Die CCAAT/enhancer-binding proteins bilden eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die sechs Mitglieder umfasst, welche entsprechend ihrer Entdeckung chronologisch als C/EBPα bis -ζ bezeichnet wurden (Antonson et al. 1996, Cao et al. 1991, Hoeppner et al. 1996, Lum et al. 1990).
Alle Familienmitglieder besitzen als gemeinsames Strukturmerkmal eine C-terminal gelegene, basische Leucin-Zipper (bZIP) -Domäne (Ramji & Foka 2002). Die Sequenzidentität der bZIP-Domäne ist bei den C/EBP-Familienmitgliedern sehr hoch und beträgt über 90 % (Ramji & Foka 2002). Die Domäne ist für die DNA-Bindung sowie für Protein-Protein-Interaktionen durch Dimerisierung verantwortlich (Landschulz et al. 1988b, Vinson et al. 1989). Die C/EBP-Familienmitglieder können, wie andere bZIP-Transkriptionsfaktoren auch, Homo- und Heterodimere bilden (Landschulz et al.
1988b, Newman & Keating 2003, Vinson et al. 1993), wodurch ihre Aktivität und Sequenzspezifität beeinflusst werden kann (Tsukada et al. 2011). Für die C/EBP-Proteine wurden in diesem Zusammenhang sowohl intra- als auch interfamiliäre Paarungen beobachtet (siehe Abschnitt 1.5.3).
Neben der hochkonservierten bZIP-Domäne enthalten die C/EBP-Transkriptionsfaktoren verschiedene Transaktivierungs- und negativ-regulatorische Domänen (zsgf. in Tsukada et al. 2011).
Diese Unterschiede prägen das Wirkungsspektrum der einzelnen C/EBP-Proteine, auf die im Folgenden eingegangen werden soll.
1.4.1 Die C/EBP-Familienmitglieder in der Übersicht
Als namengebendes Mitglied der C/EBP-Familie wurde 1986 ein Protein identifiziert, das mit der DNA-Sequenz 5‘-CCAAT-3‘ interagierte: C/EBPα (Friedman et al. 1989, Graves et al. 1986, Landschulz et al. 1988a). Von C/EBPα wurden zwei Proteinisoformen mit antagonistischen Eigenschaften nachgewiesen: C/EBPα-p42 und -p30 (Lin et al. 1993). So ist C/EBPα-p42 am Proliferationsarrest während der Differenzierung zahlreicher Zelltypen beteiligt, wie z. B. bei myeloiden Progenitoren, Adipozyten, Hepatozyten sowie bei Lungen- und Plazentazellen (zsgf. in Lekstrom-Himes &
Xanthopoulos 1998). C/EBPα-p30, dem N-terminale Transaktivierungsdomänen fehlen (Ossipow et al. 1993), fördert hingegen die Proliferation (Lin et al. 1993). Das Verhältnis beider Isoformen zueinander wird in einem p42/p30-Quotienten ausgedrückt und kann sich entsprechend zellulärer Voraussetzungen (z. B. während der Differenzierung) ändern. Die Isoform, die verstärkt gebildet wird, setzt sich funktional durch (Lin et al. 1993). Außerdem ist C/EBPα wichtig für die frühe myeloide
Seite | 12 Entwicklung, indem es die Bildung von CFU-GMs aus myeloiden Progenitoren beeinflusst (Heath et al. 2004).
C/EBPα weist viele funktionale Redundanzen zu C/EBPβ auf, da beide die Konsensus-Sequenz T(T/G)NNGNAA(T/G) (N, beliebiges Nukleotid) in den Promotoren verschiedener Zielgene erkennen (Akira et al. 1990). Aufgrund seiner zentralen Bedeutung für die vorliegende Arbeit wird C/EBPβ gesondert betrachtet (siehe Abschnitt 1.4.2).
Von C/EBPδ ist bekannt, dass es zusammen mit C/EBPβ Gene der Immun- und Entzündungsreaktion reguliert (Lu et al. 2009) und die Differenzierung von Adipozyten beeinflusst (Tanaka et al. 1997). Es scheint zudem an der Aktivierung und Differenzierung von MΦ beteiligt zu sein (Hsiao et al. 2013, Ko et al. 2015, Liu et al. 2006).
C/EBPε stellt ein C/EBPδ-Paralog dar (Antonson et al. 1996, Chumakov et al. 1997). Es wird überwiegend in Zellen (und Zelllinien, darunter auch THP-1) der myelo-monozytären Reihe exprimiert (Morosetti et al. 1997), wo es unter anderem an der terminalen Differenzierung und der funktionalen Reifung von Granulozyten beteiligt ist (Yamanaka et al. 1997).
Neben den aktivierenden C/EBP-Proteinen gibt es auch trans-dominant negative Regulatoren:
C/EBP-γ/immunoglobulin enhancer-binding protein 1 (Ig/EBP-1; Roman et al. 1990) und C/EBP-ζ/ C/EBP homologous protein 10 (CHOP-10; murines Ortholog: mouse CCAAT binding factor, mCBF;
Cooper et al. 1995, Fornace Jr et al. 1989, Hoeppner et al. 1996, Lum et al. 1990, Ron & Habener 1992). So bindet zwar C/EBP-γ zusammen mit einem aktivierenden C/EBP-Familienmitglied im Promotor eines Zielgens, jedoch wird dieses nicht synthetisiert, weil C/EBP-γ keine für die Transkription erforderlichen Transaktivierungsdomänen besitzt (Cooper et al. 1995). Ist hingegen C/EBPζ der Heterodimerisierungspartner, kann der entstandene Komplex nicht im Promotor des potentiellen Zielgens binden wodurch dieses nicht transkribiert wird (Ron & Habener 1992).
1.4.2 Der Transkriptionsfaktor C/EBPβ
Der Transkriptionsfaktor C/EBPβ wurde im Jahr 1990 als ein bZIP-enthaltendes Protein mit starker C-terminaler Homologie zu C/EBPα identifiziert, das an das IL-1-Element im IL-6-Promotor gebunden war. Daher wurde es zunächst als nuclear factor for IL-6 (nukleärer Faktor für IL-6, NF-IL6) bezeichnet (Akira et al. 1990). Neben Leber-, Lungen-, Milz-, Nieren- und weiteren Gewebe- bzw. Zelltypen, wurde C/EBPβ-Protein in großen Mengen auch in myelo-monozytären Zellen, besonders in Monozyten und ausdifferenzierten MΦ nachgewiesen (Gutsch et al. 2011, Haas et al. 2010, Katz et al. 1993, Williams et al. 1991).
Bei der Transkription des CEBPB-Locus wird eine 1837 Basen-lange C/EBPβ-mRNA gebildet. Diese umfasst eine 5‘-untranslatierte Region (UTR; 195 Basen), die kodierende Sequenz (coding sequence,
Seite | 14 Bindedomäne der bZIP, so sind LAP*/LAP inaktiv (Williams et al. 1995). Weiterhin wird die Aktivität von LAP*/LAP durch LIP reguliert: Dimerisiert LIP (das keine Transaktivierungsdomänen besitzt) mit einer der großen Isoformen, unterdrückt es ihre aktivierenden Eigenschaften. LIP fungiert somit ähnlich wie C/EBPα-p30, -γ und -ζ als dominant-negativer Regulator (Descombes & Schibler 1991).
Die Hauptfunktionen von LAP*/LAP und LIP unterscheiden sich deutlich voneinander: LAP*/LAP induzieren Differenzierungsprozesse in verschiedenen Zelltypen und hemmen zugleich die Proliferation. Als Antagonist wirkt LIP proliferationsfördernd und verhindert zugleich die Differenzierung (Calkhoven et al. 2000, Gutsch et al. 2011). Je nach LAP/LIP-Verhältnis, das in der Zelle vorliegt, kommt die Funktion von LAP*/LAP bzw. von LIP zur Geltung (Descombes & Schibler 1991, Haas et al. 2010).
Die genannten funktionalen Unterschiede der C/EBPβ-Isoformen sind in den verschiedenen Entwicklungsstadien von großer Bedeutung. In proliferierenden myelo-monozytären Progenitorzellen findet man viel LIP, aber wenig LAP*/LAP. Das LAP/LIP-Verhältnis liegt in diesen Zellen deutlich auf der Seite von LIP. Je weiter die Monopoese fortschreitet, desto mehr verschiebt sich das LAP/LIP-Verhältnis zugunsten der differenzierungsfördernden Isoformen LAP*/LAP, was die Expansion der Vorläuferzellen in diesen Entwicklungsstadien unterdrückt. Dabei verringert sich der LIP-Anteil zusehends und die Proteinmengen von LAP*/LAP nehmen deutlich zu. Die LAP*/LAP-Proteinlevel erreichen im reifen Monozyten ihr Maximum und nehmen im finalen Differenzierungsschritt (der MΦ-Bildung) nicht weiter zu (Gutsch et al. 2011, Huber et al. 2012). Die Aktivität von LAP*/LAP wird hier überwiegend durch posttranslationale Modifikationen reguliert (siehe Abschnitt 1.5.3).
Die Bedeutung von C/EBPβ für die Monopoese beruht zum einen auf einen genexpressions-unabhängigen Mechanismus, nämlich einer regulatorischen Protein-Protein-Interaktion, wie sie z. B.
mit dem retinoblastoma protein Rb beobachtet wurde, wodurch dieses in einem hypo-phosphorylierten Zustand gehalten wird, was mit einer verminderten Proliferationsrate einhergeht (Gutsch et al. 2011), zum anderen induziert C/EBPβ als Transkriptionsfaktor die Synthese verschiedener Gene, was als die Hauptfunktion angesehen werden kann. So wurden C/EBPβ -Bindemotive in den Promotoren zahlreicher Gene identifiziert, die an der Hämatopoese (im Besonderen an der Monopoese), der Akut-Phase-Antwort sowie der Entzündungsreaktion beteiligt sind: C-reaktives Protein, verschiedene Zytokine (u. a. TNF, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, G-CSF, die MΦ -inflammatorischen Proteine [MIP] 1α und 1β) sowie die Rezeptoren für G-CSF, GM-CSF und M-CSF (zsgf. in Tsukada et al. 2011). Viele dieser Gene werden auch von anderen Transkriptionsfaktoren angesteuert, allerdings können sie einen Verlust der C/EBPβ-Aktivität nicht vollständig kompensieren, was in C/EBPβ-knock out (C/EBPβko) -Modellen gezeigt wurde: (1) So sind C/EBPβ -defiziente Mäuse sehr empfänglich für Listeria monocytogenes. C/EBPβko-mMΦ dieser Mäuse können die Bakterien zwar phagozytieren, wegen einer mangelhaften Aktivierung aber nicht
Einleitung
Seite | 15 unschädlich machen (Tanaka et al. 1995). (2) Davon unabhängig erzeugte C/EBPβko-Mäuse weisen profunde Störungen der humoralen, angeborenen und zellulären Immunreaktion auf. Sie sind sehr empfänglich für den pathogenen Hefepilz Candida albicans (Screpanti et al. 1995). (3) Von letzteren Mäusen wurden immortalisierte C/EBPβko-mMΦ erzeugt. Die Stimulation dieser Zellen mit IFN-γ bzw.
LPS führte zu einer (mitunter) sehr veränderten Zytokinexpression im Vergleich zur WT-Kontrolle (Gorgoni et al. 2002). Aus diesen und weiteren Untersuchungen geht hervor, dass C/EBPβ im Besonderen für die terminale Monopoese und die vollständige (M2)-MΦ-Funktion wichtig ist (Ruffell et al. 2009).