Teilergebnisse der in vivo Untersuchungen sind in der Veröffentlichung
„APPLICABILITY OF DEGRADABLE MAGNESIUM LAE442 ALLOY PLATE-SCREW-SYSTEMS IN A RABBIT MODEL” (Biomedical engineering, 2013 Sep 7, Volume 58 (Suppl. 1 Track C), DOI 10.1515/bmt-2013-4059, PMID: 24042665) publiziert, worauf einzeln verwiesen wird.
4.2.1 Klinik
In den ersten Tagen nach der Implantation entstanden bei fast allen Tieren beidseitig im Wundbereich leichte Rötungen und Schwellungen, die auf den operativen Eingriff zurückzuführen waren. Nach spätestens zehn Tagen waren diese vollständig auf der Operationsseite mit den Kontrollimplantaten abgeklungen und zumindest die Rötung auch an den Implantationsorten der Magnesiumplatten und -schrauben. Die Wund-nähte verheilten generell bei allen Tieren sehr gut und die Kontrollbeine mit Stahl-implantat verhielten sich bis zum Ende des Untersuchungszeitraums klinisch unauf-fällig. In den ersten zwei Wochen trat auf Seiten der Magnesiumplatten eine massive subkutane Gasbildung auf, die von einem leichten Emphysem bis hin zu 3 - 4 cm großen Gasblasen reichte. Besonders in den ersten zwei Wochen mussten diese mit einer kleinen Kanüle alle 2 - 3 Tage abpunktiert werden (Details s. Veröffentlichung).
Auch bei Tier 6 (La2-Platten) zeigte sich beidseitig eine subkutane Gasbildung.
Die bei allen Tieren auf den Magnesiumseiten wegen subkutaner Gasbildung (Abb.
18) durchgeführten Punktionen mussten auch nach den ersten beiden Wochen in unregelmäßigen Abständen bis zum Ende des Untersuchungszeitraums durchgeführt werden. Besonders häufig mussten Punktionen bei Tier 6 beidseits und Tier 2 auf der Magnesiumseite vorgenommen werden (Tab. 7).
56 Ergebnisse
Abb. 18: Subkutane Gasbildung (Pfeile) beim La2-Tier beidseitig an beiden Hinterbeinen (v.a.
medial über der Platte); rechtes Bild: Vergrößerung des linken Hinterbeins
Tab. 7: Gaspunktionen der Tiere auf der Mg-Implantatseite über den gesamten Untersuchungs-zeitraum
Tier 1 2 3 4 5 re 5 li 6 re 6 li
Punktionen 3x 12x 10x 7x 1x 2x 12x 12x
Eine Lahmheit Grad 2 auf dem Magnesium implantierten Bein zeigte nur Tier 3, an-sonsten äußerten alle Tiere keine Schmerzanzeichen. Ca. nach der 5. Woche waren bei einzelnen Tieren Zubildungen im Bereiche der Magnesiumplatte zu fühlen.
Besonders betraf es das Tier 2, welches 12 Wochen untersucht wurde. Diese Zubil-dungen waren bei Tier 6 (La2) recht früh beidseitig ca. nach der 2. Woche fühlbar und waren gut sichtbar nach der Euthanasie nach sechs Wochen. Beim Entfernen der Tibia wurden beidseitig extreme knochenartige Zubildungen sichtbar, die eine höhlenartige, mit Gas und Blut gefüllte Ausbuchtung über der Platte gebildet hatten (s. natives Querschnittsbild nach Explantation Abb. 19).
Zwei der Tiere mussten vorzeitig euthanasiert werden: Tier 4 (NaOH behandelte Platte), welches eigentlich 12 Wochen untersucht werden sollte, nach sechs Wochen, da die Tibia mit LAE442 Platte frakturiert war, und Tier 5 (LAE442 < 4 Wo-chen gelagert) nach vier WoWo-chen auf Grund des starken Verdachts einer mögliWo-chen Fraktur nach µCT Kontrolle im Bereich der Magnesiumplatte. Nach erfolgter Eutha-nasie (6 Wochen post OP) waren die Zubildungen zudem gut sichtbar.
Ergebnisse 57
Abb. 19: Querschnitt durch die Tibia mit La2-Platte nach der Explantation (links); rechts Ver-größerung des Übergangs von Platte zu Knochenzubildung: Gaskammer (Stern), Knochenzu-bildung (Dreieck) und Korrosion (Pfeil)
4.2.2 Radiologie
In den Röntgenbildern wurde neben der starken Gasbildung auf der Magnesiumseite auch eine teils massive periostale sowie endostale Knochenzubildung sichtbar (Abb.
20 und Tab. 8). Diese starteten bei dem La2 Tier schon nach der 2. Woche und wa-ren deutlich ausgeprägter als bei den andewa-ren Tiewa-ren. Die periostalen Zubildungen waren im Vergleich zu den endostalen stärker. Das bestraf insbesondere Tier 2 mit >
6 Monate gelagertem Material, dass über 12 Wochen untersucht wurde und ab der 3.
Woche stetig vermehrt periostale Zubildungen zeigte (weitere Details s. Veröffentli-chung). Die endostalen Veränderungen waren dagegen besonders deutlich beim La2-Tier (Abb. 20 D und Tab. 8) und Tier 2 nach 12 Wochen (score 3) und setzten meist früher ein als die periostalen. Spätestens nach Woche vier zeigte sich an der cis-Kortikalis der Magnesiumimplantatseite bei allen Tieren ein mittel-gradiger kortikaler Knochenumbau mit Lyse (Score 1 - 2). Lediglich bei Tier 5 (LAE442 Platten < 4 Wo gelagert) zeigte sich ein Score-Wert von 3 zum Zeitpunkt der vorzeitigen Euthanasie nach 4 Wochen. An der trans-Kortikalis waren hingegen keine Veränderungen festzustellen. Bei den Magnesiumbeinen war außerdem eine hochgradige Weichteilschwellung im Anfangsstadium zu beobachten (Score 3), diese ging deutlich nach den ersten vier Wochen zurück und hielt sich dann bei allen Tieren bis zum Ende der Untersuchung auf einem Score Wert von 1. An den Kon-trolltibiae mit Stahlplatten waren auch im Röntgen bis auf eine leichte
Weichteil-58 Ergebnisse
schwellung (normale Wundreaktion post operationem) im Anfangsstadium keine Veränderungen darzustellen.
Tab. 8: Semiquantitative Bewertung der in vivo Röntgenuntersuchungen (0: keine, 1: gering-, 2: mittel-, 3: hochgradige Veränderung)
Ergebnisse 59
Abb. 20: Röntgenbilder nach 6 Wochen (bzw. 4 Wochen bei C), links: anterior-posterior, rechts:
latero-lateraler Strahlengang: A = LAE442 ≥ 6 Monate gelagert, B = LAE442 NaOH behandelt, C = LAE442 ≤ 4 Wochen gelagert, D = La2 ≤ 4 Wochen gelagert, E = Stahl-Kontrolle
60 Ergebnisse
4.2.3 In vivo µ-Computertomographie
Aufgrund der sehr ähnlichen Dichten erwies es sich im XtremeCT als schwierig, die Platten sowie Schrauben zu konturieren, da diese häufig stark mit dem Knochen verwachsen waren.
Das Volumen aller Platten nahm geringfügig ab. Dies war insbesondere deutlich beim Tier 2 (> 6 Monate gelagert) zu erkennen, da die Volumenabnahme über einen Untersuchungszeitraum von 12 Wochen am auffälligsten war (Details s. Veröffentlichung). Auch das Tier 6 (La2-Platten) zeigte verglichen mit den anderen Tieren in den sechs Wochen Untersuchungszeitraum eine ausgeprägte Volumen-abnahme (Abb. 21).
Abb. 21: Volumen- und Dichteverlauf im µCT Xtreme der Platte La2, rechts: korrodierte Lanthanplatte nach sechs Wochen Implantation
Die Dichte der Platten blieb weitestgehend konstant. Leicht abweichende Dichtewer-te zeigDichtewer-te Tier 5 mit einer deutlich höheren DichDichtewer-te bei den PlatDichtewer-ten und einer deutlich niedrigen Dichte bei den Schrauben (Details s. Veröffentlichung). Tier 6 (La2) wies zunächst innerhalb der ersten zwei Wochen post operationem eine geringe Dichte-zunahme der Platten gefolgt von einer Dichteabnahme auf (Abb. 21).
Die Schrauben 1 und 3 aller Tiere zeigten keine eindeutige Tendenz innerhalb der Volumenmessungen. Bei allen Schrauben deutete sich eine Dichteabnahme an (An-hang 9.1 Abb. 32). Deutlich von den anderen Schrauben unterschieden sich die < 4
5,0
Ergebnisse 61
Wochen gelagerten Schrauben mit einer geringeren Ausgangsdichte (Details s. Veröffentlichung).
In den 2D- und 3D-Bildern sind darüber hinaus teilweise sogenannte „Nasen“, Aus-stülpungen auf den Platten, zu erkennen (Abb. 22 Kreis). Diese Bereiche weisen eine dem Knochen und dem Magnesium ähnliche Dichte auf, sind jedoch weder dem ursprünglichen Knochen noch dem Implantat zugehörig.
Abb. 22: XtremeCT der linken Tibia bei Tier 1: 2D Slice der LAE442 Platte mit „Nase“ (Kreis)
Auch mit Hilfe der Computertomographie wurde die Gasbildung am jeweiligen Im-plantat konturiert und berechnet. Aufgrund der inhomogen und diskontinuierlich durchgeführten, notwendigen Punktionen (Kapitel 4.2.1 Tab. 7) sind diese jedoch untereinander nur bedingt vergleichbar. Grundsätzlich ist jedoch ein Maximum bei allen Tieren unabhängig der implantierten Platte nach 2 Wochen zu erkennen, das im Verlauf der Implantationszeit dann wieder abnimmt (Figure 2 in der Veröffent-lichung). Exemplarisch ist die Gasfreisetzung von Tier 6 (La2) in Abb. 23 wiederge-geben. Um eine Aussage über die Form der Gasblasen treffen zu können, wurde eine Stegdickenberechnung durchgeführt. Dabei wird ermittelt, ob eher eine große oder viele kleine Gasblasen vorhanden sind. Die Auswertung zeigte, dass am Anfang eher viele kleine, im Peak nach zwei Wochen dann die größten Gasblasen vorhan-den sind. Diese verkleinerten sich bis zum Ende des Untersuchungszeitraums nur gering (Anhang 9.1 Abb. 33). Detaillierte Ergebnisse zur Gasfreisetzung der ersten fünf Tiere sind in der Veröffentlichung angeführt.
62 Ergebnisse
0 2000 4000 6000
0 2 4 6
Gasvolumen [mm³]
Untersuchungszeitraum [Wochen]
rechts links
Abb. 23: Gasvolumenverlauf von der La2-Platte im XtremeCT und Gas 3D-Bild nach 2 Wochen
4.2.4 Degradations- und Materialanalysen Ex vivo µ-Computertomographie
Im µCT80 wurde bei allen Platten eine unterschiedlich dicke Korrosionsschicht fest-gestellt (Abb. 24 Pfeile). Dabei schien sich diese vorzugsweise im craniomedialen Bereich auszubilden, also dem Bereich, der nicht direkt mit dem Knochen in Kontakt stand.
Bei den Schrauben wurden sowohl am Kopf wie auch am Gewinde deutliche Anzei-chen von Korrosion sichtbar. Die OberfläAnzei-chen der Schrauben, die den KnoAnzei-chen oder die Platte berührten, zeigten jedoch nur kaum oder gar keine Anzeichen von Korrosion. Starke Korrosion zeigten die Schraubengewinde der Schraube 4 bei Tier 1 (> 6 Monate gelagert) und der Schraube 3 bei Tier 2 (> 6 Monate gelagert Platte).
Das höchste Scoring bei der Korrosionsquantifizierung wies Tier 6 (La2) auf (vgl. Score-Auswertung Tab. 13).
Die La2-Platten unterschieden sich von den LAE442-Platten in der Korrosionsform.
Die La2-Platten wiesen ein deutlich unregelmäßigeres Korrosionsbild mit vielen ver-einzelten Mulden auf (Abb. 24 D). Dabei war die La2-Platte besonders stark medial, aber auch im craniomedialen Bereich korrodiert. Auch die La2-Schrauben 3 und 4 zeigten ein Bild starken Korrosionsangriffs, welches sich besonders deutlich an deren Gewinde abzeichnete.
5,0 mm
Ergebnisse 63
Die Auswertung der Knochenzubildung zeigte ähnliche Ergebnisse (Abb. 24). Auch hier war Tier 6 (La2) vergleichsweise am stärksten betroffen. Die periostalen Knochenzubildungen formten sich spangenartig vom Knochen nahe der Implantate über die Platte und waren bei allen Tieren caudal stärker und nahmen, wie auch die endostalen Knochenzubildungen, nach distal deutlich zu. Die endostalen Zu-bildungen waren im Vergleich mit den periostalen KnochenzuZu-bildungen geringer. Bei den ersten fünf Tieren war die Stärke der Zubildungen inhomogen bei der Aus-wertung (Score-Werte: 1 - 3), das Tier 6 (La2) zeigte ausschließlich hohe Werte (Score-Werte: 2 - 3) (vgl. Score-Auswertung Tab. 13).
Abb. 24: µCT80 Schnittbilder mit Lysezonen (Stern), Knochenzubildung (Dreieck) und Korrosion (Pfeil): A) Tier 1 (> 6 Monate gelagert); B) Tier 1 (> 6 Monate gelagert) mit Nase (Kreis); C) Tier 5 (< 4 Wochen gelagert); D) Tier 6 (La2)
64 Ergebnisse
Als weitere Auffälligkeiten konnten erkennbare Lysezonen im Bereich des Knochen-Platten-Kontakts festgestellt werden, die vermehrt cranial am Knochen auftraten.
Eine Ausnahme bildete hier Tier 6, welches keine sichtbaren Lysezonen am Knochen aufwies. Auch waren teilweise „Nasen“ wie im XtremeCT zu erkennen (Abb.
24 B Kreis und Kapitel 4.2.3).
REM und EDX
Im Rasterelektronenmikroskop Übersichtsbild der Platten vor deren Implantation (vgl.
Kapitel 3.2.7 Degradations- und Materialanalysen Abb. 9) zeigten alle Proben den Messpunkt „Matrix“. Außerdem stellten sich als „helle“ Messpunkte gewisse Bereiche mit einer Größe von ca. 5 - 20 µm, meist geraden Rändern und brüchig wirkend bei allen Platten dar (vgl. in vitro Ergebnisse 4.1.3).
Im Matrix-Bereich der Proben konnte mit 50 - 91 wt% eine hohe Konzentration von Magnesium, die besonders ausgeprägt bei der La2-Platte und bei der < 4 Wochen gelagerten Platte war, nachgewiesen werden. Hier waren lediglich geringe Anteile von Seltenen Erden und Aluminium messbar. Bei der > 6 Monate gelagerten Charge, sowohl mit als auch ohne NaOH Behandlung, konnten zusätzlich größere Anteile von Sauerstoff gemessen werden. Nur minimale Unterschiede lagen zwischen „Loch“
und „Steg“ vor: Im Messbereich „Loch“ war eine geringere Magnesiumkonzentration („Steg“ nicht unter 68 wt%, „Loch“ nicht unter 50 wt%) und eine etwas höhere Sauer-stoffkonzentration („Loch“ bis ca. 30 wt%, „Steg“ max. 20 wt%) messbar (Abb. 25 und im Anhang Kapitel 9.1 Abb. 34).
In den hellen Messpunkten zeichnete sich eine Seltene Erden und Aluminium rei-che Phase ab. Seltene Erden (inkl. Lanthan) konnten bei den LAE442 Platten in den hellen Messbereichen mit bis zu 65 wt% gemessen werden. Bei der La2-Platte war Lanthan als Seltene Erde in diesem Messpunkt mit 44 wt% vertreten (andere Seltene Erden nur in Spuren mit knapp 0,06 wt%). Bei den LAE442 Platten zeigte die < 4 Wochen gelagerte Platte die größten Anteile von Seltenen Erden verglichen mit der
> 6 Monate gelagerten Platte. Aluminium war dabei besonders bei der > 6 Monate und der < 4 Wochen gelagerten Platte mit bis zu 21 wt% stark vertreten. Bei der La2-Platte waren diese nur in Spuren messbar (max. 0,05 wt%). Die NaOH-La2-Platte
unter-Ergebnisse 65
schied sich deutlich im hellen Messpunkt von den anderen LAE442 Platten und dies besonders stark im Bereich „Loch“. Hier wurden keine Seltenen Erden und Alu-minium gemessen, dafür erhöhte Kohlen- und Sauerstoffwerte. Im „Steg“-Bereich fiel im Vergleich zu den anderen beiden LAE442-Platten eine niedrigere Aluminiumkon-zentration auf. Unterschiede hinsichtlich der lokalen Elementanreicherung zwischen
„Steg“ und „Loch“ waren sonst bis auf eine leicht höhere Magnesiumkonzentration im
„Loch“-Bereich im hellen Bereich nicht ausgeprägt. Diese „Loch“-Magnesiumkonzentration ist, verglichen mit den LAE442 Platten (< 10 wt% „Steg“;
ca. 30 wt% „Loch“), wiederum am höchsten bei der La2-Platte (ca. 50 wt%) (Abb. 25 und im Anhang Kapitel 9.1 Abb. 34).
Zusätzlich zur Matrix und zu den hellen Messpunkten wurden im Übersichtsbild in drei Proben dunkle Bereiche nachgewiesen. Diese Bereiche ließen sich bei der Platte feststellen, die länger als sechs Monate gelagert war (dort bei „Loch“ und
„Steg“) sowie im „Steg“-Bereich der NaOH behandelten Platte. Magnesium war mit max. 28 wt% in den dunklen Messpunkten zwar auffindbar, aber deutlich geringer konzentriert als in der Matrix. Auffälliger waren hohe Konzentrationen von Sauerstoff (45 - 56 %) und Kohlenstoff (bis 28 %). Anteile von Seltene Erden und Aluminium waren hingegen kaum nachweisbar. Zwischen „Loch“ und „Steg“ gab es keine erkennbaren Unterschiede (s. Anhang 9.1 Abb. 35).
Zusätzlich wurde in zwei Messungen in geringer Konzentration Mangan gemessen.
Abb. 25: In vivo Elementverteilung in Gewichtsprozent im EDX im „Steg“ Bereich: links Matrix-bereich, rechts heller Bereich (Seltene Erden exkl. Lanthan)
66 Ergebnisse
Das Mangan konnte hierbei bei der > 6 Monate gelagerten Platte mit max. 0,8 wt%
einmal im dunklen Messbereich im „Steg“-Bereich und einmal im hellen Messpunkt des „Loch“-Bereichs gefunden werden (Anhang Kapitel 9.1 Abb. 34 und Abb. 35).
ICP- Emissionsspektrometrie
Mittels ICP-OES wurden die Gehalte der Legierungselemente Lithium, Aluminium, Lanthan und zusätzlich die weiteren Seltenen Erden Cer, Neodym und Praseodym vor der Implantation ermittelt (Abb. 26). Die LAE442 legierten Platten zeigten dabei Konzentrationen von 3,28 wt% (> 6 Monate gelagert), 3,69 wt% (NaOH) und 3,71 wt% (< 4 Wochen gelagert) Lithium, fast exakt 4 wt% Aluminium und etwas mehr als 2 wt% (die < 4 Wochen gelagerte Platte sogar 2,7 wt%) Seltene Erden. Die La2- Platte wies genau 2 wt% Lanthan und ansonsten keine weiteren der oben genannten Elemente auf.
Damit sind beide Legierungen von ihrer Elementzusammensetzung einwandfrei und somit von ihrer Qualität hochwertig.
Abb. 26: Spurenelementverteilung im ICP der einzelnen Platten vor in vivo Implantation
Ergebnisse 67
4.2.5 Histologie
Teilergebnisse der histologischen Untersuchungsergebnisse wurden ebenfalls be-reits veröffentlicht (vgl. Veröffentlichung).
Die ermittelten Ergebnisse der Histologie entsprechen im Wesentlichen denen, die mittels µCT ermittelt wurden. In den histologischen Querschnitten, dargestellt in Abb.
27, waren auch hier im Bereich Platten-Schrauben-Knochen-Übergang deutliche Osteolysen festzustellen (Abb. 28), die sich vermehrt cranial darstellten.
Diese traten bei allen Tieren bis auf Tier 6 (La2) auf und waren besonders auffällig bei Tier 5 (< 4 Wochen gelagert). Bei allen Platten mit Osteolysen wurden in diesen Bereichen vereinzelt auch Osteoklasten nachgewiesen.
Des Weiteren waren deutlich die schon beim µCT erwähnten spangenartigen peri-ostalen Knochenzubildungen zu erkennen, welche sich um die Platte legten.
Besonders deutlich zeichneten sich diese bei Tier 3 (NaOH) und Tier 6 (La2) ab (Abb. 27 C und E). Endostale Knochenzubildungen und fibröses Gewebe waren we-nig ausgeprägt, wenn überhaupt um das Schraubengewinde herum zu erkennen.
Dies konnte bei Tier 2 (> 6 Monate gelagert und 12 Wochen Untersuchungszeit-raum), Tier 5 (< 4 Wochen gelagert) und Tier 6 (La2) beobachtet werden (Abb. 27 B, D und E). Auch die Kontroll-Stahl-Gliedmaßen zeigten endostale Knochenzubildun-gen und fibröses Gewebe um das Schraubengewinde, allerdings verglichen mit Tier 2, 5 und 6 deutlich ausgeprägter. Periostale Knochenzubildungen, bzw. fibröses Ge-webe waren bei den Stahlimplantaten nur gering zur Plattenlage zu erkennen, womit ein guter Platten-Knochen-Verbund gewährleistet war.
68 Ergebnisse
Abb. 27: Histologische Querschnitte unter einem Lichtmikroskop (10er Objektiv) vom Knochen und den Platten-Schrauben-Implantaten nach Implantation (A = LAE442 ≥ 6 Monate gelagert, B
= LAE442 ≥ 6 Monate gelagert (nach 12 Wochen), C = LAE442 NaOH behandelt, D = LAE442 ≤ 4 Wochen gelagert (nach 4 Wochen), E = La2 ≤ 4 Wochen, F = Stahl-Kontrolle): besonders die Knochenzubildungen und Lysezonen sind zu erkennen
Ergebnisse 69
Abb. 28: 40er Objektiv Vergrößerung der Knochenzubildung der LAE442 NaOH behandelten Platte (C) und Lysezone der LAE442 ≤ 4 Wochen gelagerten Platte (D)
70 Diskussion
5 Diskussion
Das Ziel dieser Arbeit war es, degradable Platten-Schrauben-Systeme aus Magnesiumlegierungen in vitro zu testen und auf ihre Anwendbarkeit an lasttragen-den Knochen in vivo zu überprüfen. Dafür wurden die Magnesiumlegierungen La2 sowie LAE442 mit zwei unterschiedlichen Lagerungszeiten vor Implantation ver-wendet. Als Kontrolle dienten dabei Platten und Schrauben gleicher Geometrie aus Stahl, die standardmäßig zur Frakturversorgung beim Tier eingesetzt werden. Dabei wurden vor allem die Bereiche Korrosion und Biokompatibilität im Kontakt mit dem Weichteilgewebe der Implantate untersucht.
Zur Untersuchung des Degradationsverhaltens der zu prüfenden Platten-Schrauben-Systeme wurden verschiedene Analysemethoden angewendet, dabei standen bei den in vitro Untersuchungen Gasentwicklung, Gewichtsverlust, µ-computertomographische Untersuchungen und Oberflächenanalysen im Vordergrund und bei den in vivo Versuchen klinische Untersuchungen, Röntgen, µ-Computertomographie, Oberflächenanalysen sowie die Histologie. Die in dieser Studie erzielten Ergebnisse zur Prüfung des Degradationsverhaltens und der Bio-kompatibilität der Platten- und Schrauben-Systeme sowie die angewandten Methoden werden im Folgenden kritisch diskutiert.