Transformation von E. coli

Transformationen von chemisch kompetenten E. coli-Zellen mit Plasmid-DNA erfolgten entsprechend der von Hanahan beschriebenen Hitzeschock-Methode (Hanahan 1985). Dafür wurden die Zellen mit 20 bis 100 ng DNA (versetzt mit 10 % (v/v) 1,2 M NaCl; 0,06 M MgCl2, Invitrogen/LT) transformiert.

Nach der Hitzeschock-Transformation bei 42 °C, 30 sek, und der Regeneration in SOC-Medium (super optimal broth (SOB) -Medium mit 20 mM Glucose; Invitrogen/LT) wurden die Zellen bei 8.000 x g, RT, für 30 sek zentrifugiert, in 80 µl sterilem H2O resuspendiert und auf selektivem Feststoffmedium ausplattiert. Nach einer Inkubation bei 37 °C über Nacht wurden am Folgetag die erhaltenen Klone auf frischen Selektionsfeststoffmedien ausgestrichen und weiter untersucht.

Seite | 40 2.8 Präparation von Nukleinsäuren

2.8.1 Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli

Plasmidpräparationen aus E. coli-Flüssigkulturen wurden entsprechend der Herstellerangaben mit folgenden Kits durchgeführt:

QIAprep Miniprep/Spin Miniprep (Qiagen), NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel),

NucleoBond® Xtra Midi/Maxi (Macherey-Nagel).

Mit einem NanoDrop Spektralphotometer ND-1000 wurden die Plasmidpräparate auf Reinheit und Ausbeute untersucht.

2.8.2 Isolation von Gesamtzell-RNA aus tierischen Zellen

Zur Herstellung von Gesamtzell-RNA-Präparaten wurde das RNeasy MiniKit sowie das RNeasy MicroKit (beide Qiagen) verwendet. Die Angaben des Herstellers wurden beachtet.

Gesamtzell-RNA wurde zum einen aus frischen Proben und zum anderen aus bei ‒20 °C gelagerten Zellpellets isoliert (Zellernte: Abschnitt 2.5.6). Zur Beseitigung einer DNA-Kontamination wurde fakultativ ein DNase I-Verdau durchgeführt (RNase-Free DNase Set, Qiagen). Die gereinigte Gesamtzell-RNA wurde in 30 µl (MiniKit) bzw. 14 µl (MicroKit) RNase-freiem H₂O aufgenommen und mittels Spektralphotometer auf Reinheit und Ausbeute untersucht.

2.8.3 Konzentrieren von Gesamtzell-RNA

Wenn die Ausbeute an Gesamtzell-RNA gering war, wurde die entsprechende Probe mit Hilfe einer Vakuumzentrifuge eingeengt. Dafür wurde das Programm V-AG verwendet: 30 °C, 1 bis 2 h. Die eingeengte Probe wurde mit 10 µl RNase-freiem Wasser verdünnt und anschließend zur Bestimmung der RNA-Konzentration an einem Spektralphotometer gemessen. Bis zur weiteren Verwendung wurde die Probe auf Eis aufbewahrt (kurzfristig) oder für längere Zeiträume bei ‒20 °C gelagert.

2.9 Reverse Transkription von Gesamt-RNA, cDNA-Synthese

Complementary DNA (cDNA, komplementäre DNA) wurde in dieser Arbeit in einem Mastercycler Gradient synthetisiert (Huber et al. 2003). Je nach Ausbeute der RNA-Isolation wurden dabei 200 bis 2.000 ng Gesamtzell-RNA eingesetzt.

Material und Methoden

Seite | 41 Alternativ wurde die Synthese von cDNA mit 1x PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time; Clontech/TaKaRa-Bio Inc., Shiga, JPN) nach den Angaben des Herstellers bei folgenden Reaktions-bedingungen durchgeführt: 20 µl-Ansatz; 37 °C, 15 min; 85 °C; 5 sek; 10 °C bis zur weiteren Verwendung bzw. Lagerung bei ‒20 °C.

2.10 Polymerasekettenreaktion 2.10.1 PCR-Bedingungen

Zum Nachweis und zur Vervielfältigung von definierten DNA-Abschnitten wird im Laboralltag routinemäßig die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR; Mullis et al. 1986; Saiki et al. 1985) durchgeführt. In dieser Arbeit wurden zwei kommerzielle PCR-Systeme sowie ein Mastercycler Gradient bei folgenden Reaktionsbedingungen verwendet:

FastStart Taq DNA Polymerase, dNTPack, Version 4.0 (Roche) Schritt Temperatur; Zeit PCR-Programm: Denaturierung 98 °C; 2 min 30 sek

Denaturierung 98 °C; 25 sek

Anlagerung ϑAnlagerung [°C]; 25 sek 30 Zyklen DNA-Synthese 72 °C; tSynthese [sek]

DNA-Synthese 72 °C; 5 min 10 °C bis zur weiteren Verwendung.

Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (New England BioLabs Inc., NEB; Ipswish, MA, USA) Schritt Temperatur; Zeit

PCR-Programm: Denaturierung 94 °C; 1 min 30 sek Denaturierung 94 °C; 15 sek

Anlagerung ϑAnlagerung [°C]; 15 sek 30 Zyklen DNA-Synthese 72 °C; t_Synthese [sek]

DNA-Synthese 72 °C; 5 min 10 °C bis zur weiteren Verwendung.

Die Anlagerungstemperatur ϑAnlagerung ist abhängig von der Zusammensetzung der Primeroligo-nukleotide, die Synthesedauer tSynthese ihrerseits von der erwarteten Produktgröße und der verwendeten DNA-Polymerase. Die Anlagerungstemperatur lag zwischen 45 und 70 °C, die Synthesedauer betrug 30 sek bis 7 min.

Die optimale Anlagerungstemperatur für ein Primerpaar wurde mittels Gradienten-PCR ermittelt.

Dabei wurde für die Anlagerungsphase der PCR ein Temperaturgradient einprogrammiert. Er wurde so gewählt, dass die Temperaturrampe die erwartete Anlagerungstemperatur ±7 °C umfasste. Die

Seite | 42 Anlagerungstemperatur der Primer wurde mit dem Programm Tm Calculator (Thermo; basierend auf Breslauer et al. 1986) ermittelt.

Zur Steigerung der Produktausbeute wurde das Reaktionsgemisch zum einen mit einem kitinternen Zusatz versetzt (GC-RICH Solution, Roche; Q5 High GC Enhancer, NEB; jeweils 0,5- bis 1-fach), zum anderen wurden 2,5 % DMSO wie auch 6 bis 8 % Ethylenglycol (Fluka/Sigma-Aldrich) erfolgreich getestet (Winship 1989, Zhang et al. 2009).

Als Template für eine PCR können nicht nur DNA-haltige wässrige Lösungen eingesetzt werden, es ist ebenfalls möglich, in einer sogenannten „Kolonie-PCR“ Bakteriensuspensionen auf das Vorhanden-sein spezifischer DNA-Sequenzen zu untersuchen. Hierfür wurden gesicherte Transformanten/Klone (Transformation: Abschnitt 2.7.4) in Fünfergruppen zusammengefasst und in 50 µl H2O suspendiert.

Von dieser Zellsuspension wurden 0,6 µl als Template für die Kolonie-PCR eingesetzt. War eine solche Gruppe positiv, wurden die einzelnen Klone separat getestet.

2.10.2 PCR-basierte Mutagenese

Die PCR ist nicht nur in der Lage, DNA-Abschnitte genau zu reproduzieren, vielmehr ist es häufig von Interesse, die vorliegende DNA-Sequenz zu verändern. So können beispielsweise mittels PCR definierte Sequenzabschnitte innerhalb eines Plasmids entfernt werden. Dafür werden die Primer so gewählt, dass sie den zu deletierenden Bereich flankieren und von ihm weg gerichtet sind. Bei der PCR wird somit das gesamte Plasmid mit Ausnahme der zu entfernenden Sequenz amplifiziert. Bei Verwendung der Q5-DNA-Poymerase entstehen PCR-Produkte mit glatten Enden, die nach einer Gelreinigung re-ligiert werden können und damit wieder zirkulär vorliegen.

Zur Erzeugung der C/EBPβ-3’UTRΔ1-Deletionsvariante wurden die Primer C/EBPβ-3‘Δ1-fw und C/EBPβ-3‘Δ1-rv verwendet. Nach erfolgter Ligation (Abschnitt 2.12.2) und Transformation in E. coli TOP 10-Zellen (Abschnitt 2.7.4) wurden die erhaltenen Klone mittels PCR (Primer: C/EBPβ-CS-fw und C/EBPβ-3’Δ2-rv) sowie BtsI-Restriktionsverau getestet (Abschnitt 2.12.3). Positive Klone wurden zudem durch einen externen Dienstleister sequenziert (Abschnitt 2.10.5).

Die C/EBPβ-3’UTRΔ2-Deletionsvariante wurde mit den Primern C/EBPβ-3’Δ2-fw und C/EBPβ-3’Δ2-rv erzeugt und wie eben beschrieben weiterverarbeitet und getestet. Die Test-PCR wurde mit den Primern C/EBPβ-CS-fw und pcDNA-rv durchgeführt.

Material und Methoden

Seite | 43 2.10.3 Reverse transcriptase, quantitative PCR

Die reverse transcriptase, quantitative PCR (RT-q-PCR, auch real-time quantitative PCR) ist eine sehr sensitive Methode um die relative Kopienzahl einer definierten DNA-Sequenz in einem DNA-Gemisch mit einer gleichzeitig sehr niedrigen Nachweisgrenze zu bestimmen (Pfaffl 2001, Wang et al. 1989).

Wird Gesamtzell-RNA zunächst in cDNA revers transkribiert (Abschnitt 2.9), kann auch eine in ihr vorhandene RNA-Spezies (bspw. ein Transkript) quantifiziert werden.

In dieser Arbeit wurden für die RT-q-PCR ein LightCycler 480, LightCycler 480 Multiwell Plates 96 sowie der Taq-DNA-polymerasebasierende Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen) verwendet. Eine Reaktion bestand aus 10 µl SYBR Green SuperMix, je 0,5 µl Vorwärts- und Rückwärtsprimer (250 µM), 4 µl H₂O (Injektionswasser, B. Braun) sowie 5 µl cDNA-Lösung (30 bis 125 ng cDNA; siehe Abschnitt 2.9). In Dreifachbestimmungen wurden auf derselben Platte das Zielgen (i. d. R. C/EBPβ) und ein interner Standard (beta-2-Mikroglobulin, β2M bzw. Glyzerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, GAPDH) gemessen. Amplifikate des jeweiligen zu untersuchenden Gens wurden in einen Vektor kloniert. Mit den erhaltenden Plasmiden wurden Eichgeraden erzeugt (serielle 10er-Verdünnungsreihen; 117 ag/µl bis 117 pg/µl Template) aus der die Effizienz der jeweiligen PCR abgelesen wurde (Vorarbeiten der AG Brand).

Das Programm für die RT-q-PCR setzte sich wie folgt zusammen:

Schritt Temperatur; Zeit RT-q-PCR-Programm: UDG-Inkubation 50 °C; 2 min

Denaturierung 95 °C; 2 min Denaturierung 95 °C; 10 sek

Anlagerung 59 °C; 15 sek 45 Zyklen DNA-Synthese 72 °C; 20 sek

Denaturierung 72 °C; 5 min DNA-Schmelzkurve 60 bis 95 °C; 5 min

Der erste Schritt (Uracil-DNA-Glykosidase [UDG] -Inkubation) diente der Beseitigung uracilhaltiger DNA-Moleküle (Lindahl et al. 1977), wodurch eine Probenverschleppung entgegengewirkt wurde. Im folgenden ersten Denaturierungsschritt (95 °C; 2 min) wurde die UDG inaktiviert und die cDNA linearisiert. Außerdem wurde die Taq-DNA-Poymerase aktiviert, die bis zu diesem Zeitpunkt durch einen gebundenen Antikörper inaktiviert vorlag. Im Anschluss erfolgte die Amplifikation.

Die Messung lieferte Ct-Werte, welche entsprechend Pfaffl ausgewertet wurden (Pfaffl 2001). Die relativen mRNA-Werte des untersuchten Gens wurden auf die stabilen Werte des internen Standards normalisiert.

Seite | 44 2.10.4 Fällen von PCR-Produkten

Das Reinigen und Konzentrieren von PCR-Produkten ist bei vielen Arbeitsschritten bedeutend. Eine Reinigung kann durch eine Agarose-Gelelektrophorese erzielt werden (Abschnitt 2.11.1), aber auch durch Fällung von DNA-haltigen Lösungen.

In dieser Arbeit wurden PCR-Produkte gefällt indem drei 100 µl-Ansätze nach erfolgter Reaktion in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vereinigt und mit 30 µl 3 M NaAc (Carl Roth) pH 5,8 sowie 1 ml kaltem 96 %igem Ethanol versetzt wurden (Mülhardt 2013). Das Gemisch wurde bei ‒80 °C für mindestens 30 min inkubiert und dann in einer Tischkühlzentrifuge bei 13.000 rpm, 4 °C, 20 min zentrifugiert. Das getrocknete Pellet wurde in 30 µl H2O aufgenommen. Die DNA-Konzentration der Lösung wurde an einem Spektralphotometer gemessen.

2.10.5 Sequenzierung

Plasmid-DNA (1 µg in 10 µl) wurde durch den DNA Sequencing Service der Firma Eurofins MWG Operon (Luxemburg, Luxemburg) entsprechend den Angaben des Dienstleisters durchgeführt. Die benötigten Primer wurden entweder durch Eurofins gestellt oder mit versendet.

2.11 Gelelektrophorese

2.11.1 Agarose-Gelelektrophorese

Mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese ist es möglich, DNA-Fragmente ihrer Größe nach aufzutrennen. Dabei wird die Ziel-DNA zudem von unerwünschten Salzen, Proteinen und anderen Spezies gereinigt. Durch Mitführen einer geeigneten Leiter kann auch die Größe der DNA-Fragmente, d. h. ihre Länge in Basenpaaren (bp), annähernd bestimmt werden. Als DNA-Leitern wurden HyperLadder^TM I (1.000 bp), HyperLadder^TM IV (100 bp) sowie HyperLadder^TM V (25 bp) verwendet (alle von Bioline, London, UK).

Nach erfolgter Reaktion wurden in dieser Arbeit sowohl PCR-, als auch DNA-Restriktionsansätze (Abschnitt 2.12.3) mittels Agarose-Gelelektrophorese weiterverarbeitet/gereinigt. Die Proben wurden dafür mit 1x Bromphenolblau-DNA-Ladepuffer versetzt, in die Taschen eines Agarosegels (0,8 bis 1,5 % Agarose in 1x TAE-Puffer, 2 µl Ethidiumbromidlösung (Carl Roth) je 100 ml Gel) pipettiert und mit 1x TAE-Laufpuffer überschichtet. Bei einer Spannung von 125 V (Biorad PowerPac Basic) wurden die Proben in einer Laufkammer elektrophoretisch aufgetrennt. Das DNA-Bandenmuster wurde an einem UV-Geldokumentationssystem dokumentiert (λ = 254 nm). An diesem System wurden außerdem Gelexzisionen durchgeführt (siehe unten).

Material und Methoden

Seite | 45 2.11.2 Exzision von DNA-Fragmenten aus einem Agarosegel

Ein DNA-Fragment, mit dem man nach einer Agarose-Gelelektrophorese weiterarbeiten möchte, kann aus einem Agarosegel isoliert werden. Dafür wird an einem UV-Geldokumentationssystem mit einem Skalpell der entsprechende Abschnitt aus dem Gel ausgeschnitten, der das DNA-Fragment enthält. Die Isolation der DNA aus dem Gelwürfel erfolgte mit dem NucleoSpin Extract II Kit (Macherey-Nagel) nach den Angaben des Herstellers. Das Gelstück wurde hierbei in dem kitinternen Puffer bei 50 °C schüttelnd in einem Thermomixer aufgelöst, die DNA an einer Silikatmembran immobilisiert und letztlich in 30 µl H2O eluiert.

2.11.3 RNA-Gelektrophorese

RNA-Isolate (Abschnitt 2.8.2) wurden stichprobenartig mittels Experion^TM Automated Electrophoresis System 701-7001 auf Degradation untersucht. Dabei wurden die Angaben des Herstellers befolgt. Die zu untersuchenden RNA-Proben und die RNA-Leiter (je 2 µl) wurden bei 70 °C für 2 min in einem Thermomixer denaturiert, zentrifugiert (10.000 rpm, 5 sek) und jeweils 1 µl in einen frisch vorbereiteten Experion RNA StdSens Chip pipettiert. Die Messung in der Experion Electrophorese Station erfolgte nach Einstellung einiger Parameter automatisch und lieferte ein Gelbild sowie ein Elektropherogramm. Die Leiter fungierte im Gelbild als interner Standard, die ribosomalen RNA-Banden (rRNA) der Probe dienten als Maß für die Intaktheit bzw. Degradation der RNA. Aus dem Elektropherogramm ließ sich ebenfalls aus der Fläche unter den Signalspitzen eine RNA-Konzentrationsangabe der Probe ableiten.

2.12 Klonieren von DNA

2.12.1 Glätten von DNA-Fragmenten, Klenow-Reaktion

DNA-Fragmente mit überhängenden Enden können mittels Klenow-Reaktion „geglättet“ werden um sie bspw. für eine blunt end-Klonierung vorzubereiten. Für die Klenow-Reaktion wurde das DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment (NEB) verwendet. Dabei wurden die Angaben des Herstellers befolgt: RT, 10 min. Die für die Reaktion benötigten Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs) wurden dem FastStart Taq DNA Polymerase, dNTPack, Version 4.0 Kit entnommen. Nach der Reaktion wurde das Enzym thermisch inaktiviert: 75 °C, 10 min; Abkühlen auf Eis.

Seite | 46 2.12.2 Ligation von DNA-Fragmenten

Das Verknüpfen zweier DNA-Fragmente wird als Ligation bezeichnet. Die zu ligierenden Enden können dabei auch vom selben Molekül stammen, sofern sie komplementär zueinander bzw. blunt end sind (linearisierter Vektor). Dies führt zum Ringschluss des Plasmids.

In dieser Arbeit wurden mittels Quick Ligation™ Kit (Quick T4 DNA Ligase, Thermo Scientific) je 25 ng linearisierter, gereinigter Vektor re-ligiert/zirkularisiert. Die Reaktion wurde bei 25 °C, 5 min, entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Ligationsprodukte wurden nach einer kurzen Inkubation auf Eis direkt in chemisch-kompetente E. coli TOP-10-Zellen transformiert (Abschnitt 2.7.4).

2.12.3 DNA-Verdau mittels Restriktions-Endonukleasen

Zur Überprüfung der erzeugten C/EBPβ-3’UTR-Varianten wurden unter anderem DNA-Restriktionen durchgeführt. 3’UTR-variantentragende Plasmide (250 ng) wurden in einem 10 µl-Ansatz mit 1x NEBuffer 4 sowie 1x BSA versetzt und mit 0,5 µl 10x BtsI-Restriktions-Endonuklease (alle NEB) verdaut (55 °C, 15 min). Nachdem die Ansätze kurz auf Eis abkühlten, wurden sie in einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt (Abschnitt 2.11.1) und analysiert.

2.13 Proteinbiochemische und immunologische Analyse 2.13.1 Herstellung eines Gesamtzell-Proteinextrakts

Gesamtzell-Proteinextrakte wurden in dieser Arbeit ausschließlich nach folgendem Protokoll hergestellt: Geerntete Zellen (Abschnitt 2.5.6) wurden in einem angemessenen Volumen Puffer C (i. d. R. 80 µl) resuspendiert und für mindestens 5 min auf Eis lysiert. Sollte in Folgeexperimenten die Phosphorylierung an Proteinen untersucht werden, wurden diese Suspensionen mit 1x Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) (Thermo Scientific Pierce) versetzt. Die Lysate wurden anschließend für 10 sek sonifiziert (25 % Leistung), erneut 5 min auf Eis inkubiert und in einer Tischkühlzentrifuge bei 4 °C pelletiert (10.000 x g, 10 min). Der Überstand (Gesamtzellextrakt) wurde in ein frisches Reaktionsgefäß überführt und bis zur weiteren Verwendung kurzzeitig auf Eis oder für längere Zeiträume bei ‒20 °C aufbewahrt.

2.13.2 Bestimmung der Proteinmenge nach Bradford

Die Proteinkonzentration der Proteinrohextrakte wurde mit der Bradford-Methode bestimmt (Bradford 1976). Als Reagenz wurde das Protein Assay Farbstoffkonzentrat der Firma BioRad

Material und Methoden

Seite | 47 verwendet. Es wurde 1 : 5 mit Reinst-H2O verdünnt, zu je 15 µl in die wells einer transparenten 96-well Platte mit flachem Boden gegeben und mit 5 µl Gesamtzellextrakt (1 : 20-Verdünnung, H2O) bzw. 5 µl Proteinstandard gemischt. Die Messung wurde in Dreifachbestimmungen durchgeführt. Der Farbumschlag von braun zu blau wurde mit einem microplate-Absorptionsmesser unter Zuhilfenahme des Programms Gene5 (Biotek) gemessen. Anhand einer Proteinstandardkurve (0;

0,25; 0,5; 1; 2 und 3 mg/ml BSA in 1 : 20 Puffer C; dies entspricht 0; 12,5; 25; 50; 100 und 150 µg/ml Protein pro well) ließ sich die Proteinkonzentration in den Proben berechnen.

2.13.3 Renilla-Assay

Die Effizienz einer Transfektion lässt sich durch die Auswertung GFP-exprimierender Transfektanten mittels Mikroskopie (Abschnitt 2.5.1) bzw. Durchflusszytometrie (Abschnitt 2.6) bestimmen.

Weiterhin ist es möglich, Zellen mit einem Plasmid zu (co)-transfizieren, welches die genetische Information für ein Enzym trägt. Die messbare Enzymaktivität gibt dann Auskunft über den Erfolg der Transfektion. Für diesen Zweck wurden in dieser Arbeit THP-1- und HeLa-Zellen mit dem pRL-TK Plasmid co-transfiziert, welches für die Renilla-Luciferase kodiert. Die relative Renillaaktivität wurde mittels Dual-Luciferase® Reporter (DLR™) Assay System (Promgea) an einem Luminometer unter Berücksichtigung der Herstellerangaben bestimmt. Dieser Assay ist eigentlich für die Reportergen-analyse entwickelt wurden, kann aber auch wie, nachstehend beschrieben, zur Bestimmung der allgemeinen Transfektionseffizienz eingesetzt werden. Die benötigten Reagenzien und die Gesamtzellextrakte wurden auf RT erwärmt.

Für den Assay wurden 20 µl Gesamtzellextrakt in einer Costar 96 well assay plate vorgelegt, für 10 sek mit 50 µl Luciferase Assay Reagent II (LAR II) im Luminometer inkubiert und gemessen.

Anschließend wurden die Proben mit 50 µl Stop & Glo® Reagent versetzt, für 10 sek inkubiert, und erneut gemessen. Bei dem gewählten Versuchsaufbau war nur der zweite Messwert von Interesse, da er Auskunft über die Aktivität der Renilla-Luciferase gab. Nachdem die Messwerte mit den Proteinkonzentrationen der Gesamtzellextrakte (vorheriger Abschnitt) normalisiert wurden, erhielt man die relativen Enzymaktivitäten. Diese stehen im direkten Verhältnis zur Transfektionseffizienz.

Dabei geht man davon aus, dass die beiden co-transfizierten Plasmide zu gleichen Teilen in die Zellen geschleust werden. So erhält man durch die Messung der Reporteraktivität auch (indirekt) eine Information über die Transfektionseffizienz des Zielplasmids (Gould & Subramani 1988, Xie et al.

2011).

Seite | 48 2.13.4 Immunologischer Proteinnachweis: Western-Blot-Analyse

Elektrophoretisch aufgetrennte Proteinextrakte können mit Hilfe des Western-Blot-Verfahrens (Immunblot) auf eine Nitrozellulosemembran übertragen werden (Burnette 1981, Renart et al. 1979, Towbin et al. 1979). Die auf der Membran immobilisierten Proteine werden anschließend mit einem primären Antikörper inkubiert (Tab. 2.4), der selektiv an das zu untersuchende Protein bindet.

Nachdem der überschüssige Antikörper mit TBST abgewaschen wurde, konnte die Membran mit einem sekundären Antikörper überprobt werden, der mit Meerrettichperoxidase (horse raddish peroxidase, HRP) konjugiert war. Das Enzym ist in der Lage, den Umsatz eines chemilumineszenten Substrats zu katalysieren. Über ein bildgebendes Verfahren können die emittierten Photonen detektiert werden. Dadurch lässt sich eine semiquantitative Aussage über das Vorhandensein des Zielproteins in der untersuchten Probe treffen. Ist der primäre Antikörper gegen ein phosphoryliertes Epitop des Zielproteins gerichtet, kann sogar der Phosphorylierungsstatus untersucht werden. Durch Mitführen eines Größenstandards (Proteinleiter) kann zudem die molekulare Größe des untersuchten Proteins [kDa] näherungsweise bestimmt werden. Die densitometrische Auswertung der erzeugten Bilder ermöglicht eine statistische Auswertung mehrerer Experimente.

2.13.4.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Für eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurden die zu untersuchenden Gesamt-zellextrakte auf 10 bis 20 µg Protein im gleichen Volumen eingestellt, mit 1x Lämmli-Probenpuffer versetzt, aufgekocht (95 °C, 3 min), auf Eis abgekühlt (5 min), zentrifugiert (10.000 x g, 5 sek) und in die Taschen eines Gels pipettiert. Die Gele wurden zum einen kommerziell erworben (12 % Tris/Glycin Gel; 1,0 oder 1,5 mm; Biostep) und in einer Perfect Blue Twin-Doppelelektrophorese-kammer verwendet, zum anderen wurden sie frisch hergestellt und in einem Mini-Protean Tetra Cell System verwendet. Trenn- und Sammelgele wurden zwischen zwei von Abstandhaltern (1,0 mm bzw.

1,5 mm) getrennten Glasplatten gegossen und setzten sich wie folgt zusammen:

Reagenz Menge für 1 Gel (1,5 mm)

Trenngel (12 %), H2O 3.920 µl

bestehend aus 1,5 M Tris (pH 8,8) 2.250 µl

10 % SDS 3.390 µl

40 % Acrylamid/Bis-Lösg. (BioRad) 2.700 µl 10 % Ammoniumperoxodisulfat 3.354 µl

(APS; BioRad)

N,N,N′,N′-Tetramethylethan-1,2- 3.359 µl diamin (TEMED; BioRad)

Material und Methoden

Seite | 49

Reagenz Menge für 1 Gel (1,5 mm)

Sammelgel (5 %), H2O 1.510 µl

bestehend aus 0,5 M Tris (pH 6,8) 1.630 µl

10 % SDS 1.030 µl

40 % Acrylamid 1.313 µl

10 % APS 1.015 µl

TEMED 1.003 µl

Zunächst wurde das Trenngel in eine auslaufsichere Gelgießapparatur gegossen und mit Isopropanol (ChemSolute/Th. Geyer GmbH & Co. KG, Renningen, D) überschichtet. Die Polymerisation dauerte etwa 20 min, dann wurde das Isopropanol abgenommen. Das Trenngel wurde mit Sammelgel überschichtet, in welches sofort ein Kamm eingelassen wurde.

Kommerziell erworbene und selbst hergestellte Gele wurden in die entsprechende Gelelektro-phoreseapparatur eingespannt. Diese wurde mit 1x SDS-Laufpuffer befüllt. Anschließend wurden die Kämme aus den Gelen entfernt und die Geltaschen mit den vorbereiteten Proben bzw. mit 5 µl Proteinleiter (PageRuler plus prestained protein ladder, Fermentas bzw. Precision plus protein™

unstained standard, BioRad) beladen. Durch Anlegen einer elektrischen Spannung von 125 V wurden die Größenmarker der Proteinleiter und die Protein-SDS-Komplexe der Proben entsprechend ihrer molekularen Größe getrennt.

2.13.4.2 Blotting

Im nächsten Schritt, dem Blot-Prozess, wurden die getrennten Proteine aus dem Gel auf eine Nitrocellulose-Membran (0,45 µm) übertragen. Dazu wurde ein Blotting-Sandwich, bestehend aus Blotting-Kassette, einem Schwamm, drei Lagen Blotting-Papier, Gel, Membran, drei weiteren Lagen Blotting-Papier und einem weiteren Schwamm zusammengesetzt. Der Zusammenbau erfolgte in einer mit 1x Transferpuffer befüllten Schale unter Ausschluss von Luftblasen. Das fertige Blotting-Sandwich wurde in einen mit 1x Transferpuffer gefüllten Tank-Elektroblotter überführt. Der Blot-Prozess wurde mit einer elektrischen Spannung von 125 V bis zum Erreichen von 100 V∙h oder über Nacht bei 4 °C mit einer Stromstärke von 40 mA durchgeführt. Anschließend wurde die Membran auf einem Orbitalschüttler kurz in 1x TBS gewaschen und dann für 1 h in TBST, 5 % Milch blockiert. Vor der weiteren Verwendung wurden die blockierten Membranen zweimal kurz mit TBST gewaschen.

Vor der weiteren Verwendung kann eine blockierte Membran auf die gleichmäßige Beladung mit Protein überprüft werden. Die Membran wird hierfür 5 min schwenkend in Ponceau-Rot-Färbelösung inkubiert. Dabei bindet der rote Azofarbstoff Ponceau S reversibel an positiv geladene Amino-gruppen, der auf die Membran geblotteten Proteine. Durch mehrmaliges waschen der gefärbten Membran mit Wasser wird ein rotes Proteinbandenmuster sichtbar, das in gleichmäßig beladenen

Seite | 50 Spuren eine vergleichbare Intensität aufweist. Anschließend kann der Farbstoff durch intensives Waschen größtenteils entfernt werden.

2.13.4.3 Immunologischer Nachweis von Proteinen

Eine blockierte Western-Blot-Membran wurde bei 4 °C über Nacht mit einem primären Antikörper auf einem Orbitalschüttler inkubiert (alle relevanten Angaben zu den verwendeten Antikörpern sind in Tab. 2.4 zusammengestellt). Die primären Antikörper wurden in TBST, 5 % BSA (bzw. 5 % Milch), 0,2 ‰ Natriumazid gelöst. Nach dreimaligem Waschen (jeweils 10 min) mit TBST wurde die Membran mit einem sekundären Antikörper für 1 h auf dem Orbitalschüttler überprobt. Als sekundäre Antikörper wurden in TBST, 5 % Milch gelöste Anti-Mouse-IgG-HRP und Anti-Rabbit-IgG-HRP verwendet. Ihr Einsatz richtete sich nach der Spezies, in welcher der primäre Antikörper generiert wurde. Nach der Inkubation mit dem sekundären Antikörper wurde die Membran dreimal für 10 min mit TBST und dreimal kurz mit TBS gewaschen.

Für die Detektion wurde die Membran zwischen zwei Klarsichtfolien gelegt und mit ECL western blotting substrate bzw. den stärkeren SuperSignal west femto chemiluminescent substrate (beide Pierce, Rockford, IL USA) oder WesternBright sirius HRP substrate (Advansta, Menlo Park, CA USA) inkubiert. Dabei kam es an der HRP zu einer chemilumineszenten Reaktion. Das emittierte Licht wurde an einem Chemilumineszenzdetektor oder mittels Röntgenfilmbelichtung detektiert. Die Filme wurden an einer Entwicklermaschine mittels Entwickler- und Fixiererlösung (Adefo GV-60 Entwickler

Für die Detektion wurde die Membran zwischen zwei Klarsichtfolien gelegt und mit ECL western blotting substrate bzw. den stärkeren SuperSignal west femto chemiluminescent substrate (beide Pierce, Rockford, IL USA) oder WesternBright sirius HRP substrate (Advansta, Menlo Park, CA USA) inkubiert. Dabei kam es an der HRP zu einer chemilumineszenten Reaktion. Das emittierte Licht wurde an einem Chemilumineszenzdetektor oder mittels Röntgenfilmbelichtung detektiert. Die Filme wurden an einer Entwicklermaschine mittels Entwickler- und Fixiererlösung (Adefo GV-60 Entwickler

Im Dokument Regulation des Transkriptionsfaktors C/EBPβ während monozytärer Differenzierung: Beteiligung der Proteinkinase R (Seite 56-0)