die ihre Translation während der monozytären Differenzierung beeinflussen, ist für das Verständnis dieses Differenzierungsprozesses von besonderer Bedeutung. Vorangegangene interne Arbeiten zeigten, dass eIF4B, ein wichtiger Co-Faktor der RNA-Helikase eIF4A, in PMA-stimulierten THP-1-Zellen aktiviert ist, die Expression der Helikase selbst aber unbeeinflusst bleibt. Durch knock down-Experimente wurde weiterhin ersichtlich, dass eIF4B für die exogene Synthese eines C/EBPβ -FL-V5-Reporters notwendig ist (Panterodt 2015). Eine in der vorliegenden Arbeit durchgeführte in silico-Analyse offenbarte eine komplexe C/EBPβ-mRNA-2D-Struktur mit zahlreichen hairpins und stem loops, die auch in der 5‘UTR zu finden waren (Abb. 3.7). Stem loops innerhalb der 5’UTR wurden bereits als Repressoren der C/EBPβ-Translation diskutiert (Timchenko et al. 2002).
Im Kontext eines hohen GC-Anteils des CEBPB-Gens (Huber et al. 2012) lassen beide Ergebnisse vermuten, dass die Translation der C/EBPβ-mRNA durch eine komplexe und vor allem stabile
Diskussion
Seite | 89 Sekundärstruktur negativ beeinflusst wird (Chatterjee & Pal 2009), da ebendiese das scanning des Translationsapparats auf der C/EBPβ-mRNA erschwert. Daher dürfte für die erfolgreiche Translation von C/EBPβ die Funktion von eIF4B (und der RNA-Helikase eIF4A) erforderlich sein.
Es ist bekannt, dass die Bindung der 5‘-m7G-cap-Struktur durch eIF4E (als eine Untereinheit von eIF4F) sowie das scanning nach dem ersten Start-AUG-Codon limitierend auf die Initiation der Translation wirken (Gingras et al. 1999, Hershey & Merrick in Sonenberg et al. 2000). Um zu untersuchen welchen Einfluss die C/EBPβ-UTRs auf die mRNA-Sekundärstruktur nehmen, und dadurch möglicherweise die initialen Schritte der Translation beeinflussen, wurde eine in silico-Analyse mit den C/EBPβ-UTR-Deletionsvarianten durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die 3‘-Enden aller untersuchten Varianten sehr wahrscheinlich zu den 5‘-Enden zurückfalten und mit diesen hybridisieren (Abb. 3.7 und 3.9). An dieser Stelle muss erwähnt werden, dass eine 2D-Struktur keine Auskunft darüber gibt, welche Konformation ein Molekül im Raum annimmt. Sie bietet dafür lediglich eine gute Hilfestellung.
Desweiteren waren in der C/EBPβ-5’UTR zahlreiche stem loop und hairpin-Strukturen erkennbar (Abb. 3.7), die aufgrund ihres hohen GC-Anteils als sehr stabil angesehen werden (Timchenko et al.
2002). Daher wurde angenommen, dass die 5’UTR einen deutlich hemmenden Effekt auf die Translation ausüben müsste. C/EBPβ-Varianten, in denen die 5’UTR fehlte (C/EBPβ-Δ5’UTR, -CS), hätten demnach besser translatiert werden müssen, als solche mit vorhandener 5’UTR – auch weil bei diesen Konstrukten das Start-AUG-Codon direkt auf das 5‘-m7G-cap folgte (Abb. 3.9).
Transfektionsexperimente an HeLa- und THP-1-Zellen konnten den vorhergesagten, deutlichen Hemmeffekt der 5’UTR auf die C/EBPβ-Synthese nur zum Teil bestätigen. Die C/EBPβ-Δ5’UTR -Variante wurde zwar besser translatiert als das Volllängenkonstrukt C/EBPβ-FL, jedoch wurde ersichtlich, dass die 3’UTR einen größeren regulatorischen Einfluss auf die C/EBPβ-Synthese ausübte (Abb. 3.10 und 3.11 bzw. Abb. 3.12 und 3.13): Die Synthese eines C/EBPβ-V5-Reporters, der beide UTRs enthielt (C/EBPβ-FL) war stark reprimiert. Fehlte diesem die 5’UTR (C/EBPβ-Δ5’UTR, 3’UTR vorhanden), wurde er geringfügig besser zu Protein umgesetzt. Im Vergleich dazu wurde bei der Variante ohne 3’UTR (C/EBPβ-Δ3’UTR, 5’UTR vorhanden) deutlich mehr Protein nachgewiesen. Die stärkste Synthese wurde aber beim C/EBPβ-CS-V5-Konstrukt beobachtet, dem beide UTRs fehlten.
Dieses Ergebnis wurde durch die Berücksichtigung zweier unabhängiger Referenzsysteme bestätigt:
die allgemeine Transfektionseffizienz, bzw. die rel. C/EBPβ-mRNA-Menge.
Vereinfacht lässt sich der inhibitorische Effekt der C/EBPβ-UTRs auf die Synthese des V5-Reporters wie folgt darstellen:
hemmender Effekt: groß
5′UTR + 3′UTR (FL) > 3‘UTR (Δ5’UTR) > 5’UTR (Δ3’UTR) > CS (Δ5‘UTR/Δ3’UTR) hemmender Effekt: klein
Seite | 90 Im Vergleich zur 5’UTR hemmte die 3’UTR die Synthese des Reportes wesentlich stärker. Einen möglichen Erklärungsansatz bietet die kalkulierte 2D-Struktur der C/EBPβ-FL-mRNA (Abb. 3.9), in der zu erkennen ist, dass sich die 3’UTR sehr wahrscheinlich entlang der kodierenden Sequenz bis hin zur 5’UTR zurückfaltet und mit dieser eine komplexe Sekundärstruktur ausbildet. Es ist denkbar, dass diese Interaktion ein potentielles Hindernis für den Translationsinitiationskomplex darstellt, welches das Scannen nach dem ersten Start-AUG-Codon negativ beeinflusst. Dies könnte zur schwachen Reportersynthese beigetragen haben, die für das 5‘- und 3’UTR-enthaltende Konstrukt (C/EBPβ-FL) beobachtet wurde (Abbildungen 3.10 bis 3.13).
Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurde untersucht, welchen Einfluss die UTRs auf die C/EBPβ -Proteinsynthese haben. Diese nicht-kodierenden Abschnitte einer mRNA erfüllen üblicherweise regulatorische Aufgaben. Sie können Bindemotive für Faktoren beherbergen, welche das (alternative) Spleißen kontrollieren, das gebundene Transkript stabilisieren oder dessen Abbau fördern, die mRNA-Translokation vom Kern ins Zytoplasma vermitteln und nicht zuletzt die Trans-lationsmaschinerie rekrutieren (Mazumder et al. 2003, Pickering & Willis 2005).
Neben strukturellen bzw. sterischen Effekten sind weiterhin RNA-bindende Proteine für die Regulation der Translation von großer Bedeutung. Für C/EBPβ wurde bereits beschrieben, dass die 3’UTR mehrere AU-rich elements (AREs) enthält, welche durch das RNA-bindende Protein HuR erkannt werden können. HuR stabilisiert die C/EBPβ-mRNA, beeinflusst aber auch ihre Lokalisation innerhalb der Zelle und somit indirekt ihre Translation und die Aktivität der gebildeten Proteine (Basu et al. 2011, Cherry et al. 2008, Gantt et al. 2005).
In dieser Arbeit konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass der inhibitorische Einfluss der 3’UTR durch unterschiedliche, bisher nicht charakterisierte Abschnitte innerhalb der UTR vermittelt wird. So ist insbesondere der Anfangsbereich der C/EBPβ-3’UTR für die Unterdrückung der Proteinsyntese von großer Bedeutung: War der Bereich 3‘UTR+7+206 deletiert (C/EBPβ-3’UTRΔ1), war die nachweis-bare C/EBPβ-V5-Proteinmenge in transfizierten HeLa-Zellen deutlich gegenüber einem Reporter erhöht, der die intakte C/EBPβ-3’UTR enthielt (C/EBPβ-FL bzw. C/EBPβ-Δ5’UTR; Abb. 3.10 und 3.11).
In der Literatur sind für diesen Abschnitt der C/EBPβ-3’UTR keine experimentellen Daten vorhanden, die ihm eine Interaktion mit RNA-bindenden Proteinen nachweisen. Ein Suchlauf auf der Internet-plattform The RNA-binding Protein Database (RBPDB) lieferte allerdings sechs mögliche Interaktions-partner (Tab. 3.2).
Der in silico-Analyse zufolge sind in der C/EBPβ-3’UTR+7+206-Sequenz drei HuR-Bindestelle lokalisiert.
Bindet HuR an eine Ziel-mRNA, begünstigt es für gewöhnlich dessen Stabilität (Peng et al. 1998), wie es bereits für das TNF-Transkript (Dean et al. 2001) aber auch für immediate early genes, wie die Prostaglandinsynthase cyclooxygenase-2 (COX-2; Sengupta et al. 2003) und den Transkriptionsfaktor
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Seite | 91 ATF2 beschrieben wurde (López de Silanes et al. 2004, Xiao et al. 2007). Durch die Rekrutierung weiterer Faktoren unterstützt HuR zudem den Transport des gebundenen Transkripts aus dem Kern ins Zytosol. Dort angelangt, kann es die mRNA allerdings auch an Orte leiten, an denen die mRNA zwar translatiert wird, die entstandenen Proteine jedoch durch fehlende Aktivatoren nicht funktionsfähig sind (Basu et al. 2011). Untersuchungen zur Interaktion von HuR mit der C/EBPβ -3’UTR haben gezeigt, dass die Regulation von C/EBPβ durch HuR über die ARE-Sequenzen im Bereich 3‘UTR+310+410 erfolgt. Die Untersuchungen wurden an 3T3-L1-prä-Adipozyten (Gantt et al. 2005, Jones et al. 2007) und an embryonalen Nierenzellen (HEK-293T; Basu et al. 2011) durchgeführt.
Die AREs im Bereich 3‘UTR+310+410 sind vom Typ III und bestehen aus G(U)4-6G. Im Gegensatz dazu sind die drei möglichen dicht hintereinander liegenden Bindestellen der 3’UTR+7+206-Region vom Typ II:
A(U)3-4A-Motive innerhalb einer U-reichen Region (zsgf. in Barreau et al. 2005). Es wurde gezeigt, dass HuR die Motive AUUUA und AUUUUA unter anderem in der humanen nitric-oxide synthase (NOS) II-mRNA bindet (Myer et al. 1997, Rodriguez-Pascual et al. 2000). Letztere Sequenz ist auch in der C/EBPβ-3‘UTR+7+206 vorhanden. HuR könnte demnach im monozytären Differenzierungsmodell die Synthese von C/EBPβ über die ARE-Motive der 3‘UTR+7+206 beeinflussen, was in künftigen Arbeiten untersucht werden sollte.
Ein weiterer Kandidat war das RNA-bindende Protein FUBP2, von dem bekannt ist, dass es das alternative Spleißen und die Lokalisation von Ziel-mRNAs innerhalb der Zelle beeinflusst (Min et al.
1997). Eine interessante Funktion von FUBP2 ist zudem, dass es die Degradation von ARE-enthaltenden Transkripten fördert und sie damit destabilisiert (Gherzi et al. 2004). Dies könnte zu einer Stabilisierung der mRNA bei der C/EBPβ-3’UTRΔ1-Variante geführt haben, die sich in einer verbesserten Proteinsynthese wiederspiegelt (siehe Abb. 3.10 und 11). Ob die mRNA-Stabilität der C/EBPβ-3’UTRΔ1-Variante gegenüber dem Volllängenkonstrukt tatsächlich erhöht ist, muss in weiteren Experimenten untersucht werden.
Die Proteine SLM-2 (Di Fruscio et al. 1999) und ZIS-2 (Nakano et al. 1998) sind RNA-bindende Proteine, die bisher ausschließlich mit dem Prozess das alternative Spleißen von mRNAs in Zusammenhang gebracht wurden (Adams et al. 2001, Cohen et al. 2005, Yang et al. 2013). Ein weiterer Kandidat war hnRNP G (Soulard et al. 1991, 1993). Es bindet unspezifisch an naszierende RNA, die von der RNA-Polymerase II synthetisiert wird (Kanhoush et al. 2009) und beeinflusst dort ebenfalls das alternative Spleißen (Nasim et al. 2003). Neuere Untersuchen weisen dem Protein zudem eine bedeutende Rolle bei der mitotischen Chromosomenmorphogenese durch direkte Interaktion mit Chromatin zu (Matsunaga et al. 2012). RBM4 ist ein weiteres, mögliches, die C/EBPβ -3‘UTR-bindendes Protein, für das bereits mehrere Funktionen beschrieben sind: Es ist an der Muskeldifferenzierung beteiligt (alternative Spleißprozesse), reguliert die normale sowie die internal
Seite | 92 ribosomal entry site (IRES) -abhängige Translation und wird außerdem mit microRNA (miRNA) -vermitteltem gene silencing in Verbindung gebracht (zsgf. in Markus & Morris 2009). Die primären Funktionen dieser vier Proteine lassen keine direkte Beeinflussung der C/EBPβ-Translation vermuten, allerdings ist es durchaus denkbar, dass sie als kompetitive Regulatoren die Bindungen anderer Faktoren (wie z. B. HuR oder FUBP2) behindern. Zudem kommt es gelegentlich vor, dass vermeintlich gut charakterisierte Proteine mit neuen/weiteren Funktionen in Verbindung gebracht werden, sodass ohne nachfolgende Untersuchungen nicht gänzlich ausgeschlossen werden kann, dass die in silico identifizieren Faktoren die Proteinsynthese von LAP*/LAP beeinflussen könnten.
Von den RNA-bindenden Proteinen, die bei der in silico-Analyse als mögliche die C/EBPβ-Translation beeinflussende Faktoren identifiziert wurden, sind also zunächst zwei von größerem Interesse: Zum einen HuR, das seine Ziel-mRNAs in Zytosolregionen transportieren kann, in denen frisch synthetisierte LAP*/LAP-Proteine nicht aktiviert werden und zum anderen FUBP2, das den Abbau gebundener Transkripte fördert. Werden die Zielsequenzen der RNA-bindenden Proteine durch Mutagenese deletiert, kommen ihre negativ-regulatorischen Einflüsse auf die Translation der betreffenden Transkripte nicht mehr zum Tragen, wie es bei dem Transfektionsexperiment mit der C/EBPβ-3’UTRΔ1-Variante in HeLa-Zellen beobachtet wurde (Abb. 3.10 und 3.11). Im Umkehrschluss könnte der knock down von HuR bzw. FUBP2, der durch kommerziell erhältliche siRNA realisierbar ist, die Proteinsynthese an der nativen (FL-) C/EBPβ-mRNA erhöhen.
In künftigen Experimenten sollte der negativ-regulatorische Bereich innerhalb der C/EBPβ-3‘UTR+7+206 durch gezielte Mutagenese weiter eingegrenzt werden. Hierfür bietet sich die Fusions-PCR an, auch bekannt als overlap extension PCR (Ho et al. 1989): In zwei unabhängigen Reaktion werden Fusionspartner generiert, die an ihren Enden mit zueinander komplementären Überhängen modifiziert sind. In einer dritten Reaktion werden die erzeugten Fusionspartner gemischt. Die über ihre homologen Sequenzbereiche interagierenden Fusionspartner können dann gemeinsam amplifiziert werden – sie werden „fusioniert“. Auf diese Art ist es möglich basengenaue (partielle) Deletionen in die 3’UTR einzufügen. Nachdem der regulatorische Bereich definiert wurde, können zudem mittels ortsspezifischer Mutagenese (site-directed mutagenesis) gezielt Basen ausgetauscht werden um deren Bedeutung für die Inhibierung der C/EBPβ-Proteinsynthese zu untersuchen.
Die eingegrenzten regulatorischen Abschnitte können auch dazu verwendet werden, von ihnen RNA-Sonden zu generieren. Mit diesen kann untersucht werden, ob die potentiellen Bindungspartner HuR und FUBP2 (sowie bisher unbekannte Faktoren) die betreffenden Sequenzen binden. Die Sonden müssten hierfür mit Gesamtzellextrakten von naiven und differenzierten Zellen inkubiert werden.
Dabei sollten sich die Interaktionspartner an die Sonden anlagern. Nach einer Reinigung können die Ansätze mittels Western-Blot-Analyse untersucht werden. Um bisher unbekannte Bindungspartner
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Seite | 93 ausfindig zu machen, bietet sich eine massenspektrometrische Analyse an. Bestätigen sich HuR und/oder FUBP2 in diesen in vitro-Ansätzen als C/EBPβ-3‘UTR+7+206-Bindeproteine, müssten die Ergebnisse in vivo bestätigt werden. Eine mRNA (z. B. C/EBPβ-3‘UTR+7+206), die mit der multiplen Erkennungssequenz des Bakteriophagen MS2 modifiziert ist, kann in vivo mit einem MS2-GFP-Reportersystem angefärbt (Basu et al. 2011, Rook et al. 2000) und mittels Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden. Die mRNA-Sonde und die potentiellen Bindungspartner wären in den Zellen co-lokalisiert.
Darüber hinaus sollte der Einfluss der möglichen C/EBPβ-mRNA-Interaktionspartner auf die LAP*/LAP-Synthese durch die gezielte Überexpression bzw. den knock down (bspw. mittels kommerziell erhältlicher siRNA) eben dieser Proteine untersucht werden.
4.3 Während der Monopoese ist PKR an der Regulation der C/EBPβ-Expression beteiligt