Weitere im Versuch erhobene Parameter

3.7.3.1 Exkremente und Einstreu

Im Laufe der Versuche wurden zu mehreren Zeitpunkten frisch abgesetzte Exkremente gesammelt, indem die Einstreu für ca. eine Stunde mit einer Plastikplane abgedeckt wurde und so die frisch abgesetzten Exkremente ohne Verunreinigung mit Einstreu gewonnen werden konnten.

Vor der experimentellen Infektion und am Ende des Versuchs (Tag 20/21 und Tag 42) wurden auf diese Weise Poolproben aller Untergruppen gewonnen. Im ersten Hauptversuch wurden in den Gruppen ohne experimentelle Infektion zusätzliche Proben in der Versuchsphase gewonnen (Tag 28 und 35). Pro Probentermin wurden drei Poolproben pro Untergruppe gewonnen (mit Ausnahme von Tag 20 im ersten Hauptversuch; hier eine Poolprobe pro Untergruppe).

In den Poolproben der Exkremente wurde der Trockensubstanzgehalt analog zur Trockensubstanzbestimmung der Futtermittelproben (siehe Kapitel 3.4.1.1) bestimmt und der Gehalt an Gesamtmuzin (siehe Kapitel 3.7.3.3) ermittelt.

Am Versuchsende (Tag 42) wurden darüber hinaus Proben der Einstreu jeder Untergruppe gewonnen. Hierzu wurden an jeweils drei verschiedenen Lokalisationen mit einem Kunststoffbecher (Ø = 6 cm) Proben ausgestanzt und diese in einem Plastikbeutel vermengt.

In dieser Poolprobe wurde schließlich der Trockensubstanzgehalt analog zur Trockensubstanzbestimmung der Futtermittelproben (siehe Kapitel 3.4.1.1) bestimmt.

3.7.3.2 Fußballengesundheit

Als ein Indikator für eine tiergerechte Haltung wurde die Fußballengesundheit an Tag 14 und Tag 42 beurteilt. Hierzu wurden die Fußballen mit lauwarmem Wasser gesäubert und mit einem Papiertuch getrocknet. Anschließend erfolgte die Beurteilung mittels eines Bewertungssystems auf der Grundlage von MAYNE et al. (2007a), modifiziert nach WEIß (2015). Dieses Bewertungssystem beurteilt die Fußballengesundheit mit Hilfe eines Scoresystems von 0 bis 7 (siehe Tabelle 16). Dabei sind bei Score 0 und 1 keine pathologischen Läsionen erkennbar, während die Scorestufen 2 bis 7 mit makroskopisch erkennbaren Veränderungen der Fußballen einhergehen (siehe Tabelle 16). Auf dieser Grundlage wurden die Tiere eingeteilt in Tiere mit gesunden Fußballen (Score 0 oder 1) und Tiere mit makroskopisch erkennbaren pathologischen Fußballenveränderungen (mindestens ein Fußballen mit einem Score ≥ 2).

Tabelle 16: Bewertungsschlüssel für die Fußballengesundheit von MAYNE et al.

(2007a), modifiziert nach WEIß (2015) Score MAYNE et al. (2007a)

Modifiziert nach WEIß (2015)

0

Keine äußerlich erkennbaren Anzeichen von FPD. Die Haut des Fußballens und der Zehenballen erscheint normal. Keine Rötung, Schwellung oder Nekrosen ersichtlich. Die Haut des Fußballens fühlt sich weich an.

Der Fußballen ist verschiebbar und flach.

1 Leichte Schwellung und/oder Rötung der Haut des Fußballens. Der Fußballen ist gewölbt und/oder gerötet.

2

Der Ballen fühlt sich härter und derber an als ein nicht betroffener Ballen. Der zentrale Teil des Ballens ist erhaben, geschwollen und gerötet. Die netzartig angeordneten Schuppen können mit größeren Zwischenräumen angeordnet sein. Die Zehenballen können gleichartige Reaktionen zeigen.

Oberflächliche Läsionen sind erkennbar.

3

Der Fuß- und die Zehenballen sind vergrößert, geschwollen und weisen rote Areale auf. Sobald sich die Haut verdichtet hat, fühlt sich der Fußballen hart an. Die netzartig angeordneten Schuppen haben sich vergrößert und separiert. Kleine schwarze Nekrosen können auftreten.

Kleine, eher punktförmige Nekrosen der Fußballenhaut.

4

Deutliche Schwellung und Rötung treten entlang der Ränder der Läsionen auf. Die netzartig angeordneten Schuppen sterben ab, werden schwarz und bilden durch Schuppen gezeichnete nekrotische Bereiche. Die Schuppen entlang der Außenseite der schwarzen Areale können weiß geworden sein. Das Ausmaß der Nekrose ist weniger als ein Achtel der Gesamtfläche des Fußballens.

Nekrosen, die weniger als ⅛ der Gesamtfläche des Fußballens umfassen.

5

Schwellung und Rötung sind am Fuß- und Zehenballen klar ersichtlich. Der gesamte Fußballen ist vergrößert. Die netzartig angeordneten Schuppen treten deutlich hervor, ihre Anzahl ist erhöht und sie sind separiert voneinander. Der Umfang der Nekrose dehnt sich bis zu einem Viertel des Fußballens aus. Kleinere Nekrosen können außerdem an den Zehenballen auftreten.

Die Nekrosen umfassen ⅛ bis ¼ der Gesamtfläche des Fußballens.

6

Siehe Kategorie 5, außer dass die Hälfte des Fußballens mit nekrotischen Zellen bedeckt ist. Die Zehenballen können jeweils zur Hälfte mit nekrotischen Zellen bedeckt sein.

Die Nekrosen umfassen ¼ bis ½ der Gesamtfläche des Fußballens.

7 Über die Hälfte des Ballens ist mit nekrotischen Schuppen bedeckt. Die Nekrosen umfassen über die Hälfte des Fußballens.

3.7.3.3 Gesamtmuzin

Der Gehalt an Gesamtmuzin in den Poolproben der Exkremente (siehe Kapitel 3.7.3.1) wurde durch Quantifizierung des in Wasser löslichen und durch Ethanol ausfällbaren Anteils der Exkremente mittels einer modifizierten Methode nach LIEN et al. (1997) und HORN et al.

(2009) bestimmt.

Vorbereitung der Proben

Die Poolproben der Exkremente wurden gefriergetrocknet, mit einer Universalmühle (M20, Fa. IKA-Werke GmbH & CO. KG, Staufen) gemahlen und anschließend die Trockensubstanz der vermahlenen Probe (TS-Gehalt(nach Vermahlen)) bestimmt (siehe Kapitel 3.4.1.1).

Bearbeitung der Proben

In einem 50 ml Zentrifugenröhrchen wurden ca. 3 g der gefriergetrockneten Probe mit 20 ml einer gekühlten NaCl-Lösung (0,15 mol NaCl und 0,02 mol NH3 pro Liter) durch Schütteln auf einem Schüttler (Reax 2000, Fa. Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach) gemischt und anschließend für 30 Sekunden homogenisiert (Dispergierer Ultra-Turrax T 25, Fa. IKA-Werke GmbH & CO. KG, Staufen). Durch Zentrifugation für 30 min bei 4 °C und 12.000 x g (Biofuge Stratos, Fa. Heraeus Holding GmbH, Hanau) wurden die unlöslichen Teile der Probe von den löslichen Teilen getrennt. Der lösliche Überstand wurde in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und durch Zugabe von 15 ml gekühltem reinen Ethanol die gelösten Muzin-Glykoproteine über Nacht bei -18 °C ausgefällt.

Durch erneutes Zentrifugieren für 10 min bei 4 °C und 1.400 x g und anschließendes Verwerfen des Überstandes wurde das Präzipitat von löslichen, in Ethanol nicht ausfällbaren Bestandteilen getrennt. Das Präzipitat wurde in 10 ml gekühlter NaCl-Lösung resuspendiert und durch Zugabe von 15 ml gekühltem Ethanol erneut über Nacht bei -18 °C ausgefällt.

Diese Arbeitsschritte, bestehend aus Zentrifugation, Resuspension des Präzipitates und erneutem Ausfällen, wurden so oft wiederholt, bis der Überstand nach der Zentrifugation ungetrübt war.

Ermittlung des Gesamtmuzingehalts

Das auf diese Weise gewaschene Pellet wurde anschließend erneut in NaCl-Lösung resuspendiert und in ein vorgewogenes 50 ml Röhrchen umgefüllt, in dem es schließlich gefriergetrocknet wurde. Durch erneute Auswaage des Röhrchens konnte der Anteil der

Muzine ermittelt werden.

Um die Rückbefeuchtung der Probe durch den Mahlprozess zu berücksichtigen, wurde zunächst ein Korrekturfaktor errechnet:

y = 100

– >ℎ(+!' %K!z+)

Mit Hilfe des Korrekturfaktors wurde schließlich der Gesamtmuzingehalt in der Trockenmasse der Exkremente errechnet:

>({$'"+K!&& | }"K+)[%] = y × ^(~*'G+)

(D$b)

× 100

3.7.4 Weitergehende Untersuchungen am Versuchsende