Immunoblot

Die in der SDS-PAGE elektrophoretisch aufgetrennten Proteine wurden mittels Immunoblot in einer Semi-Dry-Blotting-Apparatur auf eine PVDF-Membran übertragen. Die PVDF-Membran wurde zuvor für zwei Minuten in Methanol und anschließend zusammen mit dem Whatman-Chromatographiepapier sowie dem Minigel für weitere zwei Minuten inkubiert. Danach wurden zwei Lagen Whatmanpapier, die PVDF-Membran, das Gel und nochmals zwei Lagen Whatmanpapier übereinander geschichtet. Die Proteine wurden dann bei einer Spannung von 15 Volt und einer Stromstärke von 0,3 Ampère (A) pro Minigel über 45 Minuten transferiert. Im Anschluss daran wurde die PVDF-Membran in ca. 10 ml 5%-iger Magermilch in PBS-Tween für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Wipp-Inkubator inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Von den primären monoklonalen Antikörpern (mAk) P4 (89-104 shp) und der mAk L42 (145-163 shp) wurden jeweils 4,0 µg/ml in 10 ml 5%-iger Magermilch in PBS-Tween eingesetzt und die Membran in dieser Lösung eine Stunde inkubiert (Tab. 26). Für die Detektion des Histidin-markierten FLI-Markers bei der Entwicklung der Blots mit dem mAk L42 wurde als primärer Antikörper zusätzlich ein anti-Histidin-Antikörper verwendet. Dieser Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:5000 in

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5%-iger Magermilch in PBS-Tween eingesetzt. Nachfolgend fand ein dreimaliges Waschen der Blots mit PBS-Tween für jeweils 10 Minuten statt. Im Anschluss erfolgte die einstündige Inkubation der Membran mit dem an alkalische Phosphatase gekoppelten Sekundärantikörper (Goat-anti-Mouse-Alkalische Phosphatase), der in einer Verdünnung von 1:2000 eingesetzt wurde. Nach erneutem dreimaligen Waschen mit PBS-Tween für jeweils 10 Minuten wurde die Membran für zweimal je zwei Minuten in Assaypuffer inkubiert. Dann erfolgten die Entwicklung der Membran mit ca. 1,5 ml CDP-Star für fünf Minuten und anschließend das Scannen der Membran für zwei Minuten sowie die Analyse der Ergebnisse mit Hilfe des VersaDoc Imaging Systems (BioRad).

3.3.3.1. Glykosylierungsverhältnis und molekulare Masse

Im Anschluss an den Proteinase K-Verdau wurden die Glykosylierungsverhältnisse für den Anteil der di-, mono- und unglykosylierten PrP^Sc-Fragmente am Gesamtsignal berechnet. Für diese Berechnung und die Bestimmung der molekularen Masse des PrP^Sc im Immunoblot wurden die Ergebnisse mit Hilfe der Quantity One Software im VersaDoc Imaging System ausgewertet. Voraussetzung hierfür war, dass die Signalintensität des PrP-Signals im linearen Messbereich des VersaDoc Imaging Systems zwischen 30.000 und 240.000 Zählimpulsen (counts per minute, cps) lag und damit eine Verfälschung der Messwerte durch das Auftragen einer zu stark bzw.

zu schwach konzentrierten BSE-Probe ausgeschlossen werden konnte. Die Einstellungen am VersaDoc Imaging System für die Messung und Auswertung der Immunoblots waren für alle Auswertungen gleich. Vor jeder Messung wurde durch ein Probegel die erforderliche Signalintensität bestimmt. Zur Ermittlung der molekularen Massen der erhaltenen PrP^Sc-Fragmente diente der FLI-Marker mit Bandengrößen von 23,0 kDa, 21,5 kDa, 20,3 kDa, 19,2 kDa, 18,0 kDa, 17,1 kDa und 16,2 kDa (Groschup et al., 2001) als Standardmarker. Gehirnmaterial der zu analysierenden caprinen Proben aus dieser Studie sowie eine bovine BSE-Referenz und eine ovine Scrapie-BSE-Referenz als Kontrollmaterialien (Tab. 29) wurden zur Bestimmung der Glykosylierungsverhältnisse sowie der molekularen Massen nach der PTA-Fällung zunächst auf einem Gel in jeweils gleichen Mengen aufgetragen. Zur Entwicklung der Gele wurde der Detektionsantikörper mAk L42

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verwendet. Bei einem positiven Befund wurde das Gehirnmaterial nach der PTA-Fällung in identische Volumina auf 12 Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Als positive Referenz wurden auf jedes Gel ein standardisiertes klassisches ovines Scrapie-Isolat und ein standardisiertes bovines BSE-Isolat aufgetragen. Diese wurden zuvor am Nationalen Referenzlabor (NRL) für Transmissible Spongiforme Enzephalopathien, Institut für neue und neuartige Tierseuchenerreger (INNT) am Friedrich-Loeffler-Institut (FLI) auf der Insel Riems, als eindeutig PrP^Sc-positiv bestätigt. Zudem wurde am Rand der FLI-Marker aufgetragen. Acht der Immunoblots wurden mit dem mAk L42 und die restlichen vier mit dem mAk P4 entwickelt. Nach den Messungen der Gele wurden der Mittelwert sowie die Standardabweichung (Microsoft Office Excel) für die Glykosylierungs--verhältnisse und die molekularen Massen ermittelt (FLI-Test).

3.3.3.2. Antikörperbindungsverhältnis

Neben den Glykosylierungsverhältnissen und den molekularen Massen wurden zur Differenzierung einer BSE- von einer Scrapie-Infektion die Antikörperbindungs-verhältnisse ermittelt. Das Antikörperbindungsverhältnis gilt beim FLI-Test als das stabilste und zuverlässigste der drei für die Beurteilung verwendeten biochemischen Charakteristika. Auf Grund der verschiedenen Proteinase K-Schnittstellen des BSE- und Scrapie-assoziierten PrP^Sc werden nach Verdau Bindungsepitope für monoklonale Antikörper an unterschiedlichen Regionen frei (Abb. 3). Die Schnittstelle des BSE-assoziierten PrP^Sc liegt weiter C-terminal (AS 96-97) als die des Scrapie-assoziierten PrP^Sc, dessen Schnittstelle N-terminal (AS 81-89) gelegen ist (Hope et al., 1999; Gretzschel et al., 2005). Dieser Sachverhalt wird diagnostisch im Immunoblot genutzt. Die monoklonalen Antikörper mAk L42 und mAk P4 werden nach Verdau zugesetzt. Der mAk L42 detektiert weit C-terminal in der „core“-Region des Proteins und kann sowohl BSE-assoziiertes PrP^Sc als auch Scrapie-assoziiertes PrP^Sc detektieren. Die Bindungsepitope des mAk P4 liegen bei BSE vor der Proteinase K-Schnittstelle, so dass dieser monoklonale Antikörper das Scrapie-assoziierte PrP^Sc detektiert (Gretzschel et al., 2005). Nach der Messung der Immunoblots mit Hilfe des VersaDoc Imaging Systems erfolgte die Auswertung durch

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die Quantity One Software. Aus den ermittelten Werten wurde das Verhältnis der Signalstärke vom mAk P4 zum mAk L42 berechnet.

3.3.3.3. Diskriminatorischer FLI-Immunoblot (FLI-Test)

Das nationale TSE-Referenzlabor am Friedrich-Loeffler-Institut führt seit 2004 bei jedem klassischen TSE-Befund, der beim kleinen Wiederkäuer erhoben wurde, den diskriminatorischen Immunoblot (FLI-Test) durch. Der Test dient der biochemischen Charakterisierung des pathologischen Prion-Proteins und damit der Unterscheidung zwischen BSE und Scrapie. Er basiert auf den unterschiedlichen Glykosylierungs-mustern und auf dem Vorhandensein verschiedener Proteinase K-Schnittstellen BSE- und Scrapie-assoziierter PrP^Sc-Stämme (Gretzschel et al., 2005). Zur Diskriminierung erfolgt eine Bestimmung des Antikörperbindungsverhältnisses (P4 / L42) (Kap. 3.3.3.2.), der molekularen Masse der unglykosylierten Form des PrP^Sc und der Glykosylierungsverhältnisse der drei PrP-Fraktionen (Kap. 3.3.3.1.).

PrP^Sc-Stämme werden als BSE-ähnlich definiert, wenn der FLI-Test folgende Resultate zeigt:

1. Der Anteil der diglykosylierten Form des PrP^Sc am Gesamtsignal (mAk L42) liegt über 50 %.

2. Die Differenz der molekularen Masse zwischen der unglykosylierten Form des PrP^Sc des untersuchten Isolates und der Scrapie-Referenz beträgt mehr als 0,5 kDa.

3. Das P4 / L42-Antikörperbindungsverhältnis beträgt weniger als 0,4.

Das Antikörperbindungsverhältnis (P4 / L42) liefert den entscheidenden Parameter zur Diskriminierung von BSE und Scrapie beim kleinen Wiederkäuer. Als Referenz-materialien wurden ein ovines standardisiertes klassisches Scrapie-Isolat (Nr. 7865) und ein standardisiertes bovines BSE-Isolat (Nr. 7867) mitgeführt (Tab. 29).

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