Der enzymatische Nachweis von Nukleinsäurehybridisierungen erfolgt meist mit Reporterenzym-Streptavidin-Konjugaten. Deshalb wurde in dieser Arbeit ein EST2-Streptavidin-Konjugat (EST2-SA) hergestellt und hinsichtlich Selektivität und Sensitivität mit dem kovalenten EST2-ODN-Konjugat verglichen.
4.3.1 Anbindung des Reporterenzyms über Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung Dabei wurde zum einen die Vier-Komponenten-Hybridisierung bestehend aus immobilisiertem Fänger-ODN, Helfer-ODN, biotinyliertem Detektor-ODN und fragmentierter 16S rRNA, zum anderen der Nachweis von enzymatisch am 5‗-Ende Biotin-markierten RNA-Fragmenten untersucht und der Vier-Komponenten-Hybridisierung unter Verwendung von EST2-ODN-Reporterkonjugat gegenübergestellt.
Hinsichtlich Selektivität wurden in dieser Arbeit keine Unterschiede zwischen der Verwendung von EST2-SA- und EST2-ODN-Konjugaten gefunden. Auch andere wissenschaftliche Arbeiten zeigten, dass unter Verwendung eines Streptavidin-AP-Konjugats selbst die nah verwandten Stämme Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis unterschieden werden können (Elsholz et al., 2006).
Innerhalb der gewählten Fängerregionen weisen beide Stämme drei Basenaustausche auf. Bei Vermeidung von unspezifischer Bindung von Streptavidin-Reporterkonjugaten auf die Goldoberfläche ist kein Einfluss auf die Spezifität zu erwarten, da das Streptavidin-Reporterenzym-Konjugat erst nach Ausbildung des Nukleinsäurehybrids im letzten Schritt zugegeben wird.
Auch die enzymatische terminale Biotin-Markierung von fragmentierter Gesamt-RNA und die anschließende elektrochemische Detektion der RNA/DNA-Hybridisierung erlaubte die selektive Detektion von etwa 104 KbE E. coli. Inwieweit dieses Markierungssystem unter Praxisbedingungen eingesetzt werden kann, ist fraglich, da bei kleinen Substratmengen, d.h. geringer rRNA-Konzentration, die enzymatische Reaktion aufgrund der Michaelis-Menten-Kinetik deutlich langsamer und ineffizient abläuft.
Der Vergleich der unterschiedlichen Nachweismethoden der Vier-Komponenten-Hybridisierung hinsichtlich Sensitivität zeigt, dass bei gleichen Bedingungen das EST2-ODN-Konjugat ein 100-fach besseres Detektionslimit im Falle der elektrochemischen Detektion als das EST2-SA-Konjugat erreichte (Tab. 4-1).
Tabelle 4-1: Vergleich der unterschiedlichen Nachweisgrenzen bei Verwendung alternativer
Die beobachtete Diskrepanz zwischen der Anbindung des Reporterenzyms über ein kovalentes EST2-ODN-Konjugat bzw. über Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung zeigt den Vorteil des kovalenten EST2-ODN-Konjugats mit dessen spezifischer Modifikations- und Kopplungschemie. Es wurde bereits gezeigt, dass eine DNA-vermittelte Immobilisierung von Reporterenzymen wesentlich sensitiver als die Anbindung über Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung ist (Niemeyer et al., 1999a;
Niemeyer et al., 1999b). Darüber hinaus kommt zum Tragen, dass das ODN-Konjugat einen wesentlich kleineren hydrodynamischen Radius aufweist als das EST2-SA-Konjugat und somit eine Detektion von 16S rRNA über einen ausgedehnten dynamischen Bereich erlaubt (s. Abschnitt 4.1). Weiterhin wurde gezeigt, dass eine Konjugation zwischen nativem Streptavidin und Fluorophoren die Bindungsaffinität für Biotin erniedrigt, da durch die zufällige Modifikation an Aminogruppen unter anderem auch der Lysin-Rest an Position 121 modifiziert wird. Dieser liegt räumlich nahe an der Ligandenbindungstasche (Cameron et al., 2001; Kwong et al., 2009).
4.3.2 16S rRNA-Nachweis mittels Stamm-Schleife-Strukturen
Der Einsatz von linearen Fängermolekülen sollte desweiteren mit der Verwendung von Fängern mit Haarnadelstruktur verglichen werden. Als Basis für dieses neuartige Nachweissystem dient dasselbe Prinzip, das dem Molecular Beacon zugrunde liegt.
Dabei kommt eine Sonde mit Stamm-Schleife-Struktur zum Einsatz, bestehend aus einer spezifischen Erkennungssequenz (Schleife), flankiert von kurzen selbstkomplementären Bereichen (Stamm). An je einem Ende des Stammes ist die Sonde mit einem Fluorophor bzw. einem Quencher markiert. Im ungebundenen Zustand hybridisieren die komplementären flankierenden Bereiche miteinander und die beiden Enden des Stammes liegen dicht beieinander, was zu einer Löschung der Fluoreszenz
des Fluorophors durch den Quencher führt. In Anwesenheit des Analyten kommt es zur Hybridisierung zwischen den komplementären Bereichen und zu einer Änderung der Konformation, wodurch die Stamm-Schleife-Struktur aufgebrochen wird. Somit befindet sich der Quencher weit vom Fluorophor entfernt und keine Löschung der Fluoreszenz tritt ein (Tyagi & Kramer 1996). Eine elektrochemische Variante dieses Ansatzes verwendet immobilisierte Stamm-Schleife-Strukturen, die an einem Ende eine Redox-Markierung tragen. Nur im geschlossenen Zustand ist die Redox-Markierung nahe genug an der Goldelektrode, um einen effektiven Elektronentransfer zu gewährleisten (Vallee-Belisle et al., 2009). Dabei handelt es sich jedoch um ein Nachweissystem, bei dem das Messsignal nach erfolgreicher Hybridisierung verschwindet („signal-off―). Grundsätzlich ist das Ziel die Entwicklung eines Biosensors, bei dem nach erfolgter Wechselwirkung zwischen biologischer Erkennungsdomäne und Analyt ein Signal entsteht („signal-on―). Letztere sind weniger störungsanfällig, da man spezifisch die Entstehung eines Messsignals beobachten kann.
Dagegen kann eine Signalauslöschung von anderen Ursachen als der gewünschten Reaktion ausgelöst werden. Deshalb sollte in dieser Arbeit ein Nachweissystem, bei welchem eine Stamm-Schleife-Struktur spezifisch für E. coli 16S rRNA immobilisiert auf der Goldelektrode vorliegt, entwickelt werden. Ein Ende des Stammes wurde mittels Thiol-Gold-Wechselwirkung auf der Elektrode immobilisiert, das andere Ende wurde mit Biotin modifiziert. In der geschlossenen Konformation ist das Biotin aufgrund der Nähe zur Goldelektrode nicht zugänglich („sterisches Quenchen―), während nach Hybridisierung und Öffnen der Stamm-Schleife-Struktur das EST2-SA-Konjugat an das nun zugängliche Biotin bindet und ein elektrochemisches Messsignal erzeugen kann.
Das Prinzip des „sterischen Quenchens― wurde erstmals von Bockisch et al. (2005) beschrieben. Dabei wurden Stamm-Schleife-Strukturen in Mikrotiterplatten immobilisiert und nach Hybridisierung mit bakterieller 16S rRNA erfolgte die Reaktion zwischen Biotin und AP-SA-Konjugat und der chemilumineszente Nachweis der Enzymreaktion. Dabei erzielten die Autoren ein Detektionslimit von 4 ng E. coli RNA, was etwa 8 x 104 KbE E. coli entspricht. Die elektrochemische Detektion von bakterieller 16S rRNA mit immobilisierten Stamm-Schleife-Strukturen ist bisher noch nicht beschrieben. Jedoch wurden diese schon für die Detektion von DNA eingesetzt.
Liu et al. (2008a) verwendeten einen Digoxigenin-markierten Molecular Beacon. Nach Hybridisierung mit zur Schleife komplementärer DNA konnte ein anti-Digoxigenin-Antikörper-HRP-Konjugat an Digoxigenin binden und der enzymatische Umsatz der Wasserstoffperoxidproduktion elektrochemisch detektiert werden. Mit diesem Ansatz wurde eine Nachweisgrenze von 10 fM synthetischer DNA erreicht. Einen ähnlichen Aufbau verwendeten Wei et al. (2008), jedoch verwendeten sie einen Fluorescein-markierten immobilisierten Molecular Beacon und zum Nachweis folglich ein anti-Fluorescein-Antikörper-HRP-Konjugat. Mit diesem Ansatz wurde eine Nachweisgrenze von 0,4 fM in vitro-transkribierter Interleukin-8 mRNA erreicht. Zusätzlich wurde der
erfolgreiche Nachweis dieser als Krebs-Biomarker dienenden mRNA in Speichel demonstriert. Nicht auf Antikörper-Antigen-Wechselwirkung, sondern auf Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung basiert der Ansatz von Mao et al. (2008). Nach Hybridisierung mit einem komplementären ODN wird der Biotin-Rest zugänglich für ein HRP-SA-Konjugat, dessen enzymatische Aktivität anschließend elektrochemisch detektiert wird.
Die Nachweisgrenze betrug 0,1 nM und ein einzelner Basenaustausch innerhalb des komplementären ODNs führte zu einem signifikanten Abfall des Signals.
Zur Validierung des auf immobilisierten DNA-Molekülen mit Stamm-Schleife-Struktur beruhenden Nachweissystems wurde die Selektivität und Sensitivität mit synthetischer komplementärer DNA überprüft. Hinsichtilich Selektivität konnte zwar eine einzelne Fehlbasenpaarung detektiert werden, jedoch betrug das Signal noch etwa 60% im Vergleich zu einem perfekt komplementären ODN. Bei Verwendung von linearen Fängersonden betrug das Signal für ein ODN, welches eine Fehlbasenpaarung aufweist, nur 40% des Signals eines perfekt komplementären ODNs. Zwei bzw. drei Fehlbasenpaarungen konnten mit der Molecular Beacon-Nachweismethode sehr gut von dem perfekt komplementären ODN unterschieden werden. Die gewählten Basenaustausche befanden sich zentral in der Schleifenregion, da für diese Position höchste Selektivität gezeigt wurde (Tsourkas et al., 2003). Eine Verbesserung der Selektivität ist durch eine Verlängerung der Stammregion erreichbar, da damit das Gleichgewicht zwischen geschlossener und offenere Konformation in Richtung geschlossener Konformation verschoben wird (Goel et al., 2005). Jedoch nimmt mit einer längeren bzw. GC-reicheren Stamm-Sequenz auch die Hybridisierungsrate drastisch ab (Tsourkas et al., 2003). Die Nachweisgrenze betrug unter Verwendung von synthetischer komplementärer DNA 200 pM. Dies entspricht dem von Mao et al. (2008) beschriebenen Detektionslimit. Andere Autoren berichten für DNA von fM Nachweisgrenzen mit immobilisierten Stamm-Schleife-Strukturen (Wei et al., 2008; Liu et al., 2008a). Jedoch verwendeten beide Gruppen im Unterschied zu dieser und der Arbeit von Mao et al. (2008) Antikörper-Antigen-Wechselwirkung zur Anbindung des Reporterenzyms. Die etablierte Nachweismethode wurde anschließend auf den direkten Nachweis von 16S rRNA aus E. coli übertragen. Wie bereits weiter oben beschrieben, mußte auch hier die Sekundärstruktur durch Fragmentierung und Helfer-ODNs aufgelöst werden. Dabei ergab sich ein Detektionslimit von 5 x 104 KbE E. coli.
Verglichen mit der rRNA/DNA-Sandwich-Hybridisierung unter Verwendung des EST2-SA-Konjugats erzielte der Nachweis bakterieller 16S rRNA mit dem Molecular Beacon ein vergleichbares Ergebnis. Dabei wurden stets Nachweisgrenzen von etwa 1 – 5 x 104 KbE E. coli erreicht (Tab. 4-1).
4.3.3 Spektralphotometrische 16S rRNA-Nachweismethode
Magnetische Mikropartikel werden verstärkt für Anwendungen in der Biosensorik und in so genannten Bio-Bar Code Assays verwendet (Gu et al., 2006; Jaffrezic-Renault et al., 2007). Magnetische Partikel besitzen einen anorganischen Kern, z. B. Eisenoxid, der von einer äußeren Schale mit bestimmten Modifikationen (langkettige organische Liganden oder Polymere) umgeben ist. In dieser Arbeit wurden Amino-modifizierte magnetische Nanopartikel verwendet, auf denen mittels des heterobifuktionellen Reagenzes sulfo-SMCC Thiol-modifizierte ODNs immobilisiert wurden. Somit konnte mit diesen magnetischen Partikeln ein einfaches spektralphotometrisches System für die Validierung der elektrochemischen 16S rRNA-Detektion entwickelt werden. Vorher für die elektrochemische Detektion gefundene Parameter wie Hybridisierungszeit oder Einfluss der 16S rRNA-Tertiärstruktur konnten mit diesem Partikel-basierten Ansatz überprüft und bestätigt werden. Ebenso war mit diesem Nachweissystem unter den vorher optimierten Hybridisierungsbedingungen ein selektiver Nachweis von E. coli 16S rRNA möglich. Der mikrobielle Nachweis mittels eines Partikel-basierten Ansatzes erreichte ein Detektionslimit für E. coli von 5 x 106 KbE. Das Fehlen des Redox-Recycling-Mechanismus und die weniger sensitive Detektionsmethode bedingen das verglichen mit den elektrochemischen Methoden schlechtere Detektionslimit. Für die direkte Detektion von relevanten Markergenen für die Bioprozessorik verwendeten Pioch et al. (2007) eine Kombination aus magnetischen Partikeln und elektrochemischer Detektion. Dabei wurden relevante mRNA-Sequenzen an auf magnetischen Partikeln immobilisierte Fängersonden gebunden und nach Hybridisierung eines Digoxigenin-markierten Detektor-ODNs erfolgte die Anbindung eines anti-Digoxigenin-Antikörper-AP-Konjugats. Nach Zugabe von Substrat wurde das Produkt p-Aminophenol auf einem Biochip mit interdigitalen Elektroden elektrochemisch detektiert. Dieser Ansatz konnte vergleichbar mit RT-PCR den Expressionsverlauf relevanter mRNAs charakterisieren.