen), NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel),
NucleoBond® Xtra Midi/Maxi (Macherey-Nagel).
Mit einem NanoDrop Spektralphotometer ND-1000 wurden die Plasmidpräparate auf Reinheit und
Mit einem NanoDrop Spektralphotometer ND-1000 wurden die Plasmidpräparate auf Reinheit und