Medizinische Hochschule Hannover
Institut für Klinische Chemie
Regulation des Transkriptionsfaktors C/EBPβ während monozytärer Differenzierung ‒ Beteiligung der Proteinkinase R
INAUGURALDISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
‒ Doctor rerum naturalium ‒ (Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
Bastian Welz
aus Wolmirstedt
Hannover 2016
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover.
Präsident Prof. Dr. med. Christopher Baum
Wissenschaftliche Betreuung Prof. Dr. med. Korbinian Brand Wissenschaftliche Zweitbetreuung Prof. Dr. rer. nat. Andreas Pich
1. Gutachter: Prof. Dr. med. Korbinian Brand 2. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Andreas Pich 3. Gutachter: Prof. Dr. med. Helmut Holtmann
Tag der mündlichen Prüfung vor der Prüfungskommission: 26. Juli 2016
Prof. Dr. rer. nat. Juergen Alves Prof. Dr. med. Korbinian Brand Prof. Dr. rer. nat. Andreas Pich Prof. Dr. med. Helmut Holtmann
Zusammenfassung
Seite | I Bastian Welz
„Regulation des Transkriptionsfaktors C/EBPβ während monozytärer Differenzierung ‒ Beteiligung der Proteinkinase R.“
Zusammenfassung
Die Differenzierung von Monozyten und Makrophagen aus pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen wird durch zahlreiche Transkriptionsfaktoren reguliert, so auch durch das CCAAT/
enhancer binding protein β (C/EBPβ). Von dem Faktor existieren drei Proteinisoformen, die durch einen alternativen Translationsmechanismus aus nur einer intronlosen mRNA gebildet werden. Die beiden großen Varianten (liver-enriched activating proteins LAP* und LAP; LAP*/LAP) fördern die Differenzierung und hemmen die Proliferation, die verkürzte Form liver-enriched inhibiting protein (LIP) hemmt hingegen die Differenzierung und ist proliferationsfördernd. LIP fungiert als dominant- negativer Regulator für LAP*/LAP wodurch die Funktionalität der drei Isoformen vom zellulären LAP/LIP-Verhältnis abhängt. Während der Monopoese verschiebt sich dieses Verhältnis durch einen starken LAP*/LAP-Anstieg auf die Seite von LAP. So wird bei sinkender Proliferationsfähigkeit die Differenzierung (weiter) gefördert.
In der vorliegenden Arbeit wurden anhand prä-monozytärer Differenzierungsmodelle regulatorische Mechanismen erarbeitet, welche die C/EBPβ-Proteinsynthese und -stabilität während der terminalen Monopoese beeinflussen. Initial wurde die LAP*/LAP-Entwicklung in einem (ex vivo-) Monopoese- modell untersucht, bei dem primäre Mausknochenmarkzellen zu Makrophagen differenziert wurden – die LAP*/LAP-Menge stieg mit fortschreitender Differenzierung an. Dieses Ergebnis konnte in den Zelllinien THP-1 und MM-6 bestätigt werden, die mit dem Phorbolester PMA stimuliert wurden. Im Gegensatz zu der enormen LAP*/LAP-Proteinzunahme war die C/EBPβ-mRNA in PMA-stimulierten THP-1-Zellen mit einer lediglich zweifachen Zunahme nur leicht beeinflusst. Es zeigte sich, dass die C/EBPβ-Synthese durch untranslatierte mRNA-Bereiche (UTRs) reguliert/gehemmt wird – insbeson- dere durch die 3’UTR, deren inhibitorisches Potential hauptsächlich vom 3’UTR+7+206-Bereich ausging.
Die im PMA-Differenzierungsmodell beobachtete starke LAP*/LAP-Proteinzunahme (bei nahezu unbeeinflusster C/EBPβ-mRNA-Menge) beruht auf einer veränderten mRNA-Translation und/oder auf einer erhöhten Proteinstabilität. Frühere Arbeiten zeigten, dass die LAP*/LAP-Synthese durch den Ras-Raf-MEK-ERK-RSK-Signalweg (MAPK1/2-Kaskade) und den Translationsinitiationsfaktor eIF4B beeinflusst wird (Panterodt, 2015), der als Co-Faktor der RNA-Helikase eIF4A fungiert und zusammen mit dieser translationshemmende mRNA-Sekundärstrukturen auflöst. Diese werden als besonders stabil angesehen, wenn sie von GC-reichen Sequenzen dominiert werden, wie sie bspw. in der C/EBPβ-mRNA zu finden sind.
Seite | II Das bestehende C/EBPβ-Regulationsmodell konnte nun um einen Faktor erweitert werden: die Proteinkinase R (PKR). Die Ergebnisse sprechen für eine positive, bidirektionale, funktionale Inter- aktion zwischen der PKR und dem MAPK1/2-Signalweg: Zwischen ERK1/2, RSK1 und PKR besteht sehr wahrscheinlich eine bisher unbeschriebene positive Rückkopplungsschleife, die die Aktivität des MAPK1/2-Signalwegs im PMA-Differenzierungsmodell verstärkt, somit die eIF4B-Aktivität fördert, was letztlich die LAP*/LAP-Synthese begünstigt. Bei den gewählten Versuchsbedingungen wurde das klassische PKR-Substrat eIF2α nicht beeinflusst, was für eine alternative PKR-Funktion spricht.
Neben ihres positiven Einflusses auf die C/EBPβ-Proteinsynthese wurde in dieser Arbeit ebenfalls erstmals beobachtet, dass die PKR an der Regulation der LAP*/LAP-Proteinstabilität beteiligt ist.
Anhand von Protease-Assays konnte gezeigt werden, dass die PKR die chymotrypsinähnliche proteolytische Aktivität des Proteasoms sowie die Aktivität von Calpainen in PMA-stimulierten THP-1-Zellen hemmte, was vermutlich zur Stabilisierung von LAP*/LAP beitrug.
Übergeordnet konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die im monozytären Differenzierungs- modell beobachtete starke LAP*/LAP-Proteinzunahme auf eine Kombination aus einer nur leicht erhöhten C/EBPβ-mRNA-Menge, einer veränderten C/EBPβ-Proteinsynthese sowie einer deutlich erhöhten Proteinstabilität zurückzuführen ist. Die Synthese und die Stabilität von LAP*/LAP wurden dabei durch die Aktivität der PKR maßgeblich begünstigt.
Abstract
Seite | III Bastian Welz
„Regulation of the transcription factor C/EBPβ during monocytic differentiation – involvement of protein kinase R.“
Abstract
During their differentiation out of a pool of pluripotent hematopoietic stem cells, monocytes and macrophages pass through several developmental stages. The occurring changes are regulated by a plenty of transcription factors, including CCAAT/enhancer binding protein β (C/EBPβ). Its intronless mRNA yields three protein isoforms formed by alternative translation: Two large variants, the liver- enriched activating proteins (LAP* und LAP; LAP*/LAP), supporting differentiation and inhibiting proliferation as well as a short isoform called liver-enriched inhibiting protein (LIP). The last one functions as a negative regulator of LAP*/LAP, inhibits differentiation, and promotes cell division as well as proliferation. The respective LAP/LIP ratio controls the opposing functions of the C/EBPβ protein isoforms in the cell. During the process of monocytic differentiation, LAP*/LAP are predominantly expressed and the LAP/LIP ratio shifts towards the activating isoforms, support further differentiation and impeding proliferation.
The present thesis focuses on the examination of cellular mechanisms regulating protein synthesis and stability of C/EBPβ during the late stages of monocyte/macrophage maturation. Therefore, several pre-monocytic models were used. In detail, the presented results demonstrate a dramatic increase in LAP*/LAP amounts during monocytic ex vivo differentiation of bone marrow-derived cells towards monocytes and macrophages. This result was validated in the THP-1 and MM-6 cell lines stimulated with the phorbol ester PMA. In contrast to the dramatic increase in protein amounts, the C/EBPβ mRNA level was only slightly increased by PMA, i. e. only 2-fold elevated in comparison to untreated cells. The Investigation of C/EBPβ protein synthesis reveals a strict negative regulatory influence of its untranslated regions (UTRs). In particular, the 3’UTR+7+206 region showed a strong inhibitory effect on translation efficiency.
With respect to the dramatic increase in the presence of only slightly elevated mRNA levels during differentiation, the PMA-induced increase in C/EBPβ protein amounts appear to be based on a modulated translation and/or an increase in protein stability. As demonstrated in our lab, the synthesis of C/EBPβ is regulated by the Ras-Raf-MEK-ERK-RSK signalling cascade (MAPK1/2 signalling) as well as the translational initiation factor eIF4B (Panterodt 2015). eIF4B is an important co-factor of the RNA-helicase eIF4A. Together, they presumably resolve stabile inhibitory structures within the GC-rich C/EBPβ mRNA, thus promoting its translation.
Seite | IV In this work the regulatory model of C/EBPβ expression could be expanded by another factor: protein kinase R (PKR). The results indicate a positive, bidirectional, functional interaction between PKR and MAPK1/2 signalling: There might be a previously unknown regulatory feedback loop between ERK1/2, RSK1, and PKR boosting MAPK1/2 signalling, elevating eIF4B activity that finally enables an increased LAP*/LAP protein synthesis during monocytic differentiation. Interestingly, this effect did not depend on phosphorylation of the classical PKR target eIF2α, suggesting an alternative PKR function in this context.
In addition, PKR also elevated LAP*/LAP protein stability in PMA-stimulated THP-1 cells. Using protease-assays it could be demonstrated that PKR is involved in the regulation of interfered the chemotrypsin-like proteolytic activity of the proteasome as well as the activity of calpains, presumably causing LAP*/LAP stabilization during monopoiesis.
In summary, the presented results indicate that the observed increase in LAP*/LAP amounts during monocytic differentiation is based on a combination of slightly elevated C/EBPβ mRNA, clearly enhanced C/EBPβ protein synthesis, and an increased LAP*/LAP protein stability. Importantly, the synthesis and stability of C/EBPβ proteins were positively influenced by PKR.
Inhaltsverzeichnis
Seite | V
Inhaltsverzeichnis
ZUSAMMENFASSUNG ... I
ABSTRACT ... III
INHALTSVERZEICHNIS ... V
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ... IX
ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS ... XII
Abbildungsverzeichnis ... XII Tabellenverzeichnis ... XIV
1 EINLEITUNG ... 1
1.1 Die Hämatopoese ... 1
1.1.1 Die Hämatopoese und das Immunsystem ... 1
1.1.2 Die Monopoese ... 3
1.2 Die Bedeutung und die Funktion von Monozyten und MΦ ... 5
1.3 Die Monopoese im Modell ... 6
1.3.1 Zelluläre Modelle ... 6
1.3.2 Differenzierung-induzierende Agenzien ... 8
1.4 Die C/EBP-Transkriptionsfaktoren ...11
1.4.1 Die C/EBP-Familienmitglieder in der Übersicht ... 11
1.4.2 Der Transkriptionsfaktor C/EBPβ ... 12
1.5 Die Regulation der C/EBPβ-Expression und -Funktion ...15
1.5.1 Regulation der CEBPB-Transkription und der C/EBPβ-mRNA-Stabilität... 16
1.5.2 Die Alternative Translation der C/EBPβ-mRNA ... 16
1.5.3 Regulation der C/EBPβ-Aktivität durch Protein-Protein-Interaktionen und post- translationale Modifikationen ... 17
1.5.4 Der proteolytische Abbau von C/EBPβ-Protein ... 18
1.6 Signalwege, die die Expression von C/EBPβ regulieren ...18
1.6.1 Der PI3K-mTOR-S6K-Signalweg ... 19
1.6.2 Die Proteinkinase C-Familie und der MAPK1/2-Signalweg ... 20
1.6.3 Der Einfluss von PKR und eIF2α auf die zelluläre Proteinsynthese ... 22
1.6.4 eIF4B als Schlüsselmolekül für die erfolgreiche C/EBPβ-Proteinsynthese ... 24
1.7 Zielsetzung/Fragestellung ...25
Seite | VI
2 MATERIAL UND METHODEN ... 26
2.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien ...26
2.2 Verwendete Pufferlösungen ...29
2.3 Verwendete DNA und siRNA ...30
2.4 Antikörper ...31
2.5 Zellkultur ...32
2.5.1 Mikroskopie ... 32
2.5.2 Zelllinien ... 33
2.5.3 Kultivierung tierischer Zellen ... 33
2.5.4 Primäre Mauszellen ... 35
2.5.5 Stimulanzien und Inhibitoren ... 35
2.5.6 Zellernte ... 36
2.5.7 Kultivierung von prokaryotischen Mikroorganismen ... 36
2.6 Durchflusszytometrie ...36
2.6.1 Antikörperbasierter Nachweis von Zelloberflächenmolekülen ... 37
2.6.2 Nachweis von exogen exprimiertem maxGFP... 38
2.7 Genetische Manipulation von Zellen ...38
2.7.1 Transfektion von HeLa-Zellen ... 38
2.7.2 Transfektion von THP-1-Zellen ... 38
2.7.3 Nukleofektion von THP-1 ... 39
2.7.4 Transformation von E. coli ... 39
2.8 Präparation von Nukleinsäuren ...40
2.8.1 Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli ... 40
2.8.2 Isolation von Gesamtzell-RNA aus tierischen Zellen ... 40
2.8.3 Konzentrieren von Gesamtzell-RNA ... 40
2.9 Reverse Transkription von Gesamt-RNA, cDNA-Synthese ...40
2.10 Polymerase-Kettenreaktion ...41
2.10.1 PCR-Bedingungen ... 41
2.10.2 PCR-basierte Mutagenese ... 42
2.10.3 Reverse transcriptase, quantitative PCR ... 43
2.10.4 Fällen von PCR-Produkten ... 44
2.10.5 Sequenzierung... 44
2.11 Gelelektrophorese ...44
2.11.1 Agarose-Gelelektrophorese ... 44
2.11.2 Exzision von DNA-Fragmenten aus einem Agarosegel ... 45
2.11.3 RNA-Gelektrophorese ... 45
2.12 Klonieren von DNA ...45
2.12.1 Glätten von DNA-Fragmenten, Klenow-Reaktion ... 45
2.12.2 Ligation von DNA-Fragmenten ... 46
Inhaltsverzeichnis
Seite | VII
2.12.3 DNA-Verdau mittels Restriktions-Endonukleasen ... 46
2.13 Proteinbiochemische und immunologische Analyse ...46
2.13.1 Herstellung eines Gesamtzell-Proteinextrakts ... 46
2.13.2 Bestimmung der Proteinmenge nach Bradford ... 46
2.13.3 Renilla-Assay ... 47
2.13.4 Immunologischer Proteinnachweis: Western-Blot-Analyse ... 48
2.13.4.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ... 48
2.13.4.2 Blotting ... 49
2.13.4.3 Immunologischer Nachweis von Proteinen ... 50
2.13.4.4 Strippen einer Western-Blot-Membran... 50
2.13.4.5 Densitometrie ... 50
2.13.5 Protease-Assay ... 51
2.14 Software, statistische Auswertung und Erstellung von Abbildungen und Diagrammen ...51
2.14.1 Software-Lösungen ... 51
2.14.2 Auswertung ... 52
3 ERGEBNISSE ... 53
3.1 Während der monozytären Differenzierung von primären Maus-Knochenmarkzellen ist die C/EBPβ-LAP*/LAP-Proteinexpression deutlich erhöht ...53
3.1.1 Differenzierung von mBMdCs zu mMΦ: Mikroskopische Untersuchung ... 53
3.1.2 Differenzierung von mBMdCs zu mMΦ: Untersuchung von Oberflächenproteinen mittels Durchflusszytometrie ... 54
3.1.3 Die mLAP*/LAP-Proteinmengen nehmen während der monozytären Differenzierung von mBMdCs zu mMΦ deutlich zu ... 56
3.2 Diskrepanz zwischen stark erhöhter LAP*/LAP-Proteinmenge und nur leicht veränderter C/EBPβ- mRNA-Menge im humanen Monopoese-Modell ...57
3.2.1 PMA induziert die Differenzierung von prä-monozytären THP-1-Zellen hin zu einem MΦ-ähnlichen Phänotyp ... 57
3.2.2 Myelozytäre Modelle reagieren unterschiedlich auf die PMA-Stimulation ... 58
3.2.3 Die C/EBPβ-mRNA-Menge ist in PMA-stimulierten THP-1-Zellen nur geringfügig erhöht ... 59
3.3 Die C/EBPβ-UTRs regulieren die Translation der C/EBPβ-mRNA ...60
3.3.1 Die Sekundärstruktur der C/EBPβ-mRNA weist einen hohen Anteil an stabilen Strukturen auf ... 61
3.3.2 Die C/EBPβ-UTRs reduzieren in HeLa-Zellen die exogene C/EBPβ-Translation ... 65
3.3.3 Die C/EBPβ-UTRs beeinflussen die Translation auch im monozytären Modell ... 67
3.3.4 Für die C/EBPβ-3‘UTR+7+206 wurden sechs potentielle Bindungspartner identifiziert ... 69
3.4 PKR ist an der Regulation der C/EBPβ-Proteinexpression während der monozytären Differenzierung beteiligt ...71
3.4.1 PKR induziert und aktiviert eIF4B in PMA-stimulierten THP-1- und MM-6-Zellen... 71
3.4.2 PKR reguliert im monozytären Differenzierungsmodell die C/EBPβ-LAP*/LAP- Proteinexpression ... 72
Seite | VIII
3.4.3 PKR wird in PMA-stimulierten THP-1-Zellen induziert und aktiviert ... 73
3.4.4 eIF2α wird in PMA-stimulierten THP-1-Zellen nicht von PKR beeinflusst ... 73
3.4.5 eIF2α wird in PMA-stimulierten MM-6-Zellen ebenfalls nicht von PKR beeinflusst ... 75
3.5 PKR und die MAPK1/2-Signalkaskade beeinflussen sich in PMA-stimulierten THP-1-Zellen gegenseitig ...76
3.5.1 PKR reguliert in PMA-stimulierten THP-1-Zellen den MAPK1/2-Signalweg ... 76
3.5.2 Die MAPK1/2-Signalkaskade aktiviert PKR in PMA-stimulierten THP-1-Zellen ... 78
3.6 PKR erhöht die Proteinstabilität von LAP*/LAP ...79
3.6.1 LAP*/LAP werden in PMA-stimulierten MM-6-Zellen stabilisiert ... 79
3.6.2 PKR stabilisiert LAP*/LAP während der monozytären Differenzierung indem es die Protein- degradation hemmt ... 80
3.6.3 PKR hemmt die Aktivität Chymotrypsin-ähnlicher Proteasen ... 82
3.6.4 PKR ist an der reduzierten proteolytischen Aktivität von Calpainen in PMA-stimulierten THP-1- Zellen beteiligt. ... 83
4 DISKUSSION ... 85
4.1 C/EBPβ und die monozytäre Differenzierung ...85
4.1.1 Die Proteinmengen von mLAP*/LAP nehmen bei der monozytären Differenzierung von primären mBMdCs deutlich zu ... 85
4.1.2 Die C/EBPβ-Proteinmenge ist in PMA-stimulierten THP-1- und MM-6-Zellen bei nur leicht induzierter C/EBPβ-mRNA stark erhöht ... 86
4.2 Die Translation der C/EBPβ-mRNA wird durch endogene Sequenzabschnitte reguliert ...88
4.3 Während der Monopoese ist PKR an der Regulation der C/EBPβ-Expression beteiligt ...93
4.4 PKR stabilisiert LAP*/LAP durch die Hemmung proteolytischer Systeme...97
4.5 eIF2α wird in PMA-stimulierten THP-1-Zellen nicht durch PKR beeinflusst ... 100
4.6 Schlussfolgerungen ... 103
REFERENZEN ... 106
DANKSAGUNG ... 122
LEBENSLAUF ... 124
PUBLIKATIONSHINWEIS ... 126
EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG ... 127
Abkürzungsverzeichnis
Seite | IX
Abkürzungsverzeichnis
Kürzel Bedeutung
32D murine hämatopoetische Progenitorzelllinie
AML akute myeloische Leukämie APC Allophycozyanin
ApoE Apolipoprotein E
APS Ammoniumperoxodisulfat ATRA all-trans-Retinsäure bp Basenpaare
BMDM BMdC-Medium
BMdC bone marrow-derived cells BSA bovines Serumalbumin bZIP basischer Leucin-Zipper
cAMP cyclic adenosine monophosphate CD cluster of differentiation
cDNA complementary DNA CFU colony forming unit CHIT1 Chitinase 1
CHX Cycloheximid
CREB cAMP response element-binding proteins
CS coding sequence
CSF colony stimulating factor CUGBP CUG-Bindeprotein c-SRC cellular sarcoma protein
C/EBP CCAAT/enhancer-binding protein DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol DC dendritic cell
DMSO Dimethylsulfoxid DNA deoxyribonucleic acid
dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat DSMZ Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH dsRNA doppelsträngige RNA
Kürzel Bedeutung
DTT Dithiothreitol E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraacetat EGR2 early growth response 2 eIF eukaryotischer Initiationsfaktor ERK extracellular signal-regulated
kinase et al. et alii
FCS fetal calf serum
FITC Fluoresceinisothiozyanat FL full length,
Volllänge (-nkonstrukt)
FUBP2 FUSE-bindendes Protein 2 (KHSRP) GAPDH Glyzerinaldehyd-3-phosphat-
dehydrogenase
GCN general control nonderepressible GFP grün-fluoreszierendes Protein GM-CSF granulocyte/macrophage CSF Grb2 growth factor receptor-bound
protein 2
HLA human leukocyte antigen (vgl. MHC)
hnRNP G heterogenes nukleäres
Ribonukleoprotein G (RBMX) HRI heme-regulated inhibitor kinase HRP horseraddish peroxidase HuR Hu-Antigen R
IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin
IRF Interferon-regulatorischer Faktor IκB inhibitorisches κB-Protein
Seite | X Kürzel Bedeutung
kDa Kilodalton
KHSRP KH-type splicing regulatory protein
ko knock out
LAP liver-enriched activating protein LIP liver-enriched inhibiting protein LPS Lipopolysaccharid
Ly Lymphozytenantigen m- murin, Maus-
MAPK mitogenaktivierte Proteinkinase M-CSF monocyte/macrophage CSF
MCP monozytenchemotaktischen Protein MdMΦ monocyte-derived MΦ
MEF murine embryonic fibroblast MEK mitogen-activated ERK kinase MHC major histocompatibility complex MHH Medizinische Hochschule Hannover miR microRNA (miRNA)
Mincle MΦ-induzierbares Ca2+-abhängiges (C-Typ) Lektin
MM-6 Mono Mac-6 (Zelllinie) mRNA messenger RNA
MSK mitogen- und stressaktivierte Proteinkinase
mTOR mammalian target of Rapamycin
MΦ Makrophage
NEAA not essential amino acids NK natürliche Killerzelle NOS nitric-oxide synthase Nuk Nukleofektion
OPI Oxaloacetat/Pyruvat/Insulin ORF open reading frame (vgl. CS) PACT PKR-associated activator
PAGE Polyacrylamidgel-Elektrophorese PBS phosphate buffered saline PCR polymerase chain reaction
Kürzel Bedeutung
PDGF platelet-derived growth factor PE R-Phycoerythrin
PERK PKR-like endoplasmic reticulum kinase
PerCP Peridinin-Chlorophyll PI3K Phosphoinositid-3-Kinase PIC prä-Initiationskomplex PKC Proteinkinase C aPKC atypische PKC cPKC klassische PKC nPKC neue PKC
PKR dsRNA-aktivierte Proteinkinase R PKR-I PKR-Inhibitor
PMA Phorbol-12-myristat-13-acetat poly(I:C) polyinosinic:polycytidylic acid PP2A Proteinphosphatase 2A
PU.1 purine-rich box 1-Transkriptions- faktor
P/S Penicillin/Streptomycin RARA retinoic acid receptor α Rb retinoblastoma protein RBM4 RNA binding motif protein 4 RBMX RNA binding motif protein, X chro-
mosome (hnRNP G) RNA ribonucleic acid rpm rounds per minute,
Umdrehungen pro Minute rpS6 ribosomales Protein S6 RSK p90-rpS6-Kinase RSK-I RSK-Inhibitor RT Raumtemperatur
RT-q-PCR reverse transcriptase, quantitative PCR
S6K p70-rpS6-Kinase SD Standardabweichung SDS Natriumdodezylsulfat SEM Standardfehler
SHC Src homology 2 domain containing- transforming protein
Abkürzungsverzeichnis
Seite | XI Kürzel Bedeutung
siRNA small interfering RNA SOC super optimal broth (SOB)
-Medium mit 20 nM Glucose SOS1 son of sevenless homolog 1 Sp1 specificity protein 1
STAT signal transducers and activators of transcription
TH T-Helferzelle
TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer TBS Tris-buffered saline TC ternärer Komplex
TEMED N,N,N′,N′-Tetramethylethan-1,2- diamin
TGF transforming growth factor TNF Tumornekrosefaktor Tris Tris(hydroxymethyl)-amino-
methan TLR toll-like receptor
TSC tuberous sclerosis complex
Kürzel Bedeutung
UDG Uracil-DNA-Glykosidase uORF upstream ORF
UTR untranslated gene region VitD3 1α,25-Dihydroxyvitamin D3
VDR Vitamin-D-Rezeptor
WT Wildtyp
ZIS-2 zinc-finger, splicing 2 ZK Zellkultur
ZRANB2 zinc finger Ran binding domain- containing protein 2
zsgf zusammengefasst β2M β2-Mikroglobulin
Δ delta, Deletion eines DNA/RNA- Sequenzabschnitts
Seite | XII
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abb. Titel Seite
1.1 Die Hämatopoese im Überblick. 112
1.2 Aufbau der humanen C/EBPβ-mRNA und -Proteinisoformen. 113 1.3 Hauptsignalwege der Zelle und ihre Bedeutung für die C/EBPβ-Synthese. 119
3.1 Erzeugung von mMΦ aus primären mBMdCs. 153
3.2 Differenzierung primärer mBMdCs zu mMΦ ‒ durchflusszytometrische Analyse. 154 3.3 Die mLAP*/LAP-Proteinmengen nehmen während der monozytären Differenzierung 155
von mMΦ aus mBMdCs zu.
3.4 Prä-monozytäre THP-1-Zellen entwickeln unter dem Einfluss von PMA einen MΦ- 156 ähnlichen Phänotyp.
3.5 Einfluss von PMA auf die C/EBPβ-LAP*/LAP-Proteinmengen in verschiedenen 157 Zelllinien.
3.6 Die C/EBPβ-mRNA-Menge erhöht sich in PMA-differenzierten THP-1-Zellen nur 158 leicht.
3.7 Berechnete, optimale 2D-Struktur der C/EBPβ-mRNA. 161
3.8 Übersicht der C/EBPβ-UTR-Deletionsvarianten. 162
3.9 Übersicht über die mRNA-2D-Strukturen der C/EBPβ-Varianten mit Fokus auf die 163 mRNA-Enden.
3.10 Die C/EBPβ-UTRs hemmen die exogene C/EBPβ-Proteinsynthese in HeLa-Zellen. 164 3.11 Die C/EBPβ-UTRs hemmen die exogene C/EBPβ-Proteinsynthese in HeLa-Zellen 165
– Densitometrische Auswertung.
3.12 Die C/EBPβ-UTRs hemmen die exogene C/EBPβ-Proteinsynthese in THP-1-Zellen. 166 3.13 Die C/EBPβ-UTRs hemmen die exogene C/EBPβ-Proteinsynthese in THP-1-Zellen 167
– Densitometrische Auswertung.
3.14 eIF4B wird in PMA-behandelten prä-monozytären Zellen PKR-abhängig induziert 169 und aktiviert.
3.15 PKR ist an der LAP*/LAP-Proteinzunahme unter differenzierenden Bedingungen 170 beteiligt.
3.16 In PMA-stimulierten THP-1-Zellen wird PKR induziert und aktiviert. 171 3.17 eIF2α wird in PMA-stimulierten THP-1-Zellen nicht beeinflusst. 172 3.18 PKR induziert in PMA-stimulierten THP-1-Zellen seine eigene Proteinexpression, 173
beeinflusst aber nicht eIF2α.
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Seite | XIII
Abb. Titel Seite
3.19 PKR induziert in PMA-differenzierten MM-6-Zellen seine eigene Proteinexpression, 174 beeinflusst aber nicht eIF2α.
3.20 PKR fördert die Aktivität des MAPK1/2-Signalwegs in PMA-stimulierten THP-1-Zellen. 175 3.21 Die Effektorkinase RSK des MAPK1/2-Signalwegs ist an der Aktivierung von PKR in 176
PMA-stimulierten THP-1-Zellen beteiligt.
3.22 Die LAP*/LAP-Proteinstabilität ist in PMA-stimulierten MM-6-Zellen erhöht. 179 3.23 Die LAP*/LAP-Proteinstabilität ist in PMA-stimulierten MM-6-Zellen erhöht 180
– Densitometrische Auswertung.
3.24 PKR ist in PMA-prä-stimulierten THP-1-Zellen an der Stabilisierung von LAP*/LAP 181 beteiligt.
3.25 PKR ist in PMA-prä-stimulierten THP-1-Zellen an der Stabilisierung von LAP*/LAP 182 Beteiligt – Densitometrische Auswertung.
3.26 Die chymotrypsinähnliche Aktivität des Proteasoms ist in differenzierten THP-1- 183 Zellen PKR-abhängig reduziert.
3.27 In differenzierten THP-1-Zellen wird die Calpainaktivität von PKR beeinflusst. 184
4.1 PKR fördert im monozytären Differenzierungsmodell die LAP*/LAP-Synthese. 194 4.2 PKR erhöht die LAP*/LAP-Proteinstabilität durch Hemmung zellulärer proteolytischer 198
Systeme
4.3 PKR ist im Monopoesemodell aktiviert, beeinflusst aber nicht eIF2α– möglicher 101 Regulationsmechanismus.
4.4 Während der Monopoese reguliert PKR sowohl die Synthese als auch die Stabilität 104 von C/EBPβ-Protein.
Seite | XIV Tabellenverzeichnis
Tab. Titel Seite
2.1 Übersicht über verwendete Geräte und Materialien. 126
2.2 Übersicht über verwendete Plasmide. 130
2.3 Übersicht über verwendete Oligonukleotide. 130
2.4 Übersicht über verwendete Antikörper. 131
2.5 Übersicht über verwendete Zelllinien. 133
2.6 Übersicht über verwendete Medienzusätze. 134
2.7 Übersicht über verwendete Inhibitoren. 135
2.8 Übersicht über die Absorptions- und Emissionsmaxima der verwendeten 137 Fluoreszenzfarbstoffe.
2.9 Übersicht über verwendete Software. 151
3.1 Differenzierung primärer mBMdCs zu mMΦ ‒ Übersicht der Durchflusszytometrie. 155 3.2 Übersicht über mögliche Bindungspartner der C/EBPβ-3’UTR+7+206-Sequenz inklusive 170
ihrer Bindemotive.
Einleitung
Seite | 1
1 Einleitung
1.1 Die Hämatopoese
Der Begriff Hämatopoese umschreibt einen biologischen Prozess, bei dem aus einer pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle eine Blutzelle mit distinkten Eigenschaften und Aufgaben entsteht (Michl 2011). Obwohl die Hämatopoese schon seit vielen Jahren Forschungsgegenstand ist, sind die zugrunde liegenden Mechanismen noch nicht zur Gänze geklärt. Eine umfassende Kenntnis über die Blutbildung in Säugern (im Speziellen beim Menschen) stellt aber die Grundlage für das Verständnis der malignen Erkrankungen dar, die mit ihr assoziiert sind: Leukämien. Neue Erkenntnisse helfen dabei, Therapiestrategien gegen solche schweren und oft tödlich verlaufenden Krankheiten zu erarbeiten.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Regulation des monozytären Zweiges der Hämatopoese, die als Monopoese bezeichnet wird. Der Fokus wird dabei auf Untersuchungen zur Regulation des Transkriptionsfaktors CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) -β gelegt, der wichtige Aufgaben während der Monopoese übernimmt.
1.1.1 Die Hämatopoese und das Immunsystem
Bei der Hämatopoese entstehen aus einer multipotenten hämatopoetischen Stammzelle eine Vielzahl an Blutzellen, welche in zwei „Äste“ unterteilt werden: den lymphatischen und den myeloischen Ast (Abb. 1.1). Während der Lymphopoese entwickeln sich aus lymphoiden Vorläuferzellen im Knochenmark und im lymphatischen Gewebe natürliche Killer (NK) -zellen, zytotoxische T-Zellen und antikörperproduzierende B-Zellen. Bei der Myelopoese werden im roten Knochenmark verschiedene kolonienformende Einheiten (CFU) gebildet, die eine Vielzahl weiterer Blutzellen hervorbringen: Erythrozyten (BFU-E/CFU-E, Erythropoese), Megakaryozyten und Thrombo- zyten/Blutplättchen (CFU-mega; Megakaryopoese), Mastzellen (CFU-Mast), basophile Granulozyten (CFU-Bas), eosinophile Granulozyten (CFU-Eo) sowie neutrophile Granulozyten (Granulopoese) und Monozyten (CFU-GM; Abb. 1.1; zusammengefasst [zsgf.] in Lodish et al. 2003). Letztere können unter bestimmten Voraussetzungen zu Makrophagen (MΦ) ausdifferenzieren (Abb. 1.1 und Abschnitt 1.1.2). Dendritische Zellen (DC) stellen einen weiteren Zelltyp dar. Sie gehen je nach Subtyp aus B- und T-Zellprogenitoren oder aus Monozyten hervor (zsgf. in Auffray et al. 2009).
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Seite | 3 Bakterien bzw. Viren binden. Der Art opsonierte Pathogene werden rückwirkend besser durch MΦ erkannt und phagozytiert. Ein ähnlicher Opsonierungsmechanismus wird zudem durch das Komplement-System bereitgestellt (Parkin & Cohen 2001).
Damit eine Immunreaktion nicht „überschießt“ bzw. nach Beseitigung der Pathogene herunter reguliert werden kann, produzieren Monozyten das Interleukin (IL) -10. Dieses wirkt für beide Teile des Immunsystems hemmend (Grütz 2005).
1.1.2 Die Monopoese
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich übergeordnet mit der Regulation der terminalen monozytären Entwicklung. In den vergangenen Jahren hat das Wissen über diesen Differenzierungsprozess stark zugenommen. Die wichtigsten Aspekte sind Gegenstand dieses Abschnitts.
Monozyten werden dem angeborenen Teil des Immunsystems zugeordnet und bilden mit 2 bis 6 % eine eher kleine Fraktion der Leukozyten (Michl 2011, Murphy et al. 2014). Ihre Entwicklung aus myeloiden Stammzellen erfolgt über mehrere Zwischenstufen und wird als Monopoese bezeichnet (Huber et al. 2014; siehe Abb. 1.1). Werden myeloide Stammzellen z. B. durch die Wachstums- faktoren granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), macrophage CSF (M-CSF) und multi-CSF/IL-3 stimuliert, entstehen Monoblasten (Barreda et al. 2004), Prä-Monozyten und letztlich reife Monozyten (Auffray et al. 2009, Huber et al. 2014). Neben der unter physiologischen Bedingungen ablaufenden Monopoese kann diese auch durch eine Reihe chemischer Stimuli eingeleitet und vorangetrieben werden. Auf die induzierte Monopoese wird an späterer Stelle näher eingegangen (siehe Abschnitt 1.3.2).
Die Monopoese wird durch mehrere Signalwege reguliert: (1) Die Reaktionen, die in der Zelle durch GM-CSF und M-CSF ausgelöst werden, sind sehr ähnlich. Binden die Faktoren an ihren jeweiligen membranständigen Rezeptor (GM-CSF-Rezeptor/cluster of differentiation [CD] -116, bzw. M-CSF- Rezeptor/CD115), führt dies zur Aktivierung der rezeptorassoziierten Tyrosinkinase c-SRC (cellular sarcoma protein; Gomez-Cambronero et al. 2003, Hercus et al. 2009, Wang et al. 2012). Von dieser ausgehend wird über mehrere Zwischenschritte die Aktivität des mammalian target of rapamycin (mTOR) gesteuert, das nachfolgend die allgemeine Proteinbiosynthese und ebenfalls die Produktion zahlreicher Transkriptionsfaktoren reguliert. Dadurch beeinflusst mTOR Überleben, Wachstum, Proliferation und Motilität einer Zelle (zsgf. in Hay & Sonenberg 2004). Es wurde zudem gezeigt, dass der PI3K-PKB-mTOR-S6K-Signalweg auch die Monopoese regulieren kann (Laplante & Sabatini 2009;
siehe Abschnitt 1.6.1).
Seite | 4 (2) Die aktivierten GM-/M-CSF-Rezeptoren können neben dem PI3K-AKT-mTOR-S6K-Signalweg auch verschiedene mitogenaktivierte Protein (MAP) -kinase (MAPK) -abhängige Signalwege regulieren (Jaworowski et al. 1999). Über deren Effektorkinasen regulieren sie die Expression von Genen, die im Allgemeinen an der Proliferation, der Mitose, dem Überleben bzw. der Apoptose (Gaestel 2006) und im Speziellen an der Koordination der Monopoese beteiligt sind (Miranda et al. 2002). Auf die MAPK- Kaskaden wird an späterer Stelle genauer eingegangen (Abschnitt 1.6.2).
(3) Die Differenzierung von Monoblasten zu Monozyten wird auch durch IL-6 vorangetrieben. Bindet IL-6 an seinen Rezeptor (bestehend aus dem Haupt-IL-6-Rezeptormolekül sowie dem ihm assozi- ierten Glykoprotein 130; Hibi et al. 1990, Yamasaki et al. 1988) werden die rezeptorassoziierten Janus-Kinasen (JAK) sowie die nachgeschalteten signal transducers and activators of transcription (STATs) aktiviert (Kishimoto 2010). Der induzierte JAK-STAT-Signalweg reguliert über die Transkriptionsfaktoren STAT1 und 3 das Zellwachstum, die Proliferation, die myelo-monozytäre Differenzierung sowie den Verlauf der Immunreaktion (Hirano et al. 2000, Huber et al. 2014). Der aktivierte IL-6-Rezeptor kann zudem über Querverbindungen den mTOR-Signalweg sowie die MAPK- Kaskade positiv beeinflussen (Heinrich et al. 2003).
Die angeführten Signalwege regulieren die Expression und Aktivität differenzierungsassoziierter Transkriptionsfaktoren. Wichtige Vertreter (in Bezug auf die Monopoese) sind Purine-rich box 1 (PU.1), STAT1 und 3, c-Jun und JunB sowie verschiedene Mitglieder der interferonregulatorische Faktor (IRF)- und der C/EBP-Familie (zsgf. in Huber et al. 2014). Der letztgenannten Familie gehört C/EBPβ an. Auf diesen Transkriptionsfaktor wird wegen seiner zentralen Bedeutung für die vorliegende Arbeit an späterer Stelle genauer eingegangen (Abschnitt 1.4.2).
Mit fortschreitender Monopoese verändert sich die Zusammensetzung der Oberflächenproteine auf der differenzierenden Zelle (Auffray et al. 2009). Die Untersuchung dieser Zelloberflächenmoleküle ist daher für die Beurteilung des Differenzierungsstatus sehr nützlich. In einer durchflusszyto- metrischen Analyse wird bei humanen Proben klassischerweise die Ausprägung von CD14 untersucht, welche mit zunehmender Reife ansteigt (van Lochem et al. 2004). Bei CD14 handelt es sich um einen Lipopolysaccharid (LPS) -rezeptor, der bakterielle Fettsäuren und Peptidoglykane bindet und vornehmlich von Monozyten und MΦ gebildet wird (Ziegler-Heitbrock & Ulevitch 1993).
Zusätzlich wird häufig die Ausprägung des low affinity Fc-Rezeptors CD16/FcγR-III gemessen (Peltz et al. 1989), der von Monozyten unterschiedlich stark exprimiert wird. So ergeben sich drei Unter- gruppen: klassische (CD14++CD16‒), intermediäre (CD14+CD16+) und nicht-klassische Monozyten (CD14dimCD16+), die sich in ihrem Wirkungsspektrum zum Teil deutlich unterscheiden (Auffray et al.
2009, De Kleer et al. 2014).
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Seite | 5 Anders als beim Menschen exprimieren murine (m-) Monozyten und MΦ wenig CD14 (Lai et al.
1998). Zudem wird dieses auch von murinen Granulozyten und mDCs exprimiert, sodass die Identifizierung von Zellen der monozytären Reihe im murinen System über andere Marker erfolgen muss: mCD11b und Lymphozytenantigen (Ly) -6C (Lai et al. 1998, Lauvau et al. 2014). Diese werden neben Monozyten und mMΦ zwar auch von DCs und NK-Zellen (mCD11b) bzw. von T-Zellen, NK- Zellen und dem Endothel (Ly-6C) produziert, können aber dennoch gut als Marker bei ex vivo- Differenzierungsexperimenten verwendet werden (Auffray et al. 2009). Stimuliert man aus dem Knochenmark isolierte Zellen (bone marrow derived cells, BMdCs) mit mM-CSF, entwickeln sich die Zellen gerichtet zu Monozyten/mMΦ (Pierce et al. 1990). Weil nicht gänzlich ausgeschlossen werden kann, dass dabei auch einige Granulozyten entstehen, wird zusätzlich ein negativ-Selektionsmarker benötigt: z. B. mCD11c und Ly-6G/Gr-1. mCD11c wird neben Granulozyten auch von murinen T-Zellen, DCs, NK-Zellen und Stammzellen exprimiert, wohingegen Ly-6G ausschließlich auf Granulozyten zu finden ist. Maus-Monozyten/MΦ sind folglich mCD11b++/mCD11c‒/Ly-6G‒ (Auffray et al. 2009, Fleming et al. 1993, Lai et al. 1998).
1.2 Die Bedeutung und die Funktion von Monozyten und MΦ
Monozyten machen nur einen sehr kleinen Anteil an den gesamten Blutzellen aus. Da sie jedoch frei im Blut zirkulieren, sind sie potentiell in der Lage an jede Stelle des Organismus zu gelangen. Mit ihrer Fähigkeit, die Blutbahn durch Migration ins Gewebe zu verlassen, erweitern sie ihren Wirkungsradius zusätzlich (Murphy et al. 2014). Sie exprimieren verschiedene Oberflächen- rezeptoren, wie z. B. CD14, den Chemokin (C-C-Motiv) -Rezeptor 2 (CCR2) /CD192, die toll-like Rezeptoren (TLR) 2 und 4 sowie scavenger-Rezeptoren (Auffray et al. 2009). Über letztgenannte können die Monozyten unterschiedliche Pathogenitätsfaktoren erkennen, bspw. LPS (via TLR4; Rock et al. 1998), Peptidoglykane (via TLR2; Takeuchi & Akira 2001) und low density-Lipoproteine (LDL; via scavenger-Rezeptoren; Zani et al. 2015). Durch eine solche Interaktion wird der Monozyt aktiviert: Er bildet und sezerniert verstärkt die Zytokine IL-1β, IL-6 und Tumornekrosefaktor (TNF; Suzuki et al.
2000), er produziert Peroxide sowie Superoxide (oxidativer/respiratorischer burst; Levy & Malech 1991, Turpin et al. 1986) und verstärkt seine Phagozytoserate (Grage-Griebenow et al. 2001). Des Weiteren wird seine Differenzierung zum MΦ angeregt. Man bezeichnet die entstehenden MΦ auch als M1- bzw. Killer-MΦ (Chávez-Galán et al. 2015). Sie werden durch LPS und Interferon (IFN) -γ weiter aktiviert und zeichnen sich durch eine hohe Phagozytoserate sowie eine reduzierte IL-10-, aber verstärkte IL-12-Produktion aus (Chávez-Galán et al. 2015). IL-12 fördert die Immunreaktion, indem es T-Helfer (TH) -1-Zellen stimuliert (Hsieh et al. 1993), wohingegen IL-10 durch Hemmung der MΦ-Aktivität einem Überschießen der Immunantwort entgegenwirkt (Vieira et al. 1991). An anderer
Seite | 6 Stelle wurde beschrieben, dass LPS-stimulierte humane Monozyten zunächst verstärkt IL-10 sezernieren. Durch einen autokrinen Wirkmechanismus wird dann allerdings die immunologische Aktivität dieser Zellen reduziert (de Waal Malefyt et al. 1991), was die Funktion von IL-10 als Hemmer der Immunreaktion stützt.
Neben den M1-MΦ gibt es auch gewebsständige M2-MΦ (sog. Reparatur-MΦ), die sich durch spezialisierte Aufgaben auszeichnen. Einige Beispiele für M2-MΦ sind Kupffer-Sternzellen (Leber), Alveolar-MΦ (Lunge), Sinus-Histiozyten (Lymphknoten), Langerhans-Zellen (Haut), Osteoklasten (Knochen) und die Mikroglia im Gehirn (Gordon & Taylor 2005, Huber et al. 2014). Die Zellen sind beteiligt an der Wundheilung, der Gewebsreparatur, der Beseitigung abgestorbener Körperzellen sowie der Dämpfung einer Immunreaktion, welche durch die Produktion von IL-10 und transforming growth factor (TGF) -β vermittelt wird (TGF-β hat eine anti-inflammatorische Wirkung auf TH1-Zellen;
Li & Flavell 2008).
Monozyten und MΦ zählen neben DCs zu den antigenpräsentierenden Zellen. Das bedeutet, sie prozessieren phagozytierte Pathogene im Immunoproteasom und präsentieren die erzeugten Peptide den Zellen des adaptiven Immunsystems (B- und TH-Zellen) über ihre HLA II-Komplexe, wodurch diese Zellen aktiviert werden. Als antigenpräsentierende Zellen bilden Monozyten und MΦ ein sehr wichtiges Bindeglied zwischen dem angeborenen und dem adaptiven Immunsystem (zsgf. in Murphy et al. 2014).
1.3 Die Monopoese im Modell
Eine von primärem Spendermaterial ausgehende Untersuchung der Monopoese ist relativ schwierig.
Zum einen ist die Gewinnung von Versuchsmaterial (BMdCs, primäre Monozyten) aufwendig, zum anderen können die erhaltenen Ergebnisse aus den ex vivo-Differenzierungsexperimenten aufgrund der biologischen Varianz zwischen mehreren Spendern deutlich schwanken (Chanput et al. 2014).
Um dieser Probleme Herr zu werden und einheitliche Versuchsbedingungen zu schaffen, wurden seit Ende der 1970er Jahre mehrere myelo-monozytäre Zelllinien etabliert, die im Folgenden vorgestellt werden sollen.
1.3.1 Zelluläre Modelle
1977 wurden aus dem Blut eines an akuter promyelozytischer Leukämie (eine Variante der akuten myeloischen Leukämie, AML) erkrankten Patienten Zellen isoliert und kultiviert. Aus diesen ging die humane myeloide Zelllinie HL-60 hervor (Collins et al. 1977). Die Zellen befinden sich in einem frühen Stadium der granulo-/monozytären Linie, weisen aber schon Merkmale von Granulozyten auf
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Seite | 7 (Gallagher et al. 1979). Durch geeignete Stimulation können sie zu Zellen mit granulozyten- (neutrophile und eosinophile; all-trans-Retinsäure, ATRA) bzw. monozyten-/MΦ-Eigenschaften (Phorbol-12-myristat-13-acetat, PMA; im Besonderen 1α,25-Dihydroxyvitamin D3, VitD3)differenziert werden (Collins et al. 1977, Friedman 2007).
Einer etwas späteren monozytären Entwicklungsstufe gehört die Monoblasten-ähnliche Zielllinie U-937 an. Sie wurde aus Gewebeproben eines an histiozytischem Lymphom erkrankten Patienten isoliert (Sundström & Nilsson 1976). Die Zellen lassen sich (ebenso wie HL-60-Zellen) zu neutrophilen granulozytenähnlichen (Laskin et al. 1990) bzw. monozyten/MΦ-ähnlichen Zellen ausdifferenzieren (Nilsson et al. 1980).
Für die Erforschung der monozytären Entwicklung stellt allerdings THP-1 die weitaus bedeutendere Zelllinie dar. Sie wurde 1979 aus einer Blutprobe isoliert (akute monozytäre Leukämie, eine Form der AML) und charakterisiert: Es handelt sich um runde, prä-monozytäre Suspensionszellen, die eine Teilungsrate von etwa 35 h aufweisen. Sie exprimieren HLA-A2, -A9, -B5, -DRw1 und -DRw2 (Tsuchiya et al. 1980) wie auch mehrere monozytentypische Membranantigene. Dazu gehören CD4, CD30, die Fc-Rezeptoren (FcR) -1 und -2, der TNF-Rezeptor sowie der GM-CSF-Rezeptor (Auwerx 1991, Byrne 1989, Fleit & Kobasiuk 1991). Für THP-1-Zellen wurden verschiedene monozytäre Eigenschaften nachgewiesen. Dazu zählen Phagozytose, α-Naphtylbutyratesteraseaktivität, die Sekretion von Lysozym, TNF, Apolipoprotein E (ApoE) und dem monozytenchemotaktischen Protein (MCP), sowie die Fähigkeit, die T-Zellantwort zu verstärken (Arenzana-Seisdedos et al. 1988, Matsushima et al.
1989, Tajima et al. 1985, Tsuchiya et al. 1980).
THP-1-Zellen können, ähnlich wie die bereits vorgestellten Zelllinien, durch geeignete Stimulation weiter zu Zellen mit monozyten/MΦ-eigenschaften ausdifferenziert werden. Die dafür etablierten Agenzien werden im nächsten Abschnitt näher betrachtet (Abschnitt 1.3.2).
Eine weitere prä-monozytäre Zelllinie, auf die man für Untersuchungen zur Monopoese zurück- greifen kann und mit der sich zudem Ergebnisse aus THP-1-Experimenten validieren lassen, ist Mono- Mac-6 (MM-6). Die Zellen wurden aus dem Blut eines an monoblastischer Leukämie (eine Variante der AML) erkrankten Patienten isoliert. Die Suspensionszellen wachsen mit einer Verdopplungsrate von etwa 50 h und können sich bei ihrer Kultivierung lose an den Gefäßboden heften. Sie exprimieren natriumfluoridsensitive, nicht-spezifische Esterase, erzeugen reaktive Sauerstoffspezies, sind phagozytotisch aktiver als THP-1-Zellen und tragen im Gegensatz zu THP-1- und U-937-Zellen den klassischen Monozytenmarker CD14 (Ziegler-Heitbrock et al. 1988). MM-6-Zellen exprimieren außerdem den low-affinity Rezeptor für das Immunglobulin (Ig) E (FCεRII) /CD23, der die Aktivierung und Differenzierung von B-Zellen sowie die Produktion von IgE induziert (zsgf. in Chan et al. 2010).
Weiterhin tragen sie auf ihrer Zelloberfläche geringe Mengen des M-CSF-Rezeptors, sezernieren
Seite | 8 IL-1α, IL-1β sowie TNF und können nach LPS-Stimulation IL-6 produzieren (zsgf. in Ziegler-Heitbrock et al. 1994). Auch dies sind typische Merkmale von Monozyten. Damit sind die Zellen weiter entwickelt als THP-1- bzw. U-937-Zellen und können (in gewissen Aspekten) mit reifen Monozyten verglichen werden (siehe Abb. 1.1; Ziegler-Heitbrock et al. 1988).
Neben den myelo-monozytären Zelllinien wurden auch Modelle etabliert, die hämatopetischen Stammzellen ähneln. Ein solches Modell ist die murine, mIL-3-abhängige, myeloide Progenitorzelllinie 32D (Abb. 1.1). Sie ging aus einer Langzeitkultur von mBMdCs (C3H/HeJ-Donormaus) hervor, die mit dem Friend murine leukemia virus infiziert und somit immortalisiert wurden (Greenberger et al. 1980, 1983). Die erhaltenen Suspensionszellen weisen eine Verdopplungszeit von 15 h auf (Migliaccio et al.
1989), produzieren Esterase M und tragen die Oberflächenmarker Ly1 (mCD5) sowie (mG-CSF- abhängig) mCD11b (Greenberger et al. 1983, Panopoulos et al. 2002).
32D-Zellen sind in ihrem Differenzierungspotential eingeschränkt. Es wurde gezeigt, dass sie sich zu basophilen Granulozyten und Mastzellen differenzieren lassen. Durch eine Stimulation mit mGM-CSF konnten sie auch zu einem myelozytenähnlichen Zelltyp differenziert werden, der nicht-spezifische Esterase sowie geringe Mengen Myeloperoxidase und Chloroacetatesterase exprimiert (Migliaccio et al. 1989).
Myelo-monozytäre Zelllinien können durch physiologische wie auch durch chemische Stimuli zu Zellen mit monozyten-/MΦ-eigenschaften differenziert werden. Sie eignen sich daher als monozytäre Modellsysteme. Im nächsten Abschnitt wird auf die Wirkung ausgewählter differenzierunginduzierender Substanzen eingegangen.
1.3.2 Differenzierung-induzierende Agenzien
Die Stimulation naiver myelo-monozytärer Zellen (bzw. der oben vorgestellten Zelllinien) mit Deltanoiden, Retinoiden oder Phorbolestern löst ihre Differenzierung zu Monozyten/MΦ-ähnlichen Zellen aus. Im Folgenden wird eine Auswahl dieser Stimuli vorgestellt. Dabei soll auch die Wirkungsweise des jeweiligen Agens betrachtet werden.
Die biologisch aktive Form von Vitamin D3ist 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 (VitD3, Calcitriol). Es zählt zu den Deltanoiden und ist ein hochwirksames Secosteroid (Haussler & McCain 1977a,b; Holick et al.
1971). Es bindet 100-fach stärker an den zytosolischen Vitamin-D-Rezeptor (VDR) als seine Ausgangsform. In der Zellkultur kann mittels VitD3 unter (vergleichsweise) physiologischen Bedingungen die monozytäre Differenzierung von THP-1-Zellen ausgelöst werden (Schwende et al.
1996). Diese dauert etwa 72 h und verläuft etwas „milder“ als bei einer Stimulation mit PMA (siehe unten; Daigneault et al. 2010, Schwende et al. 1996).
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Seite | 9 Der VDR zählt zu den ligandenaktivierbaren Transkriptionsfaktoren (Mangelsdorf et al. 1995) und kann als VDR-VitD3-Komplex die Synthese verschiedener, an der Differenzierung beteiligter Zielgene induzieren: So z. B. den Transkriptionsfaktor homebox protein Hox-A10. Dieser induziert die Bildung von V-Maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B (MafB), einem weiteren Trans- kriptionsfaktor (Chute et al. 2010). Beide fördern stark die Monopoese (Gemelli et al. 2008).
Darüber hinaus wurde beobachtet, dass in VitD3-behandelten Keratinozyten die rezeptorassoziierte c-SRC-Kinase aktiviert und die Komplexbildung aus Src homology 2 domain containing-transforming protein (SHC), growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) und son of sevenless homolog 1 (SOS1) induziert war (Gniadecki 1998). Dieser trimere Komplex ist für die Aktivierung des MEK-ERK-RSK (MAPK1/2)- Signalwegs entscheidend (MEK: mitogen-activated ERK kinase, ERK: extracellular-signal regulated kinase, RSK: p90-ribsomal protein S6 (rpS6) kinase; siehe Abschnitt 1.6.2). So konnte in VitD3-differenzierten THP-1-Zellen gezeigt werden, dass ein weiterer, für die monozytäre Differenzierung sehr wichtiger Transkriptionsfaktor MAPK-abhängig aktiviert ist: C/EBPβ (siehe Abschnitt 1.4.2; Marcinkowska et al. 2006, Studzinski et al. 2005).
Ein Retinoid, das die monozytäre Differenzierung von myeloiden Zelllinien (wie THP-1 und U-937) induziert, ist die all-trans-Retinsäure (ATRA; Hemmi & Breitman 1985, Nakamura et al. 1986, Olsson
& Breitman 1982, Taimi et al. 1991). Die Differenzierung von U-937-Zellen mit ATRA führte in diesen zu einer erhöhten C/EBPβ-Expression (Kim et al. 2007, Pan et al. 1999). HL-60-Zellen entwickeln sich im Gegensatz zu U-937- und THP-1-Zellen nach Behandlung mit ATRA nicht zu Monozyten, sondern zu einem granulozytenähnlichen Zelltyp (Breitman et al. 1980, Trayner et al. 1998).
Ein weit verbreitetes monozytäres Differenzierungsmodell sieht die Stimulation von THP-1-Zellen mit dem Phorbolester PMA/Tetradekanoylphorbolacetat (TPA) vor (Daigneault et al. 2010, Tsuchiya et al.
1982). Diese Substanz ist ein chemisches Analogon des physiologischen second messengers Diazylglyzerol (Castagna et al. 1982). Es bindet konstitutiv an verschiedene Proteinkinase C (PKC) -Familienmitglieder, wodurch diese sowie nachgeschaltete Signalwege aktiviert werden (Steinberg 2008). Zu diesen zählt auch der MAPK1/2-Signalweg (siehe Abschnitt 1.6.2; Mendoza et al. 2011).
Bereits eine sehr geringe PMA-Konzentration genügt, um eine starke, irreversible Reaktion in den behandelten Zellen auszulösen. In der Literatur wurden für Differenzierungsexperimente 11,1 bis 540 nM PMA erfolgreich eingesetzt (Park et al. 2007, Ziegler-Heitbrock et al. 1994). Weil die differenzierende Wirkung von PMA sehr potent ist, wurden in dieser Arbeit zu differenzierende Zellen für möglichst kurze Zeiträume mit PMA inkubiert (siehe Abschnitt 2.5.5).
Werden THP-1-Zellen mit PMA stimuliert, stellen die runden Suspensionszellen binnen 24 h ihre Proliferation ein, aggregieren, werden adhärent, flachen deutlich ab und nehmen eine makrophagen- ähnliche Morphologie an (amöboide Form mit zahlreichen Pseudopodien). Die ausdifferenzierten
Seite | 10 Zellen zeigen zudem eine gesteigerte Phagozytoserate und produzieren die klassischen Monozyten/
MΦ-Marker CD14 und CD11b (Chanput et al. 2014, Tsuchiya et al. 1982). Sie ähneln damit stark MΦ, die aus primären Monozyten hervorgegangen sind (monocyte-derived MΦ, MdMΦ). Dies ist bei PMA-behandelten HL-60- und U-937-Zellen weniger der Fall (Auwerx, 1991). Interessant ist, dass bei VitD3-stimulierten THP-1-Zellen die genannten Merkmale nicht so dominant ausgeprägt werden. Dies beruht sehr wahrscheinlich darauf, dass durch VitD3 und PMA unterschiedliche zelluläre Signalwege angesprochen werden (Daigneault et al. 2010, Schwende et al. 1996).
Naive und PMA-differenzierte THP-1-Zellen zeigen neben vielen Gemeinsamkeiten auch einige markante Unterschiede zu primären Monozyten bzw. MdMΦ. Daher wird ihre direkte Vergleichbarkeit in der Literatur kontrovers diskutiert: Eine Genexpressionsanalyse deckte einige Abweichungen zwischen naiven THP-1-Zellen und primären Monozyten auf. Die Stimulation von THP-1-Zellen mit PMA führte aber (mit wenigen Ausnahmen, z. B. IL-1β) zur Induktion der gleichen Gene wie in MdMΦs, darunter ApoE und die Matrixmetalloprotease 9 (MMP9; Kohro et al. 2004).
Aus den kleinen Abweichungen wurde gefolgert, dass es sich bei PMA-differenzierten THP-1-Zellen und MdMΦs um zwei Systeme handelt, die man nicht ohne Weiteres gleichsetzten darf, die aber gut vergleichbar sind.
Eine andere Studie ergab, dass eine LPS-induzierte Immunreaktion in sonst unbehandelten THP-1- Zellen einen vergleichbaren Satz von Genen induziert wie in MdMΦs (Sharif et al. 2007). Ein ähnliches Ergebnis wurde auch von Hijiya und Kollegen hinsichtlich der Expression verschiedener TLRs erarbeitet (Hijiya et al. 2002). Überraschend war, dass U-937-Zellen deutlich anders auf LPS reagierten als THP-1 und MdMΦs (Sharif et al. 2007). Weitere Befürworter der THP-1-Zellen im Kontext des monozytären Differenzierungsmodells sind Chanput und Kollegen. Sie verweisen auf die Vorteile der Zelllinie gegenüber primären Zellen/MdMΦs, wie z. B. eine höhere Proliferationsrate, bessere Lager- und Verfügbarkeit sowie eine geringere genetische Diversität im Vergleich zu Zellen von unterschiedlichen Spendern (Chanput et al. 2014). Es wird aber darauf hingewiesen, dass mit THP-1-Zellen erzeugte Ergebnisse in primären humanen Monozyten/MdMΦs überprüft werden sollten.
MM-6-Zellen können ebenso wie die THP-1 durch Behandlung mit PMA in Richtung MΦ ausdifferenziert werden. Dabei ist ihre Proliferationsrate ebenfalls stark reduziert und sie werden deutlich adhärent. CD33, dessen Proteinmenge während der Differenzierung von MdMΦs abnimmt, ist auch in stimulierten MM-6-Zellen reduziert (Ziegler-Heitbrock et al. 1994).
THP-1- und MM-6-Zellen sind etablierte, weit verbreitete Modelle für die Untersuchung der Monozyten- (und MΦ-) Funktion. Durch die Stimulation mit PMA kann an ihnen außerdem die terminale monozytäre Differenzierung (bis hin zu MΦ-ähnlichen Zellen) untersucht werden. Beide
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Seite | 11 Zelllinien wurden daher in dieser Arbeit verwendet, um die Regulation des Transkriptionsfaktors C/EBPβ während dieses Prozesses herauszuarbeiten.
1.4 Die C/EBP-Transkriptionsfaktoren
Die CCAAT/enhancer-binding proteins bilden eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die sechs Mitglieder umfasst, welche entsprechend ihrer Entdeckung chronologisch als C/EBPα bis -ζ bezeichnet wurden (Antonson et al. 1996, Cao et al. 1991, Hoeppner et al. 1996, Lum et al. 1990).
Alle Familienmitglieder besitzen als gemeinsames Strukturmerkmal eine C-terminal gelegene, basische Leucin-Zipper (bZIP) -Domäne (Ramji & Foka 2002). Die Sequenzidentität der bZIP-Domäne ist bei den C/EBP-Familienmitgliedern sehr hoch und beträgt über 90 % (Ramji & Foka 2002). Die Domäne ist für die DNA-Bindung sowie für Protein-Protein-Interaktionen durch Dimerisierung verantwortlich (Landschulz et al. 1988b, Vinson et al. 1989). Die C/EBP-Familienmitglieder können, wie andere bZIP-Transkriptionsfaktoren auch, Homo- und Heterodimere bilden (Landschulz et al.
1988b, Newman & Keating 2003, Vinson et al. 1993), wodurch ihre Aktivität und Sequenzspezifität beeinflusst werden kann (Tsukada et al. 2011). Für die C/EBP-Proteine wurden in diesem Zusammenhang sowohl intra- als auch interfamiliäre Paarungen beobachtet (siehe Abschnitt 1.5.3).
Neben der hochkonservierten bZIP-Domäne enthalten die C/EBP-Transkriptionsfaktoren verschiedene Transaktivierungs- und negativ-regulatorische Domänen (zsgf. in Tsukada et al. 2011).
Diese Unterschiede prägen das Wirkungsspektrum der einzelnen C/EBP-Proteine, auf die im Folgenden eingegangen werden soll.
1.4.1 Die C/EBP-Familienmitglieder in der Übersicht
Als namengebendes Mitglied der C/EBP-Familie wurde 1986 ein Protein identifiziert, das mit der DNA-Sequenz 5‘-CCAAT-3‘ interagierte: C/EBPα (Friedman et al. 1989, Graves et al. 1986, Landschulz et al. 1988a). Von C/EBPα wurden zwei Proteinisoformen mit antagonistischen Eigenschaften nachgewiesen: C/EBPα-p42 und -p30 (Lin et al. 1993). So ist C/EBPα-p42 am Proliferationsarrest während der Differenzierung zahlreicher Zelltypen beteiligt, wie z. B. bei myeloiden Progenitoren, Adipozyten, Hepatozyten sowie bei Lungen- und Plazentazellen (zsgf. in Lekstrom-Himes &
Xanthopoulos 1998). C/EBPα-p30, dem N-terminale Transaktivierungsdomänen fehlen (Ossipow et al. 1993), fördert hingegen die Proliferation (Lin et al. 1993). Das Verhältnis beider Isoformen zueinander wird in einem p42/p30-Quotienten ausgedrückt und kann sich entsprechend zellulärer Voraussetzungen (z. B. während der Differenzierung) ändern. Die Isoform, die verstärkt gebildet wird, setzt sich funktional durch (Lin et al. 1993). Außerdem ist C/EBPα wichtig für die frühe myeloide
Seite | 12 Entwicklung, indem es die Bildung von CFU-GMs aus myeloiden Progenitoren beeinflusst (Heath et al. 2004).
C/EBPα weist viele funktionale Redundanzen zu C/EBPβ auf, da beide die Konsensus-Sequenz T(T/G)NNGNAA(T/G) (N, beliebiges Nukleotid) in den Promotoren verschiedener Zielgene erkennen (Akira et al. 1990). Aufgrund seiner zentralen Bedeutung für die vorliegende Arbeit wird C/EBPβ gesondert betrachtet (siehe Abschnitt 1.4.2).
Von C/EBPδ ist bekannt, dass es zusammen mit C/EBPβ Gene der Immun- und Entzündungsreaktion reguliert (Lu et al. 2009) und die Differenzierung von Adipozyten beeinflusst (Tanaka et al. 1997). Es scheint zudem an der Aktivierung und Differenzierung von MΦ beteiligt zu sein (Hsiao et al. 2013, Ko et al. 2015, Liu et al. 2006).
C/EBPε stellt ein C/EBPδ-Paralog dar (Antonson et al. 1996, Chumakov et al. 1997). Es wird überwiegend in Zellen (und Zelllinien, darunter auch THP-1) der myelo-monozytären Reihe exprimiert (Morosetti et al. 1997), wo es unter anderem an der terminalen Differenzierung und der funktionalen Reifung von Granulozyten beteiligt ist (Yamanaka et al. 1997).
Neben den aktivierenden C/EBP-Proteinen gibt es auch trans-dominant negative Regulatoren:
C/EBP-γ/immunoglobulin enhancer-binding protein 1 (Ig/EBP-1; Roman et al. 1990) und C/EBP-ζ/ C/EBP homologous protein 10 (CHOP-10; murines Ortholog: mouse CCAAT binding factor, mCBF;
Cooper et al. 1995, Fornace Jr et al. 1989, Hoeppner et al. 1996, Lum et al. 1990, Ron & Habener 1992). So bindet zwar C/EBP-γ zusammen mit einem aktivierenden C/EBP-Familienmitglied im Promotor eines Zielgens, jedoch wird dieses nicht synthetisiert, weil C/EBP-γ keine für die Transkription erforderlichen Transaktivierungsdomänen besitzt (Cooper et al. 1995). Ist hingegen C/EBPζ der Heterodimerisierungspartner, kann der entstandene Komplex nicht im Promotor des potentiellen Zielgens binden wodurch dieses nicht transkribiert wird (Ron & Habener 1992).
1.4.2 Der Transkriptionsfaktor C/EBPβ
Der Transkriptionsfaktor C/EBPβ wurde im Jahr 1990 als ein bZIP-enthaltendes Protein mit starker C-terminaler Homologie zu C/EBPα identifiziert, das an das IL-1-Element im IL-6-Promotor gebunden war. Daher wurde es zunächst als nuclear factor for IL-6 (nukleärer Faktor für IL-6, NF-IL6) bezeichnet (Akira et al. 1990). Neben Leber-, Lungen-, Milz-, Nieren- und weiteren Gewebe- bzw. Zelltypen, wurde C/EBPβ-Protein in großen Mengen auch in myelo-monozytären Zellen, besonders in Monozyten und ausdifferenzierten MΦ nachgewiesen (Gutsch et al. 2011, Haas et al. 2010, Katz et al. 1993, Williams et al. 1991).
Bei der Transkription des CEBPB-Locus wird eine 1837 Basen-lange C/EBPβ-mRNA gebildet. Diese umfasst eine 5‘-untranslatierte Region (UTR; 195 Basen), die kodierende Sequenz (coding sequence,
Seite | 14 Bindedomäne der bZIP, so sind LAP*/LAP inaktiv (Williams et al. 1995). Weiterhin wird die Aktivität von LAP*/LAP durch LIP reguliert: Dimerisiert LIP (das keine Transaktivierungsdomänen besitzt) mit einer der großen Isoformen, unterdrückt es ihre aktivierenden Eigenschaften. LIP fungiert somit ähnlich wie C/EBPα-p30, -γ und -ζ als dominant-negativer Regulator (Descombes & Schibler 1991).
Die Hauptfunktionen von LAP*/LAP und LIP unterscheiden sich deutlich voneinander: LAP*/LAP induzieren Differenzierungsprozesse in verschiedenen Zelltypen und hemmen zugleich die Proliferation. Als Antagonist wirkt LIP proliferationsfördernd und verhindert zugleich die Differenzierung (Calkhoven et al. 2000, Gutsch et al. 2011). Je nach LAP/LIP-Verhältnis, das in der Zelle vorliegt, kommt die Funktion von LAP*/LAP bzw. von LIP zur Geltung (Descombes & Schibler 1991, Haas et al. 2010).
Die genannten funktionalen Unterschiede der C/EBPβ-Isoformen sind in den verschiedenen Entwicklungsstadien von großer Bedeutung. In proliferierenden myelo-monozytären Progenitorzellen findet man viel LIP, aber wenig LAP*/LAP. Das LAP/LIP-Verhältnis liegt in diesen Zellen deutlich auf der Seite von LIP. Je weiter die Monopoese fortschreitet, desto mehr verschiebt sich das LAP/LIP- Verhältnis zugunsten der differenzierungsfördernden Isoformen LAP*/LAP, was die Expansion der Vorläuferzellen in diesen Entwicklungsstadien unterdrückt. Dabei verringert sich der LIP-Anteil zusehends und die Proteinmengen von LAP*/LAP nehmen deutlich zu. Die LAP*/LAP-Proteinlevel erreichen im reifen Monozyten ihr Maximum und nehmen im finalen Differenzierungsschritt (der MΦ-Bildung) nicht weiter zu (Gutsch et al. 2011, Huber et al. 2012). Die Aktivität von LAP*/LAP wird hier überwiegend durch posttranslationale Modifikationen reguliert (siehe Abschnitt 1.5.3).
Die Bedeutung von C/EBPβ für die Monopoese beruht zum einen auf einen genexpressions- unabhängigen Mechanismus, nämlich einer regulatorischen Protein-Protein-Interaktion, wie sie z. B.
mit dem retinoblastoma protein Rb beobachtet wurde, wodurch dieses in einem hypo- phosphorylierten Zustand gehalten wird, was mit einer verminderten Proliferationsrate einhergeht (Gutsch et al. 2011), zum anderen induziert C/EBPβ als Transkriptionsfaktor die Synthese verschiedener Gene, was als die Hauptfunktion angesehen werden kann. So wurden C/EBPβ- Bindemotive in den Promotoren zahlreicher Gene identifiziert, die an der Hämatopoese (im Besonderen an der Monopoese), der Akut-Phase-Antwort sowie der Entzündungsreaktion beteiligt sind: C-reaktives Protein, verschiedene Zytokine (u. a. TNF, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, G-CSF, die MΦ- inflammatorischen Proteine [MIP] 1α und 1β) sowie die Rezeptoren für G-CSF, GM-CSF und M-CSF (zsgf. in Tsukada et al. 2011). Viele dieser Gene werden auch von anderen Transkriptionsfaktoren angesteuert, allerdings können sie einen Verlust der C/EBPβ-Aktivität nicht vollständig kompensieren, was in C/EBPβ-knock out (C/EBPβko) -Modellen gezeigt wurde: (1) So sind C/EBPβ- defiziente Mäuse sehr empfänglich für Listeria monocytogenes. C/EBPβko-mMΦ dieser Mäuse können die Bakterien zwar phagozytieren, wegen einer mangelhaften Aktivierung aber nicht
Einleitung
Seite | 15 unschädlich machen (Tanaka et al. 1995). (2) Davon unabhängig erzeugte C/EBPβko-Mäuse weisen profunde Störungen der humoralen, angeborenen und zellulären Immunreaktion auf. Sie sind sehr empfänglich für den pathogenen Hefepilz Candida albicans (Screpanti et al. 1995). (3) Von letzteren Mäusen wurden immortalisierte C/EBPβko-mMΦ erzeugt. Die Stimulation dieser Zellen mit IFN-γ bzw.
LPS führte zu einer (mitunter) sehr veränderten Zytokinexpression im Vergleich zur WT-Kontrolle (Gorgoni et al. 2002). Aus diesen und weiteren Untersuchungen geht hervor, dass C/EBPβ im Besonderen für die terminale Monopoese und die vollständige (M2)-MΦ-Funktion wichtig ist (Ruffell et al. 2009).
1.5 Die Regulation der C/EBPβ-Expression und -Funktion
C/EBPβ ist an der Steuerung fein abgestimmter Differenzierungsprozesse (wie z. B. der Monopoese) und an der Immunreaktion beteiligt. Der Transkriptionsfaktor darf daher nicht permanent aktiv sein und unterliegt einer vielschichtigen Regulation: Diese betrifft (1) seine Transkription, (2) die Stabilität und den Transport der mRNA, (3) die alternative Translation der drei Proteinisoformen, (4) die Protein-Protein-Interaktionen (bspw. mit anderen Transkriptionsfaktoren), (5) die post-translationale Modifikationen an den Proteinen und nicht zuletzt (6) den proteolytischen Abbau (d. h. die C/EBPβ- Proteinstabilität). Entzieht sich C/EBPβ der strikten Regulation, kann die betreffende Zelle entarten.
So wurde bspw. beschrieben, dass C/EBPβ in Brustkrebszellen dysreguliert ist und die proliferations- fördernde Isoform LIP überexprimiert wird (Raught et al. 1996, Zahnow et al. 1997). Kürzlich veröffentlichte Untersuchungen an C/EBPβ-LIP knock in-Mäusen, die nur LIP (aber weder LAP* noch LAP) bilden können, haben außerdem gezeigt, dass diese Mäuse in etlichen Gewebe- und Zelltypen anfällig für Tumorbildung sind (Bégay et al. 2015, zsgf. in Luft 2015). In diesem Zusammenhang wurde seine Rolle als Protoonkogen diskutiert. Andere Veröffentlichungen bringen veränderte LAP*/LAP-Expressionsmuster mit verschiedenen Tumorarten in Verbindung: Chronische myeloische Leukämie (CML; LAP*/LAP-Level stark reduziert; Guerzoni et al. 2006), Prostata-Karzinom (LAP*/LAP ebenfalls reduziert; Barakat et al. 2015), Kolorektal-Karzinom (LAP-Menge erhöht; Rask et al. 2000), und weitere (Haas et al. 2010, Sundfeldt et al. 1999).
Für die Homöostase (und die Gesundheit) einer Zelle bzw. eines Organismus ist es daher von großer Bedeutung, dass die Expression von CEBPB korrekt reguliert wird. Die zugrundeliegenden (bekannten) Mechanismen sollen hier vorgestellt werden.
