Monozyten bilden zusammen mit Makrophagen einen wichtigen Bestandteil des angeborenen Immunsystems. Der Prozess, bei dem aus prä-monozytären Zellen reife Monozyten und MΦ entstehen, wird von einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren koordiniert. Ein Bedeutender von ihnen ist C/EBPβ (zsgf. in Huber et al. 2012, Kowenz-Leutz & Leutz 1999). Wie C/EBPβ während der monozytären Differenzierung reguliert wird und welchen Einfluss die Signaltransduktion dabei hat, ist Gegenstand dieser Arbeit.
4.1.1 Die Proteinmengen von mLAP*/LAP nehmen bei der monozytären Differenzierung von primären mBMdCs deutlich zu
Anhand eines ex vivo-Differenzierungsmodells wurde die Monopoese von mBMdCs hin zu mMΦ nachempfunden. In den myeloiden Zellen konnte mittels Western-Blot-Analyse gezeigt werden, dass die Mengen der transkriptionsfördernden murinen C/EBPβ-Isoformen mLAP*/LAP während der monozytären Differenzierung deutlich erhöht waren (Abb. 3.3). Für den Versuch wurden mMΦ erzeugt, die aus mM-CSF-behandelten mBMdCs von C57BL/6J-Mäusen (WT) hervorgegangen sind.
Während der Differenzierung durchliefen die Zellen zahlreiche morphologische (Abb. 3.1) sowie stoffwechselbezogene Veränderungen, die sich auch auf molekularer Ebene nachverfolgen ließen. So nahmen bspw. die Proteinmengen von Aktin, GAPDH und Rab11 in frühen Differenzierungsstadien zu. Ab Tag vier blieben diese dann auf einem konstant hohen Niveau (Daten nicht gezeigt). Die gleichmäßige Beladung der Blot-Membranen wurde daher mittels Ponceau-Rot-Färbung bestätigt.
Die Differenzierung der primären Zellen wurde mittels Mikroskopie (Abb. 3.1) und Durchfluss-zytometrie überwacht (Abb. 3.2). Für die durchflusszytometrische Analyse der Mauszellen konnte nicht auf den „Standard“-Monozyten/MΦ-Marker CD14 zurückgegriffen werden, der bei humanen Proben untersucht wird, da murine Monozyten/MΦ sehr wenig CD14 exprimieren. Deshalb wurden andere Zellmerkmale betrachtet, nämlich die Ausprägung von CD11b und Ly6C: Aus CD11b‒/Ly6C‒ doppelt-negativen HSCs entwickelten sich nach mM-CSF-Gabe rasch P1-Progenitorzellen (CD11b+/Ly6C+ schwach-positiv), die über weitere Zwischenstufen zu mMΦ ausdifferenzierten (CD11b++/Ly6C‒; Abb. 3.2). Die beiden Oberflächenproteine genügten für die sichere Identifizierung der mMΦ sowie für ihre Abgrenzung zu Granulozyten (CD11b‒/Ly6C+; Geissmann et al. 2003, 2008).
In den aus primären mBMdCs erzeugten mMΦ (Tag 7) konnte mittels Western-Blot-Analyse eindeutig mLAP*/LAP nachgewiesen werden. Frühe Differenzierungsstadien (Versuchstage 0 und 3) enthielten hingegen keine nachweisbaren mLAP*/LAP-Mengen (Abb. 3.3). Das Ergebnis legt die Vermutung nah, dass C/EBPβ während der späten MΦ-Differenzierung verstärkt synthetisiert wird
Seite | 86 und im reifen mMΦ auf einem erhöhten Proteinlevel verbleibt. In früheren Experimenten an murinen Myotuben wurde gezeigt, dass erhöhte mLAP*/LAP-Proteinmengen eine gute DNA-Bindeaktivität besaßen und zugleich die Synthese ihrer Zielgene induzierten (Wei et al. 2006). Im monozytären Differenzierungsmodell wird dies vermutlich ebenso der Fall sein. Zur Überprüfung dieser Hypothese könnte in Folgeexperimenten die mRNA-Expression von bekannten C/EBPβ -Zielgenen mittels RT-q-PCR bestimmt werden. In reifen mMΦ sollten sie gegenüber früheren Entwicklungsstadien erhöht sein. Als Kontrolle könnten C/EBPβko-mMΦ verwendet werden, in denen kaum bzw. keine mRNA der untersuchten Gene nachweisbar sein sollte. Zielgene von C/EBPβ im humanen monozytären System sind zum Beispiel IL-6 (Akira et al. 1990), IL-8, Chitotriosidase/
Chitinase 1 (CHIT1) und Knorpel-Glykoprotein-39/chitinase 3-like 1 (CHI3L1; Pham et al. 2007). Von IL-8 ist bekannt, dass seine mRNA in prä-monozytären THP-1-Zellen schwach exprimiert ist, durch Stimulation mit PMA aber deutlich induziert wird (Mahmoud et al. 2014). Vergleichbares wurde auch für CHIT1 beschrieben (Pham et al. 2007). Sie müssten zunächst im Mausmodell als C/EBPβ-Zielgene verifiziert werden. Vom MΦ-induzierbaren Ca2+-abhängigen (C-Typ) Lektin (Mincle/Clec4e) ist bekannt, dass seine Transkription sowohl beim Menschen als auch bei Mäusen von C/EBPβ reguliert wird (Matsumoto et al. 1999). Das Gen kodiert für einen membranständigen Rezeptor, der die Kohlenhydrate Glucose und Mannose bindet und überwiegend in MΦ exprimiert wird. Mincle spielt eine wichtige Rolle für das Immunsystem, da es auch bakterielle Glykolipide wie den mykobakteriellen cord factor binden kann (Ishikawa et al. 2009). Durch direkte Interaktion mit dem FcγR stimuliert Mincle in MΦ die Produktion inflammatorischer Zytokine und Chemokine (Yamasaki et al. 2008).
4.1.2 Die C/EBPβ-Proteinmenge ist in PMA-stimulierten THP-1- und MM-6-Zellen bei nur leicht induzierter C/EBPβ-mRNA stark erhöht
Weiterführende Arbeiten zur Untersuchung der C/EBPβ-Regulation während der monozytären Differenzierung sollten mit geeigneten, besser handhabbaren Modellen erfolgen. Die Wahl fiel auf prä-monozytäre THP-1- bzw. MM-6-Zellen. Letztere weisen bereits einzelne Charakteristika von reifen Monozyten auf (Ziegler-Heitbrock et al. 1988). Beide Zelllinien gehören der monozytären Reihe an und lassen sich durch Stimulation mit PMA zu Zellen mit einem MΦ-ähnlichen Phänotyp ausdifferenzieren (Tsuchiya et al. 1982; siehe Einleitung 1.3 sowie Abb. 3.4).
Im monozytären Differenzierungsmodell wurde beobachtet, dass die C/EBPβ-mRNA nur sehr leicht erhöht war (Abb. 3.5). Ihre Menge war nach 24-stündiger PMA-Stimulation im Vergleich zu unbehandelten Zellen lediglich zweifach erhöht und nahm auch nach längerer Inkubation bis 72 h nicht weiter zu.
Diskussion
Seite | 87 Die Literaturlage ist im Hinblick PMA-vermittelter Effekte auf die C/EBPβ-mRNA-Menge nicht eindeutig. In einigen Studien wurde gezeigt, dass sie in PMA-stimulierten THP-1-Zellen nach 24 h unverändert war (FANTOM Consortium et al. 2009), während andere Studien sogar eindeutig einen Anstieg um Faktor 10 nachweisen konnten, wobei dieser erhöhte Level bis 96 h stabil blieb (Pham et al. 2007). Eine Wiederholung des Versuchs mit THP-1-Zellen, die in der letztgenannten Publikation verwendet wurden (AG Rehli), ergab, dass die Zellen tatsächlich etwas sensibler auf PMA reagierten.
Es wurde aber nur eine dreifache Zunahme der C/EBPβ-mRNA-Menge in PMA-behandelten THP-1-Zellen (AG Rehli) beobachtet, obwohl die experimentellen Bedingungen so weit wie möglich einander angeglichen wurden (Abb. 3.5). Die unterschiedliche Sensibilität der Zellen beider Arbeitsgruppen gegenüber PMA lässt sich sehr wahrscheinlich darauf zurückführen, dass es sich bei den verwendeten Zellen um zwei THP-1-Subklone handelt. Das Auftreten von Subklonen innerhalb einer vermeintlich einheitlichen und stabilen Zelllinie ist nicht ungewöhnlich. Es wurde bereits mehrfach von THP-1-Zellen berichtet, die von der Norm abweichende Eigenschaften aufwiesen (FANTOM Consortium et al. 2009, Tsuchiya et al. 1982). Dadurch wird es zum Teil erschwert, Ergebnisse aus der Literatur zu reproduzieren und richtig zu interpretieren.
Leichte Abweichungen in den Kultivierungsbedingungen könnten ebenfalls zu den unterschiedlich stark ausgeprägten Effekten beigetragen haben. So wurde in der Arbeitsgruppe um Pham (AG Rehli) RPMI1640-Medium der Firma Biochrom und FCS der Firma Invitrogen verwendet. Da das Medium weder mit Antibiotika noch mit anderen Zusätzen versetzt wurde (vergleiche diese Arbeit, Abschnitt 2.5.3), wäre insbesondere die unterschiedliche Zusammensetzung des FCS eine mögliche Ursache für die beobachteten Effekte.
Der nur leicht veränderten C/EBPβ-mRNA-Menge in differenzierenden THP-1-Zellen stand eine enorme Zunahme der LAP*/LAP-Proteinmenge gegenüber (Abb. 3.6 A). In MM-6-Zellen, die einer späteren Entwicklungsstufe als THP-1-Zellen zuzuordnen sind, wurde ebenfalls eine deutlich erhöhte LAP*/LAP-Menge nach PMA-Gabe nachgewiesen (Abb. 3.6 B). Im Gegensatz dazu wurde die murine, myeloide Progenitorzelllinie 32D nicht durch PMA beeinflusst (Abb. 3.6 C). Diesen Zellen fehlen die PKC-Isoformen α und δ (Mischak et al. 1993), die neben anderen PKC-Familienmitglieder als primäre (und bisher einzige) zelluläre Ziele von PMA identifiziert wurden (Steinberg 2008). Die Zellen sind daher PMA-resistent.
PKC-α und -δ sind in THP-1- und MM-6-Zellen vorhanden, werden PMA-abhängig aktiviert, stimulieren nachgeschaltete Signalwege und beeinflussen so auch die C/EBPβ-Expression (zsgf. in Huber et al. 2014).
Im physiologischeren ex vivo-Differenzierungsmodell bei dem mBMdCs mittels mM-CSF zu mMΦ differenziert wurden, konnte in frühen Stadien der myeloischen Reihe kein mLAP*/LAP
nach-Seite | 88 gewiesen werden (Abb. 3.3). Möglicherweise lässt sich dies auf eine geringere Expression von PKC-α und -δ zurückführen, der in Folgeexperimenten mittels Western-Blot-Analyse untersucht werden kann.
Es bleibt festzuhalten, dass in frühen Entwicklungsstadien der myeloischen Reihe kein LAP*/LAP nachgewiesen werden konnte. In reifen Mausmonozyten und mMΦ sowie in den PMA-stimulierten monozytären Zelllinien (THP-1 und MM-6) wurden hingegen große Mengen LAP*/LAP mittels Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Diese und frühere Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass C/EBPβ insbesondere für die Regugaltion der terminalen Differenzierung von Monozyten/MΦ und während der induzierten Differenzierung von THP-1- und MM-6-Zellen von Bedeutung ist.
Die oben dargestellte Diskrepanz zwischen der nur leicht beeinflussten C/EBPβ-mRNA und der starken LAP*/LAP-Proteinzunahme in PMA-stimulierten THP-1-Zellen ist durch zwei Modelle erklärbar: (1) Entweder wurde die Translation der C/EBPβ-mRNA in den stimulierten Zellen stark
erhöht, und/oder
(2) das vorhandene LAP*/LAP wurde durch einen verzögerten Abbau deutlich stabilisiert.
Im nächsten Abschnitt soll zunächst die Translation der C/EBPβ-mRNA betrachtet werden. Es wird auf die Bedeutung der C/EBPβ-UTRs eingegangen und ebenfalls beleuchtet, welchen Einfluss verschiedene Translationsinitiationsfaktoren sowie RNA-bindende Proteine auf die C/EBPβ -Protein-synthese haben.
4.2 Die Translation der C/EBPβ-mRNA wird durch endogene Sequenzabschnitte reguliert