9. ANHANG
9.1.2. Vorbehandlung der Gewebeschnitte für die Immunhistochemie
Die immunhistochemisch untersuchten Schnittpräparate wurden für den Einsatz von Antikörpern vorab einer entsprechenden Vorbehandlung mit Hilfe von Ameisensäure, einer Lösung aus Methanol und Wasserstoffperoxid, ggf. einer Hitzebehandlung im Autoklaven sowie Puffermedien oder einem Proteinase K-Verdau unterzogen.
Anhang 145
Tab. 28: Übersicht zu Vorbehandlungen der Gewebeschnitte für die jeweiligen Antikörper Antikörper
Konjugate für die Untersuchungen im Immunoblot:
Ziege-anti-Maus IgG
- H- + L-Ketten-spezifisch, mit alkalischer Phosphatase gekoppelt (Dianova Hamburg)
- Verdünnung 1:3.000 in PBS-Tween Konjugate für die Immunhistochemie:
- EnVisionTM–System-HorseRadish Peroxidase Labelled Polymer Anti-mouse (Dako, Hamburg)
9.1.4. Referenzmaterialien und Kontrollen
Tab. 29: Positive Referenz- und Kontrollmaterialien (Hirnstammproben) für die proteinbio- chemischen und immunhistochemischen Untersuchungen
BSE = Bovine Spongiforme Enzephalopathie, BRD = Bundesrepublik Deutschland, FLI = Friedrich-Loeffler-Institut
146 Anhang
9.1.5. Tabellarische Übersichten zu den in Sektionen entnommen Geweben Tab. 30: Übersicht zu den entnommenen Gewebeproben des Kopfes und des Gastro- intestinaltrakts (GIT)
Proben des Kopfes Proben des Gastrointestinaltrakts (GIT)
Gl. mandibularis Lnn. lienales
Gl. parotis Lnn. colici
Gl. lacrimalis Lnn. jejunales
Ggl. nodosum Rumen
Ggl. trigeminale Reticulum
Ggl. cervicale craniale Abomasum
Ln. mandibularis Omasum
Ln. retropharyngealis medialis Duodenum
M. retractor bulbi Jejunum proximalis
M. masseter Jejunum distalis
N. opticus Ileum
N. facialis Jejunale Peyer’sche Platte
Palpebra III Ileale Peyer’sche Platte
Maulschleimhaut Ileozäkaleingang
Tonsillae Colon proximalis
Retina/Bulbus oculi Colon medialis
Zunge Rectum
Chiasma opticum Plexus pelvinus
Hypophyse Faeces
Respiratorisches Epithel Lnn. ruminales
Ggl. = Ganglion, Gl. = Glandula, Ln./Lnn.= Lymphonodus/Lymphonodi, M. = Musculus, N. = Nervus
Anhang 147
Tab. 31: Übersicht zu den entnommenen Gewebeproben des Tierkörpers Proben des Tierkörpers
Gl. suprarenalis Ggl. stellatum
Ggl. mesentericum craniale Lnn. bronchomediastinales
Ggl. coeliacum Ln. subiliacus
Lnn. iliaci mediales Lnn. cervicales superficiales
Lnn. hepatici N. radialis
Lnn. poplitei N. medianus
M. longissimus dorsi N. sympaticus
M. semitendinosus N. vagus
M. quadriceps vastus lateralis M. supraspinatus
M. triceps brachii M. biceps brachii
M. psoas major Plexus brachialis
N. phrenicus Oesophagusschleimhaut
N. splanchnicus major Pulmones
N. fibularis communis Thymus
N. ischiadicus Thyreoidea
N. saphenus Cor
Aorta Septum cordis
Hepar Medulla ossium femoralis
Lien Penis/Prostata
Ren Mamma/Ovar
Pancreas Placenta
Vesica fellea Uterus
Vesica urinaria
Ggl. = Ganglion, Gl. = Glandula, Ln./Lnn.= Lymphonodus/Lymphonodi, M. = Musculus, N. = Nervus
148 Anhang
Tab. 32: Übersicht zu den entnommenen Gewebeproben des Zentralen Nervensystems Proben des Zentralen Nervensystems
C 1 – 2 Cerebellum
C 2 – 3 Mesencephalon
C 3 – 4 Pons
C 4 – 5 Medulla oblongata (cranialer Anteil)
C 5 – 6 Obex
C 6 – 7 Medulla oblongata (caudaler Anteil)
C 7 – Th 2 Rhinencephalon
Th 2 – Th 4 Cortex frontalis
Th 4 – Th 6 Cortex parietalis
Th 6 – Th 8 Cortex occipitalis
Dorsale Wurzelganglien C1 – C6 Basalkerne
Th 9 – Th 10 Thalamus
Die Gehirne wurden paramedian geteilt oder in Einzelproben zerteilt. Das Material wurde in Probengefäßen mit 4%-igem Formalin (NBF) fixiert. C = Nn. cervicales auf Höhe der jeweiligen Vertebrae cervicales, Th = Nn. thoracales auf Höhe der jeweiligen Vertebrae thoracales, L = Nn. lumbales auf Höhe der jeweiligen Vertebrae lumbales.
9.1.6. Arzneimittel
Tab. 33: Arzneimittel zur Behandlung und Euthanasie von Ziegen der BSE-Pathogenese- studie
Präparat Wirkstoff Hersteller
Baytril (2,5%-ig) Enrofloxacin Bayer
Diazepam-Injektionslösung Diazepam Ratiopharm
Ketamin Ketaminhydrochlorid (10%-ig) Bremer Pharma GmbH
Lidocain Lidocainhydrochlorid (2%-ig) B. Braun
T61-Injektionslösung Embutramid, Mebezonium,
Tetracain Intervet Deutschland GmbH
Zink-Sandoz Zinksulfat Ratiopharm
Anhang 149
9.2. Protokolle und Methoden
9.2.1. Protokolle zur Aufarbeitung der gewonnenen Blutproben Protokoll zur Fraktionierung von caprinem Citrat-Vollblut:
Die Aufarbeitung der Blutproben erfolgte im L3**-Labor.
Gewinnung von Thrombozyten und Plasma aus Citratvollblut:
- das Mischungsverhältnis von Citratpuffer und Blut betrug 1ml zu 9 ml
- Blutproben 30 min bei 200 g und Raumtemperatur (RT) ohne Bremse zentrifugieren - thrombozytenreiches Plasma (Überstand) abnehmen
- den Überstand 10 min bei 2.000 g und RT ohne Bremse zentrifugieren - das Plasma über dem Thrombozytenpellet verwerfen, das Pellet ohne
Luft-insufflation in 2 ml 1 x PBS resuspendieren, auf zwei Reaktionsgefäße (1,5 ml) verteilen und für 5 min bei 700 g und RT zentrifugieren
- Überstand verwerfen und die gewonnenen Pellets bei -70°C lagern Gewinnung der Leukozyten (buffy coat-Zellen) aus Citratvollblut:
- Plasma über Erythrozyten abnehmen und 10 min bei 2.000 g und RT zentrifugieren - erneut das zellfreie Plasma abnehmen, aliquotieren und bei -70°C lagern
- buffy coat-Zellen über Erythrozyten abnehmen und Erythozyten-Lysepuffer
zugeben (fünffaches Volumen an Erythrozyten-Lysispuffer zur hypotonen Lyse der Erythrozyten zugeben), invertieren und 5 min bei RT inkubieren
- mit 1 x PBS auf 50 ml auffüllen und anschließend für 10 min bei 300 g und RT mit Bremse zentrifugieren
- Überstand verwerfen, Leukozytenpellet erneut in 2 ml Erythrozyten-Lysepuffer resuspendieren und dann 5 min bei RT inkubieren, mit 1 x PBS auf 50 ml auffüllen und für 10 min bei 300 g und RT zentrifugieren
- Überstand verwerfen, Pellet in 10 ml 1 x PBS resuspendieren, auf 50 ml mit 1 x PBS auffüllen und 10 min bei 300 g und RT zentrifugieren
150 Anhang
- den Überstand verwerfen, das Pellet in 6 ml 1 x PBS resuspendieren, in drei Reaktionsgefäße (2 ml) aliquotieren, 5 min bei 300 g abzentrifugieren
- erneut den Überstand verwerfen und das Leukozytenpellet bei -70°C lagern Gewinnung der Erythrozyten aus Citratvollblut:
- Erythrozyten invertieren, aliquotieren und bei -70°C lagern Protokoll zur Verarbeitung capriner Serumproben:
- Serumröhrchen nach Abnahme bei RT für 3 - 4 h stehen lassen - Röhrchen für 5 min bei 300 g und RT ohne Bremse zentrifugieren
- den Serumüberstand abnehmen für 10 min bei 2.000 g bei RT erneut zentrifugieren - den gereinigten Serumüberstand abnehmen, aliquotieren und bei -70°C lagern 9.2.2. Protokoll zur Aufarbeitung des Liquor cerebrospinalis
Die Aufarbeitung der Liquorproben erfolgte im L3**-Labor.
- entnommene Liquorproben werden für 15 min bei 4.000 g und RT ohne Bremse zentrifugiert
- den Überstand und die gewonnenen Pellets bei -70 °C getrennt lagern 9.2.3. Protokolle histologischer Methoden
9.2.3.1. Gewebeinfiltrationsautomat (Leica, ASP 300S), Standardprotokoll Formalin 30 Minuten 37°C
Ethanol 70%-ig 1 Stunde 37°C Ethanol 80%-ig 1 Stunde 37°C Ethanol 96%-ig I 1 Stunde 37°C Ethanol 96%-ig II 1 Stunde 37°C Isopropanol 96%-ig I 1 Stunde 37°C Isopropanol 96%-ig II 1 Stunde 37°C Xylol I 1 Stunde 37°C
Anhang 151
Xylol II 1 Stunde 37°C Paraffin I 1 Stunde 60°C Paraffin II 1 Stunde 60°C Paraffin III 1 Stunde 60°C 9.2.3.2. H.-E.- Färbeprotokoll
Entparaffinierung und Rehydrierung der Schnittpräparate zur Vorbereitung auf die anschließende Färbung in einer absteigenden Alkoholreihe:
Xylol I 5 min
Xylol II 5 min
Isopropanol 96%-ig I 3 min Isopropanol 96%-ig II 3 min Ethanol 96%-ig 2 min Ethanol 70%-ig 2 min Ethanol 50%-ig 2 min Hämatoxylin 10 min
4 x waschen in kaltem Leitungswasser für jeweils 5 min
Eosin 3 min
Dehydrierung in aufsteigender Alkoholreihe:
Ethanol 50%-ig 2 min Ethanol 70%-ig 2 min Ethanol 96%-ig 2 min Isopropanol 96%-ig I 2 min Isopropanol 96%-ig II 2 min
Xylol I 3 min
152 Anhang
Xylol II 3 min
Die Schnittpräparate per Hand mit Entellan eindeckeln und an der Luft trocknen.
9.2.3.3. Protokolle der Immunhistochemie
Die Entparaffinierung der Schnittpräparate zur Vorbereitung auf die anschließenden Färbungen erfolgte in einer absteigenden Alkoholreihe und wurde wie folgt durchge-führt:
Entparaffinierung und Rehydrierung in absteigender Alkoholreihe:
Xylol I 5 min Xylol II 5 min Isopropanol 96%-ig I 3 min Isopropanol 96%-ig II 3 min Ethanol 96%-ig 2 min Ethanol 70%-ig 2 min Ethanol 50%-ig 2 min Protokoll I
- 30 min Inkubation in 98-100%-iger Ameisensäure - 5 min unter fließendem kalten Leitungswasser spülen
- 30 min Inaktivierung der endogenen Peroxidase mit 3%-igem Wasserstoffperoxid versetzten Methanol
- 3 x waschen in TBS-Puffer
- 20 min Dampfautoklavierung bei 121°C und 3 bar in Citratpufferlösung (pH 6,0) - 3 x waschen in TBS-Puffer
Zum Antigennachweis wurden folgende Schritte durchgeführt:
- Überführen der Schnitte aus der Küvette in ein Cover-Plate-System
Anhang 153
- Auftragen des Primärantikörpers, Inkubation für 2 Stunden bei RT und an- schließend 3 x waschen mit TBS
- Auftragen des Sekundärantikörpers, Inkubation 30 min bei RT und anschließend 3 x waschen mit TBS
- Überführen der Schnitte in Küvetten
- Färben mit DAB-Lösung (30%-ig), 10 min inkubieren und anschließend 3 x waschen in TBS
Protokoll II
- 15 min Inkubation in 98-100%-iger Ameisensäure - 5 min unter fließendem kalten Leitungswasser spülen
- 30 min Inaktivierung der endogenen Peroxidase mit 3%-igem Wasserstoffperoxid versetzten Methanol
- 1 x spülen in TBS und anschließend 2 x 5 min in TBS-Puffer waschen
- 20 min Dampfautoklavierung bei 12°C und 3 bar in Citratpufferlösung (pH 6,0) - 2 min in TBS abkühlen, anschließend 2 x 5 min in TBS-Puffer waschen und um jedes Schnittpräparat einen PAP-Ring mit einem Dako-Pen zeichnen
- Schnitte in eine Küvette mit TBS stellen
Zum Antigennachweis wurden folgende Schritte durchgeführt:
- 20 min bei RT mit Ziegenserum blockieren, anschließend die Lösung absaugen - Auftragen des Primärantikörpers, Inkubation für 30 min bei RT und anschließend 1 x spülen in TBS und 1 x 5 min in TBS waschen
- Auftragen des biotinylierten Konjugats, 30 min bei RT inkubieren und anschließend 1 x spülen in TBS und 1 x 5 min in TBS waschen
- ABC-Lösung auftragen, 30 min bei RT inkubieren und anschließend 1 x spülen in TBS und 1 x 5 min in TBS waschen
- DAB-Lösung auftragen, 10 min bei RT inkubieren, 5 min in Leitungswasser spülen
154 Anhang
Die Gegenfärbung erfolgte für Protokoll I und II durch:
- kurzes Spülen der Schnitte in A. bidest
- 10 min Färbung in Hämatoxylinlösung und 1 x spülen in TBS, anschließend 15 min unter fließendem kalten Leitungswasser spülen
Dehydrierung in aufsteigender Alkoholreihe:
Ethanol 50%-ig 2 min Ethanol 70%-ig 2 min Ethanol 96%-ig 2 min Isopropanol 96%-ig I 2 min Isopropanol 96%-ig II 2 min Xylol I 3 min Xylol II 3 min
Die Schnittpräparate wurden per Hand oder mit Hilfe eines Eindeckelautomaten der Fa. Leica mit Entellan eingedeckelt und an der Luft getrocknet.
9.3. Auswertung von histologisch untersuchten Schnittpräparaten
Tab. 34: Bewertungsschema zur graduellen Einteilung des Ausprägungsgrades vakuolärer Veränderungen (vakuoläre Degenrationen von Neuronen, spongiforme Veränderungen des Neuropils) in den Kerngebieten der Obexregionen, in den Ganglia coeliaca und im Rückenmark (Th 7) an H.-E.-Schnittpräparaten
geringgradig + weniger als 5 Vakuolen (10-er Okular) mittelgradig ++ 5-10 Vakuolen (10-er Okular)
hochgradig +++ mehr als 10 Vakuolen (10-er Okular)
Tab. 35: Bewertungsschema zur graduellen Einteilung des Anteils PrPSc-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl der Gewebestruktur für die immunhistochemischen Unter- suchungen der Obexregionen, in den Ganglia coeliaca und im Rückenmark (Th 7)
geringgradig + einzelne positive Zellen, maximal 20 % der Gesamtzellzahl mittelgradig ++ viele positive Zellen, 20 bis maximal 60 % der Gesamtzellzahl hochgradig +++ (nahezu) alle Zellen positiv, 60 bis 100 % der Gesamtzellzahl
Anhang 155
Tab. 36: Bewertungsschema zur graduellen Einteilung des Anteils PrPSc-positiver Lymph- follikel/Ganglien an der Gesamtanzahl der untersuchten Lymphfollikel/Ganglien des lymphoretikulären Systems/Enterischen Nervensystems an IHC-Schnitt- präparaten
geringgradig + weniger als 30 % der untersuchten Lymphfollikel/Ganglien positiv mittelgradig ++ 30-50 % der untersuchten Lymphfollikel/Ganglien positiv
hochgradig +++ mehr als 50 % der untersuchten Lymphfollikel/Ganglien positiv
9.3.1. Blutentnahmen
Tab. 37: Blutentnahmen bei Jungziegen zu unterschiedlichen Beprobungszeitpunkten mit Angabe des PrP-Genotyps und der Anzahl der beprobten Tiere Tab. 38: Blutentnahmen bei adulten Ziegen zu unterschiedlichen Beprobungszeitpunkten mit Angabe des PrP-Genotyps und der Anzahl der beprobten Tiere
156 Anhang
9.3.2. Ergebnisse des FLI-Tests
Tab. 39: Ergebnisse der proteinbiochemischen Untersuchung (FLI-Test) des Hirnstamm- materials von vier Ziegen des IRQ/IRQ-Genotyps (ZG 01, ZG 33, ZG 34, ZG 38) und von drei Ziegen des IQQ/IRQ-Genotyps (ZG 05, ZG 20, ZG 28) sowie der standardisierten Referenzmaterialien
Ziegen
Anteil am Gesamtsignal (%) MM (kDa)
P4 / L42- bovine BSE = standardisierte Referenz (Nr. 7867), ovine Scrapie = standardisierte Referenz (Nr. 7865), diglyk-, monoglyk-, unglyk. = di-, mono-, unglykosylierte Form des PrPSc, MM = molekulare Masse, kDa = Kilodalton, Differenz zur Scrapie Ref. = Differenz aus molekularer Masse der unglykosylierten Form des PrPSc der Probe und der Scrapie-Referenz, Ak = Antikörper, ± = Standardabweichung, grau hinterlegt = Leerfeld
9.4. Rezepturen
9.4.1. SDS-Polyacrylamid-Gele
1. Trenngel, 16%-ig (zwei Gele) 2. Sammelgel (zwei Gele)
Aqua dest 3,00 ml Aqua dest 6,00 ml
Anhang 157
9.4.2. Verwendete Puffer und Lösungen
Der pH-Wert der Puffer und Lösungen wurde, sofern nicht anders angegeben, mit Salzsäure (rauchend, 37%-ig) eingestellt.
APS-Lösung (10 %) Assay Puffer (10x; pH 9,8)
1 g Ammoniumpersulfat 24,2 g Tris
10 ml A. dest. 2,03 g MgCl2
ad 1 l A. dest. Ad 1 l A. dest.
Blotting Puffer Bromphenolblaulösung (1 %)
3,03 g Tris 1 g Bromphenolblau
14,4 g Glycin ad 100 ml A. dest.
200 ml Methanol 2 g SDS
ad 1 l A. dest.
Citratpuffer (pH 6,0; IHC) Citratpuffer (pH 6,0; PTA-Fällung)
2,94 g Zitronensäure 21,01 g Zitronensäuremonohydrat
in 1 l Aqua dest. ad 0,1 l A. dest.
Der pH-Wert der Lösung wurde mit Natronlauge eingestellt.
CVL-Puffer (10x; pH 6,8) DAB-Lösung (pH 7,1)
2 g SDS 100 mg Diaminobenzidintetrahydrochlorid 5 ml Tris/HCl-Lösung ad 200 ml Imidazol/HCl-Puffer (0,1 M, pH
7,1)
5 ml Mercaptoethanol 70 µl H2O2
3 g Sucrose
5 Tropfen 1%-ige Bromphenolblaulösung ad 20 ml A. bidest.
Formalin (4 %; neutral gepuffert) Hämatoxylinlösung
0,9 l A. dest. 50 g Kalialaun
4 g Natriumdihydrogenphosphatmonohydrat 1 g Hämalaun
8,15 g Dinatriumhydrogenphosphat 1 g Zitronensäuremonohydrat 100 ml Formalin (37%-ig) 0,2 g Natriumiodat
ad 1 l Aqua dest.
158 Anhang
Imidazol/HCl-Puffer (0,1 M; pH 7,1) Kaliumchlorid (3 M)
1,36 g Imidazol 7,46 g Kaliumchlorid
ad 200 ml A. dest. ad 100 ml A. dest.
Lysispuffer Magermilch (5 %) 997 µl Kaliumchlorid (3 M) 5 g Magermilchpulver 500 µl Citratpuffer (pH 6, 1 M) ad 100 ml PBS-Tween 50 µl Magnesiumchlorid (1 M)
0,125 g Sarkosin ad 10 ml A. bidest.
Methanol mit 3 % H2O2 Magnesiumchloridlösung (0,1 M) 20 ml Wasserstoffperoxid, 30%-ig 2,03 g Magnesiumchloridhexahydrat
180 ml Methanol ad 100 ml A. dest.
Magnesiumchloridlösung (1 M) Natronlauge (2 M) 20,33 g Magnesiumchloridhexahydrat 80 g Natriumhydroxid
ad 100 ml A. bidest. ad 1 l A. dest.
Natriumazidlösung (10%-ig) PBS mit 4 % Sarkosyl (pH 7,4)
Natriumazid 0,65 g 10 g Sarkosyl
A. bidest ad 100 ml ad 250 ml PBS
PBS (10x) PBS mit 10 mM EDTA
400 g Natriumchlorid 3,27 g EDTA (x 2 H2O)
10 g Kaliumchlorid ad 1 l PBS
10 g Kaliumdihydrogenphosphat PBS-Tween 57,5 g Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat 1 ml Tween 20
ad 5 l A. dest. ad 1 l PBS
Pefabloc (0,1 M) Proteinase K-Gebrauchslösung
100 mg Pefabloc 760 µl Proteinase K-Stammlösung
ad 4,17 ml A. dest. 190 ml Proteinase K-Puffer (1x)
Proteinase K-Puffer (10x; pH 8,3) Proteinase K-Stammlösung (1 mg/ml)
691 mg Magnesiumchloridhexahydrat ad 10 ml A. dest.
ad 100 ml A. dest.
Der pH-Wert wurde mit Natronlauge (NaOH) eingestellt.
Sucrose-DOC-NP40-Lysis-Puffer TBS (10x; pH 7,6)
10,95 g Sucrose 60,57 g Tris
0,5 ml NP40 80 g Natriumchlorid
0,5 g DOC ad 1 l A. dest.
ad 100 ml A. dest.
Anhang 159
TBS (10 % Ziegenserum und 0,03 %
Natriumazid) Tris-Puffer
10 ml Ziegenserum (inaktiviert) 60,75 g Tris 1 300 µl Natriumazid (30%-ig) ad 1 l A. dest.
ad 100 ml TBS (1x)
Tris/HCl 1,5 M; pH 8,8 Thyroglobulin
181,71 g Tris 50 mg Thyroglobulin
Der pH-Wert wurde mit Natronlauge (NaOH) eingestellt. Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) Fluka, Sigma-Aldrich,Steinheim Dinatriumdihydrogenphosphatmonohydrat Roth, Karlsruhe
Dinatriumhydrogenphosphat, wasserfrei Roth, Karlsruhe Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat Roth, Karlsruhe
Dodecylsulfat-Natriumsalz (SDS) AppliChem, Darmstadt Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) Serva, Heidelberg F
Formalin (37%-ig) Roth, Karlsruhe
160 Anhang Natriumdihydrogenphosphatmonohydrat Roth, Karlsruhe Natriumiodat Merck, Darmstadt
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Fluka, Sigma-Aldrich,Steinheim Phosphorwolframsäure (PTA) Sigma-Aldrich, Steinheim Tris-(hydroxymethyl)-Aminomethan (Tris) Invitrogen, Karlsruhe V
VECTASTAIN Elite ABC-Peroxidase Kit,
Mouse IgG Biozol Diagnostika, Eching W
Wasserstoffperoxid (H2O2) Merck, Darmstadt X
Xylol Roth, Karlsruhe
Anhang 161
Z
Ziegenserum Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems Zitronensäuremonohydrat Fluka,Sigma-Aldrich, Steinheim 9.6. Geräte und Verbrauchsmaterialien
A Bronchioskopiezange, Chevalier-Jackson Leihgabe, TiHo Hannover Blotting-Apparatur Trans-Blot, Semi Dry BioRad, München
C
Eppendorf-Reaktionsgefäße (1,5 - 2 ml) Eppendorf, Hamburg F
162 Anhang
Magnetrührer mit Heizung CB162 Stuart VWR, Darmstadt Maulgatter H. Schein, Hamburg
Sagittalsäge incl. Sternumsägeblatt Krauth u. Timmermann, Hamburg Schlachtmesser (Dick) Lehrich, Brühl
Anhang 163
T
Thermomixer comfort Eppendorf, Hamburg Tischwaage (EW 150-JM) Kern, Balingen-Frommern Tischzentrifuge 5415 D Eppendorf, Hamburg Trimmmessergriff und -klingen Medite, Burgdorf U
Ultrazentrifuge (Optima L - 90K) Beckman, Stuttgart V
Versa Doc 5000, Imaging System BioRad, München Vortex Genie 2 Roth, Karlsruhe W
Wägeschalen Merck, Darmstadt Wärmeschrank (T6030) Heraeus, Hanau Wasserbad HI 1210 Leica, Wetzlar
Whatman-Chromatographiepapier Whatman, England, Maldstone Z
Zählkammer nach Neubauer Zeiss, Jena
Zellsieb (100 µm) BD Biosciences, Heidelberg Zuchtfutterpellets M-Z ssniff, Soest
Zusatzfuttermittel für Ziegen Vilomix Tierernährung GmbH, Oldendorf
Danksagung
Allen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, spreche ich an dieser Stelle meinen herzlichen Dank aus.
Bei Prof. Dr. Dr. h. c. T. C. Mettenleiter bedanke ich mich für die Möglichkeit meine Dissertation am Friedrich-Loeffler-Institut auf der Insel Riems anfertigen zu dürfen.
Ich bedanke mich bei Prof. Dr. M. H. Groschup für die Bereitstellung des interessanten Themas sowie für die wissenschaftliche Betreuung und Unterstützung bei der Erstellung dieser Dissertation.
PD Dr. A. Balkema-Buschmann und Herrn Balkema danke ich für die wertvollen fachlichen Anregungen und die immer gewährte Unterstützung.
Dr. C. Fast danke ich für die wissenschaftliche Betreuung bei der Anfertigung der Arbeit.
Ein weiterer Dank geht an Dr. M. Eiden für die hilfreichen Ratschläge, die diese Arbeit stets bereichert haben.
Ein Dankeschön geht an Prof. Dr. J. P. Teifke für die Bereitstellung technischer Hilfsmittel und für die interessanten Gespräche hinsichtlich Fragen der Pathologie.
Bei allen beteiligten Mitarbeitern des INNT und den Tierpflegern des BSE-Stalls möchte ich mich für die gute Zusammenarbeit und deren tatkräftiges Mitwirken bei der Durchführung der praktischen Arbeiten bedanken. B. Strohmeier, G. Priemer und J. Herger danke ich für ihre Hilfsbereitschaft und den freundschaftlichen Rückhalt.
Mein ganz persönlicher Dank gilt Dr. Susanne Niedermeyer (ehem. Freyse) und Ihrer Familie, die mit ihrer praktischen, moralischen und freundschaftlichen Unterstützung einen unschätzbaren Anteil zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
Ein besonderer Dank gilt abschließend meiner Familie, die mir stets helfend zur Seite stand und den nötigen Rückhalt vermittelte.