Differenzierung von mBMdCs zu mMΦ: Mikroskopische Untersuchung

Die primären mBMdCs sind klein, rund und nicht adhärent. Während der mM-CSF-induzierten Differenzierung zu mMΦ wurden nach drei Tagen deutliche morphologische Veränderungen sichtbar. Die Zellen wurden zunehmend größer, adhärent, wiesen zahlreiche intrazelluläre Vesikel auf und nahmen eine spindelförmige Morphologie an. Auch konnten bereits vereinzelt Pseudopodien beobachtet werden, die ein wichtiges morphologisches Merkmal von MΦ darstellen. Die Zellen differenzierten bis Tag sieben aus und flachten dabei verstärkt ab. Die entstandenen mMΦ wiesen zahlreiche Pseudopodien auf (Abb. 3.1).

Seite | 60 THP-1-Zellen der AG Rehli wiesen im Vergleich zu den in dieser Arbeit verwendeten Zellen (AG Brand) ein leicht verändertes C/EBPβ-mRNA-Expressionsmuster auf. Die ermittelte C/EBPβ-mRNA-Menge in PMA-stimulierten Zellen (AG Rehli, 24 h) war im Vergleich zu unbehandelten Zellen zwar um Faktor 3 signifikant erhöht (n = 5; Abb. 3.5), dennoch konnte die unter differenzierenden Bedingungen beschriebene, deutliche C/EBPβ-mRNA-Mengenerhöhung nicht bestätigt werden (Pham et al. 2007).

Der Einfluss von PMA auf die C/EBPβ-mRNA-Expression in THP-1-Zellen (AG Brand) fiel somit sehr gering aus. Die C/EBPβ-mRNA-Menge war in PMA-stimulierten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen zum Zeitpunkt 24 h lediglich um Faktor 2 erhöht. Dieses Ergebnis deckt sich mit anderen Veröffentlichungen der Arbeitsgruppe (Panterodt 2015).

Hinsichtlich der C/EBPβ-mRNA-Expression reagierten THP-1-Zellen der AG Rehli nur marginal sensibler auf eine PMA-Stimulation, als die Zellen, die in dieser Arbeit verwendet wurden (AG Brand).

Obwohl sich in PMA-stimulierten THP-1-Zellen die C/EBPβ-mRNA-Menge kaum erhöhte, wurde in diesen Zellen eine starke C/EBPβ-LAP*/LAP-Proteinzunahme nachgewiesen. Dies bestätigt frühere Ergebnisse der Arbeitsgruppe (Huber et al. 2015). Weiterhin deckt sich diese stark erhöhte LAP*/LAP-Menge im PMA-Modell mit dem Ergebnis des ex vivo-Differenzierungsexperiments (Abb. 3.3).

Der deutliche Unterschied zwischen der nahezu unveränderten C/EBPβ-mRNA und der enorm erhöhten LAP*/LAP-Proteinmenge lässt z. B. eine veränderte Translationsaktivität an der C/EBPβ -mRNA in PMA-stimulierten THP-1-Zellen im Vergleich zu naiven Zellen vermuten. Im nächsten Abschnitt soll daher die C/EBPβ-Translation näher betrachtet werden.

3.3 Die C/EBPβ-UTRs regulieren die Translation der C/EBPβ-mRNA

In vorangegangen Experimenten der Arbeitsgruppe wurde herausgearbeitet, dass der eukaryotische Translationsinitiationsfaktor eIF4B im Zusammenwirken mit dem MAPK1/2-Signalweg maßgeblich an der Translation eines exogenen C/EBPβ-V5-Reporters beteiligt ist (Panterodt 2015). eIF4B ist ein akzeleratorisches Protein, das die RNA-Helikase eIF4A dabei unterstützt mit Ziel-mRNAs zu assoziieren (Rogers et al. 2001). Die Bedeutung von eIF4B bei der erfolgreichen Proteinsynthese eines C/EBPβ-V5-Reporters lässt die Anwesenheit von komplexen mRNA-Sekundärstrukturen vermuten, die womöglich Einfluss auf die Translation der C/EBPβ-mRNA nehmen. Die Untersuchung des Einflusses der untranslatierten Regionen (UTR) auf die Translation der C/EBPβ-mRNA ist Gegenstand dieses Abschnitts.

Ergebnisse

Seite | 61 3.3.1 Die Sekundärstruktur der C/EBPβ-mRNA weist einen hohen Anteil an stabilen

Strukturen auf

Der Gesamt-GC-Anteil der C/EBPβ-mRNA ist mit 66 % verhältnismäßig hoch, in der 5’UTR beträgt er sogar 77 % (Huber et al. 2012). Lagern sich komplementäre Bereiche der RNA zusammen, bilden sich zwischen den Guanosin- und Cytosinribonukleotiden drei Wasserstoffbrückenbindungen aus. Da die C/EBPβ-mRNA eine Vielzahl dieser beiden Nukleotide enthält, ist ihre Sekundärstruktur sehr stabil und kann bei der Proteinsynthese nur schlecht vom Translationsapparat aufgelöst werden.

Zur Visualisierung dieses Problems wurde mit Hilfe des Programms The mfold Web Server (Rouillard et al. 2003) die wahrscheinlichste 2D-Struktur der C/EBPβ-mRNA-Sequenz berechnet. Es ist die 2D-Struktur dargestellt, die die niedrigste Gibbs-Energie (Freie Enthalpie; ΔG) aufwies: ΔG = –753,22 J (Abb. 3.7, auf der nächsten Seite). Die Gibbs-Energie ist hier ein Maß für die Neigung der C/EBPβ -mRNA, die berechnete 2D-Struktur anzunehmen und diese Konformation stabil beizubehalten. Die Faltung mit dem niedrigsten ΔG-Wert weist eine optimale thermodynamische Struktur auf.

In der kalkulierten 2D-Struktur der C/EBPβ-mRNA (1837 Basen) sind viele stem loops, hairpins und einige größere loops erkennbar. Die beiden erstgenannten Strukturelemente werden in der C/EBPβ -mRNA überwiegend von GC-reichen Sequenzabschnitten ausgebildet. Sie dominieren das Bild der C/EBPβ-2D-Struktur (Abb. 3.7; gepaarte, nicht-eingefärbte Bereiche).

In der Darstellung sind das 5‘- und das 3‘-Ende der C/EBPβ-mRNA dicht beieinander lokalisiert.

Zwischen dem 5‘-Ende und dem ersten Startcoden (LAP*) befindet sich die 195 Basen lange 5’UTR, welche zahlreiche stems und kleinere loops aufweist. Daran schließt sich die kodierende Region an (1038 Basen), in der sich zwei weitere Startcodons befinden. Sie bilden die Startpunkte für die C/EBPβ-Isoformen LAP und LIP. Die kodierende Region reicht bis zum UAG-Stopp-Codon, das von allen drei C/EBPβ-Isoformen gemeinsam genutzt wird. Dem Stopp-Codon folgt die 604 Basen umfassende 3’UTR, die bis zum 3‘-Ende des Moleküls reicht.

Seite | 70 Tabelle 3.2: Übersicht über mögliche Bindungspartner der C/EBPβ-3’UTR⁺⁷⁺²⁰⁶-Sequenz inklusive ihrer Binde-motive. Anhand der C/EBPβ-3‘UTR⁺⁷⁺²⁰⁶-Sequenz wurden in der RNA-binding Protein Database Proteine identi-fiziert, die als potentielle Bindungspartner für diesen 3’UTR-Bereich in Frage kommen. Es sind sechs potentielle Interaktionspartner mit ihren Bindesequenzen aufgelistet.

RBM4 RNA binding motif protein 4 /

transcriptional co-activator CoAZ CGCG 6 x

RBMX / hnRNP G

RNA binding motif protein, X chromosome /

Heterogenes nukleäres Ribonukleoprotein G CCCG 6 x

ZRANB2 / ZIS-2

zinc finger Ran binding domain-containing protein 2 /

zinc-finger, splicing 2 CGGUAA 1 x

Bei vier von den im Suchlauf gefundenen RNA-bindenden Proteinen ist derzeit bekannt, dass sie den Prozess des alternativen Spleißens beeinflussen: SLM-2, RBM4, hnRNP G sowie ZIS-2. Die beiden anderen RNA-Bindeproteine können nachweislich die Stabilität (FUBP2, HuR) bzw. den Transport (HuR) gebundener Transkripte beeinflussen. Aufgrund einer mangelnden experimentellen Grundlage müssen die potentiellen Kandidatenproteine zunächst unter Vorbehalt betrachtet werden. Eine nähere Betrachtung erfolgt in der Diskussion (Abschnitt 4.2).

Die hier vorgestellten Analysen bestärken insgesamt die Bedeutung von eIF4B (im Zusammenwirken mit der RNA-Helikase eIF4A) für die C/EBPβ-Translation. Beide eIFs sind sehr wahrscheinlich an der Auflösung von stabilen mRNA-Sekundärstrukturen beteiligt, die insbesondere im Bereich der UTRs ausgebildet werden. Der inhibitorische Effekt auf die C/EBPβ-Proteinsynthese, der von der 3’UTR ausgeht, wird vermutlich durch weitere Faktoren vermittelt, wie z. B. von den in der in silico-Analyse identifizierten RNA-Bindeproteinen (Tab. 3.2).

Diskussion

Seite | 85

4 Diskussion

4.1 C/EBPβ und die monozytäre Differenzierung

Monozyten bilden zusammen mit Makrophagen einen wichtigen Bestandteil des angeborenen Immunsystems. Der Prozess, bei dem aus prä-monozytären Zellen reife Monozyten und MΦ entstehen, wird von einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren koordiniert. Ein Bedeutender von ihnen ist C/EBPβ (zsgf. in Huber et al. 2012, Kowenz-Leutz & Leutz 1999). Wie C/EBPβ während der monozytären Differenzierung reguliert wird und welchen Einfluss die Signaltransduktion dabei hat, ist Gegenstand dieser Arbeit.

4.1.1 Die Proteinmengen von mLAP*/LAP nehmen bei der monozytären Differenzierung von primären mBMdCs deutlich zu

Anhand eines ex vivo-Differenzierungsmodells wurde die Monopoese von mBMdCs hin zu mMΦ nachempfunden. In den myeloiden Zellen konnte mittels Western-Blot-Analyse gezeigt werden, dass die Mengen der transkriptionsfördernden murinen C/EBPβ-Isoformen mLAP*/LAP während der monozytären Differenzierung deutlich erhöht waren (Abb. 3.3). Für den Versuch wurden mMΦ erzeugt, die aus mM-CSF-behandelten mBMdCs von C57BL/6J-Mäusen (WT) hervorgegangen sind.

Während der Differenzierung durchliefen die Zellen zahlreiche morphologische (Abb. 3.1) sowie stoffwechselbezogene Veränderungen, die sich auch auf molekularer Ebene nachverfolgen ließen. So nahmen bspw. die Proteinmengen von Aktin, GAPDH und Rab11 in frühen Differenzierungsstadien zu. Ab Tag vier blieben diese dann auf einem konstant hohen Niveau (Daten nicht gezeigt). Die gleichmäßige Beladung der Blot-Membranen wurde daher mittels Ponceau-Rot-Färbung bestätigt.

Die Differenzierung der primären Zellen wurde mittels Mikroskopie (Abb. 3.1) und Durchfluss-zytometrie überwacht (Abb. 3.2). Für die durchflusszytometrische Analyse der Mauszellen konnte nicht auf den „Standard“-Monozyten/MΦ-Marker CD14 zurückgegriffen werden, der bei humanen Proben untersucht wird, da murine Monozyten/MΦ sehr wenig CD14 exprimieren. Deshalb wurden andere Zellmerkmale betrachtet, nämlich die Ausprägung von CD11b und Ly6C: Aus CD11b^‒/Ly6C^‒ doppelt-negativen HSCs entwickelten sich nach mM-CSF-Gabe rasch P1-Progenitorzellen (CD11b⁺/Ly6C⁺ schwach-positiv), die über weitere Zwischenstufen zu mMΦ ausdifferenzierten (CD11b⁺⁺/Ly6C^‒; Abb. 3.2). Die beiden Oberflächenproteine genügten für die sichere Identifizierung der mMΦ sowie für ihre Abgrenzung zu Granulozyten (CD11b^‒/Ly6C⁺; Geissmann et al. 2003, 2008).

In den aus primären mBMdCs erzeugten mMΦ (Tag 7) konnte mittels Western-Blot-Analyse eindeutig mLAP*/LAP nachgewiesen werden. Frühe Differenzierungsstadien (Versuchstage 0 und 3) enthielten hingegen keine nachweisbaren mLAP*/LAP-Mengen (Abb. 3.3). Das Ergebnis legt die Vermutung nah, dass C/EBPβ während der späten MΦ-Differenzierung verstärkt synthetisiert wird

Seite | 86 und im reifen mMΦ auf einem erhöhten Proteinlevel verbleibt. In früheren Experimenten an murinen Myotuben wurde gezeigt, dass erhöhte mLAP*/LAP-Proteinmengen eine gute DNA-Bindeaktivität besaßen und zugleich die Synthese ihrer Zielgene induzierten (Wei et al. 2006). Im monozytären Differenzierungsmodell wird dies vermutlich ebenso der Fall sein. Zur Überprüfung dieser Hypothese könnte in Folgeexperimenten die mRNA-Expression von bekannten C/EBPβ -Zielgenen mittels RT-q-PCR bestimmt werden. In reifen mMΦ sollten sie gegenüber früheren Entwicklungsstadien erhöht sein. Als Kontrolle könnten C/EBPβ^ko-mMΦ verwendet werden, in denen kaum bzw. keine mRNA der untersuchten Gene nachweisbar sein sollte. Zielgene von C/EBPβ im humanen monozytären System sind zum Beispiel IL-6 (Akira et al. 1990), IL-8, Chitotriosidase/

Chitinase 1 (CHIT1) und Knorpel-Glykoprotein-39/chitinase 3-like 1 (CHI3L1; Pham et al. 2007). Von IL-8 ist bekannt, dass seine mRNA in prä-monozytären THP-1-Zellen schwach exprimiert ist, durch Stimulation mit PMA aber deutlich induziert wird (Mahmoud et al. 2014). Vergleichbares wurde auch für CHIT1 beschrieben (Pham et al. 2007). Sie müssten zunächst im Mausmodell als C/EBPβ-Zielgene verifiziert werden. Vom MΦ-induzierbaren Ca²⁺-abhängigen (C-Typ) Lektin (Mincle/Clec4e) ist bekannt, dass seine Transkription sowohl beim Menschen als auch bei Mäusen von C/EBPβ reguliert wird (Matsumoto et al. 1999). Das Gen kodiert für einen membranständigen Rezeptor, der die Kohlenhydrate Glucose und Mannose bindet und überwiegend in MΦ exprimiert wird. Mincle spielt eine wichtige Rolle für das Immunsystem, da es auch bakterielle Glykolipide wie den mykobakteriellen cord factor binden kann (Ishikawa et al. 2009). Durch direkte Interaktion mit dem FcγR stimuliert Mincle in MΦ die Produktion inflammatorischer Zytokine und Chemokine (Yamasaki et al. 2008).

4.1.2 Die C/EBPβ-Proteinmenge ist in PMA-stimulierten THP-1- und MM-6-Zellen bei nur leicht induzierter C/EBPβ-mRNA stark erhöht

Weiterführende Arbeiten zur Untersuchung der C/EBPβ-Regulation während der monozytären Differenzierung sollten mit geeigneten, besser handhabbaren Modellen erfolgen. Die Wahl fiel auf prä-monozytäre THP-1- bzw. MM-6-Zellen. Letztere weisen bereits einzelne Charakteristika von reifen Monozyten auf (Ziegler-Heitbrock et al. 1988). Beide Zelllinien gehören der monozytären Reihe an und lassen sich durch Stimulation mit PMA zu Zellen mit einem MΦ-ähnlichen Phänotyp ausdifferenzieren (Tsuchiya et al. 1982; siehe Einleitung 1.3 sowie Abb. 3.4).

Im monozytären Differenzierungsmodell wurde beobachtet, dass die C/EBPβ-mRNA nur sehr leicht erhöht war (Abb. 3.5). Ihre Menge war nach 24-stündiger PMA-Stimulation im Vergleich zu unbehandelten Zellen lediglich zweifach erhöht und nahm auch nach längerer Inkubation bis 72 h nicht weiter zu.

Diskussion

Seite | 87 Die Literaturlage ist im Hinblick PMA-vermittelter Effekte auf die C/EBPβ-mRNA-Menge nicht eindeutig. In einigen Studien wurde gezeigt, dass sie in PMA-stimulierten THP-1-Zellen nach 24 h unverändert war (FANTOM Consortium et al. 2009), während andere Studien sogar eindeutig einen Anstieg um Faktor 10 nachweisen konnten, wobei dieser erhöhte Level bis 96 h stabil blieb (Pham et al. 2007). Eine Wiederholung des Versuchs mit THP-1-Zellen, die in der letztgenannten Publikation verwendet wurden (AG Rehli), ergab, dass die Zellen tatsächlich etwas sensibler auf PMA reagierten.

Es wurde aber nur eine dreifache Zunahme der C/EBPβ-mRNA-Menge in PMA-behandelten THP-1-Zellen (AG Rehli) beobachtet, obwohl die experimentellen Bedingungen so weit wie möglich einander angeglichen wurden (Abb. 3.5). Die unterschiedliche Sensibilität der Zellen beider Arbeitsgruppen gegenüber PMA lässt sich sehr wahrscheinlich darauf zurückführen, dass es sich bei den verwendeten Zellen um zwei THP-1-Subklone handelt. Das Auftreten von Subklonen innerhalb einer vermeintlich einheitlichen und stabilen Zelllinie ist nicht ungewöhnlich. Es wurde bereits mehrfach von THP-1-Zellen berichtet, die von der Norm abweichende Eigenschaften aufwiesen (FANTOM Consortium et al. 2009, Tsuchiya et al. 1982). Dadurch wird es zum Teil erschwert, Ergebnisse aus der Literatur zu reproduzieren und richtig zu interpretieren.

Leichte Abweichungen in den Kultivierungsbedingungen könnten ebenfalls zu den unterschiedlich stark ausgeprägten Effekten beigetragen haben. So wurde in der Arbeitsgruppe um Pham (AG Rehli) RPMI1640-Medium der Firma Biochrom und FCS der Firma Invitrogen verwendet. Da das Medium weder mit Antibiotika noch mit anderen Zusätzen versetzt wurde (vergleiche diese Arbeit, Abschnitt 2.5.3), wäre insbesondere die unterschiedliche Zusammensetzung des FCS eine mögliche Ursache für die beobachteten Effekte.

Der nur leicht veränderten C/EBPβ-mRNA-Menge in differenzierenden THP-1-Zellen stand eine enorme Zunahme der LAP*/LAP-Proteinmenge gegenüber (Abb. 3.6 A). In MM-6-Zellen, die einer späteren Entwicklungsstufe als THP-1-Zellen zuzuordnen sind, wurde ebenfalls eine deutlich erhöhte LAP*/LAP-Menge nach PMA-Gabe nachgewiesen (Abb. 3.6 B). Im Gegensatz dazu wurde die murine, myeloide Progenitorzelllinie 32D nicht durch PMA beeinflusst (Abb. 3.6 C). Diesen Zellen fehlen die PKC-Isoformen α und δ (Mischak et al. 1993), die neben anderen PKC-Familienmitglieder als primäre (und bisher einzige) zelluläre Ziele von PMA identifiziert wurden (Steinberg 2008). Die Zellen sind daher PMA-resistent.

PKC-α und -δ sind in THP-1- und MM-6-Zellen vorhanden, werden PMA-abhängig aktiviert, stimulieren nachgeschaltete Signalwege und beeinflussen so auch die C/EBPβ-Expression (zsgf. in Huber et al. 2014).

Im physiologischeren ex vivo-Differenzierungsmodell bei dem mBMdCs mittels mM-CSF zu mMΦ differenziert wurden, konnte in frühen Stadien der myeloischen Reihe kein mLAP*/LAP

nach-Seite | 88 gewiesen werden (Abb. 3.3). Möglicherweise lässt sich dies auf eine geringere Expression von PKC-α und -δ zurückführen, der in Folgeexperimenten mittels Western-Blot-Analyse untersucht werden kann.

Es bleibt festzuhalten, dass in frühen Entwicklungsstadien der myeloischen Reihe kein LAP*/LAP nachgewiesen werden konnte. In reifen Mausmonozyten und mMΦ sowie in den PMA-stimulierten monozytären Zelllinien (THP-1 und MM-6) wurden hingegen große Mengen LAP*/LAP mittels Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Diese und frühere Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass C/EBPβ insbesondere für die Regugaltion der terminalen Differenzierung von Monozyten/MΦ und während der induzierten Differenzierung von THP-1- und MM-6-Zellen von Bedeutung ist.

Die oben dargestellte Diskrepanz zwischen der nur leicht beeinflussten C/EBPβ-mRNA und der starken LAP*/LAP-Proteinzunahme in PMA-stimulierten THP-1-Zellen ist durch zwei Modelle erklärbar: (1) Entweder wurde die Translation der C/EBPβ-mRNA in den stimulierten Zellen stark

erhöht, und/oder

(2) das vorhandene LAP*/LAP wurde durch einen verzögerten Abbau deutlich stabilisiert.

Im nächsten Abschnitt soll zunächst die Translation der C/EBPβ-mRNA betrachtet werden. Es wird auf die Bedeutung der C/EBPβ-UTRs eingegangen und ebenfalls beleuchtet, welchen Einfluss verschiedene Translationsinitiationsfaktoren sowie RNA-bindende Proteine auf die C/EBPβ -Protein-synthese haben.

4.2 Die Translation der C/EBPβ-mRNA wird durch endogene Sequenzabschnitte reguliert Die Untersuchung von regulatorischen Elementen innerhalb der C/EBPβ-mRNA sowie von Faktoren, die ihre Translation während der monozytären Differenzierung beeinflussen, ist für das Verständnis dieses Differenzierungsprozesses von besonderer Bedeutung. Vorangegangene interne Arbeiten zeigten, dass eIF4B, ein wichtiger Co-Faktor der RNA-Helikase eIF4A, in PMA-stimulierten THP-1-Zellen aktiviert ist, die Expression der Helikase selbst aber unbeeinflusst bleibt. Durch knock down-Experimente wurde weiterhin ersichtlich, dass eIF4B für die exogene Synthese eines C/EBPβ -FL-V5-Reporters notwendig ist (Panterodt 2015). Eine in der vorliegenden Arbeit durchgeführte in silico-Analyse offenbarte eine komplexe C/EBPβ-mRNA-2D-Struktur mit zahlreichen hairpins und stem loops, die auch in der 5‘UTR zu finden waren (Abb. 3.7). Stem loops innerhalb der 5’UTR wurden bereits als Repressoren der C/EBPβ-Translation diskutiert (Timchenko et al. 2002).

Im Kontext eines hohen GC-Anteils des CEBPB-Gens (Huber et al. 2012) lassen beide Ergebnisse vermuten, dass die Translation der C/EBPβ-mRNA durch eine komplexe und vor allem stabile

Diskussion

Seite | 89 Sekundärstruktur negativ beeinflusst wird (Chatterjee & Pal 2009), da ebendiese das scanning des Translationsapparats auf der C/EBPβ-mRNA erschwert. Daher dürfte für die erfolgreiche Translation von C/EBPβ die Funktion von eIF4B (und der RNA-Helikase eIF4A) erforderlich sein.

Es ist bekannt, dass die Bindung der 5‘-m⁷G-cap-Struktur durch eIF4E (als eine Untereinheit von eIF4F) sowie das scanning nach dem ersten Start-AUG-Codon limitierend auf die Initiation der Translation wirken (Gingras et al. 1999, Hershey & Merrick in Sonenberg et al. 2000). Um zu untersuchen welchen Einfluss die C/EBPβ-UTRs auf die mRNA-Sekundärstruktur nehmen, und dadurch möglicherweise die initialen Schritte der Translation beeinflussen, wurde eine in silico-Analyse mit den C/EBPβ-UTR-Deletionsvarianten durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die 3‘-Enden aller untersuchten Varianten sehr wahrscheinlich zu den 5‘-Enden zurückfalten und mit diesen hybridisieren (Abb. 3.7 und 3.9). An dieser Stelle muss erwähnt werden, dass eine 2D-Struktur keine Auskunft darüber gibt, welche Konformation ein Molekül im Raum annimmt. Sie bietet dafür lediglich eine gute Hilfestellung.

Desweiteren waren in der C/EBPβ-5’UTR zahlreiche stem loop und hairpin-Strukturen erkennbar (Abb. 3.7), die aufgrund ihres hohen GC-Anteils als sehr stabil angesehen werden (Timchenko et al.

2002). Daher wurde angenommen, dass die 5’UTR einen deutlich hemmenden Effekt auf die Translation ausüben müsste. C/EBPβ-Varianten, in denen die 5’UTR fehlte (C/EBPβ-Δ5’UTR, -CS), hätten demnach besser translatiert werden müssen, als solche mit vorhandener 5’UTR – auch weil bei diesen Konstrukten das Start-AUG-Codon direkt auf das 5‘-m⁷G-cap folgte (Abb. 3.9).

Transfektionsexperimente an HeLa- und THP-1-Zellen konnten den vorhergesagten, deutlichen Hemmeffekt der 5’UTR auf die C/EBPβ-Synthese nur zum Teil bestätigen. Die C/EBPβ-Δ5’UTR -Variante wurde zwar besser translatiert als das Volllängenkonstrukt C/EBPβ-FL, jedoch wurde ersichtlich, dass die 3’UTR einen größeren regulatorischen Einfluss auf die C/EBPβ-Synthese ausübte (Abb. 3.10 und 3.11 bzw. Abb. 3.12 und 3.13): Die Synthese eines C/EBPβ-V5-Reporters, der beide UTRs enthielt (C/EBPβ-FL) war stark reprimiert. Fehlte diesem die 5’UTR (C/EBPβ-Δ5’UTR, 3’UTR vorhanden), wurde er geringfügig besser zu Protein umgesetzt. Im Vergleich dazu wurde bei der Variante ohne 3’UTR (C/EBPβ-Δ3’UTR, 5’UTR vorhanden) deutlich mehr Protein nachgewiesen. Die stärkste Synthese wurde aber beim C/EBPβ-CS-V5-Konstrukt beobachtet, dem beide UTRs fehlten.

Dieses Ergebnis wurde durch die Berücksichtigung zweier unabhängiger Referenzsysteme bestätigt:

die allgemeine Transfektionseffizienz, bzw. die rel. C/EBPβ-mRNA-Menge.

Vereinfacht lässt sich der inhibitorische Effekt der C/EBPβ-UTRs auf die Synthese des V5-Reporters wie folgt darstellen:

hemmender Effekt: groß

5^′UTR + 3^′UTR (FL) > 3‘UTR (Δ5’UTR) > 5’UTR (Δ3’UTR) > CS (Δ5‘UTR/Δ3’UTR) hemmender Effekt: klein

Seite | 90 Im Vergleich zur 5’UTR hemmte die 3’UTR die Synthese des Reportes wesentlich stärker. Einen möglichen Erklärungsansatz bietet die kalkulierte 2D-Struktur der C/EBPβ-FL-mRNA (Abb. 3.9), in der zu erkennen ist, dass sich die 3’UTR sehr wahrscheinlich entlang der kodierenden Sequenz bis hin zur 5’UTR zurückfaltet und mit dieser eine komplexe Sekundärstruktur ausbildet. Es ist denkbar, dass diese Interaktion ein potentielles Hindernis für den Translationsinitiationskomplex darstellt, welches das Scannen nach dem ersten Start-AUG-Codon negativ beeinflusst. Dies könnte zur schwachen Reportersynthese beigetragen haben, die für das 5‘- und 3’UTR-enthaltende Konstrukt (C/EBPβ-FL) beobachtet wurde (Abbildungen 3.10 bis 3.13).

Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurde untersucht, welchen Einfluss die UTRs auf die C/EBPβ -Proteinsynthese haben. Diese nicht-kodierenden Abschnitte einer mRNA erfüllen üblicherweise regulatorische Aufgaben. Sie können Bindemotive für Faktoren beherbergen, welche das (alternative) Spleißen kontrollieren, das gebundene Transkript stabilisieren oder dessen Abbau fördern, die mRNA-Translokation vom Kern ins Zytoplasma vermitteln und nicht zuletzt die Trans-lationsmaschinerie rekrutieren (Mazumder et al. 2003, Pickering & Willis 2005).

Neben strukturellen bzw. sterischen Effekten sind weiterhin RNA-bindende Proteine für die Regulation der Translation von großer Bedeutung. Für C/EBPβ wurde bereits beschrieben, dass die 3’UTR mehrere AU-rich elements (AREs) enthält, welche durch das RNA-bindende Protein HuR erkannt werden können. HuR stabilisiert die C/EBPβ-mRNA, beeinflusst aber auch ihre Lokalisation innerhalb der Zelle und somit indirekt ihre Translation und die Aktivität der gebildeten Proteine (Basu et al. 2011, Cherry et al. 2008, Gantt et al. 2005).

In dieser Arbeit konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass der inhibitorische Einfluss der 3’UTR durch unterschiedliche, bisher nicht charakterisierte Abschnitte innerhalb der UTR vermittelt wird. So

In dieser Arbeit konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass der inhibitorische Einfluss der 3’UTR durch unterschiedliche, bisher nicht charakterisierte Abschnitte innerhalb der UTR vermittelt wird. So

Im Dokument Regulation des Transkriptionsfaktors C/EBPβ während monozytärer Differenzierung: Beteiligung der Proteinkinase R (Seite 70-0)