Optimierung der Biochip-Messung

Eine spezifische und sensitive Detektion bakterieller 16S rRNA erfordert die Optimierung einer Vielzahl von Faktoren.

3.1.4.1 Immobilisierung von Fänger-Molekülen

Die Immobilisierung Thiol-modifizierter Fänger-ODNs auf der Goldelektrode ist für eine sensitive, selektive und reproduzierbare Analyse bakterieller 16S rRNA ein essentieller Faktor. Dabei spielt nicht nur die Konzentration des immobilisierten Fängers, sondern auch die Nachsättigung mit anderen Thiol-modifizierten Reagenzien eine wichtige Rolle, um mögliche unspezifische Wechselwirkungen von interferierenden Substanzen (z.B. Proteine oder Nukleinsäuren) mit der Goldoberfläche zu unterbinden.

3.1.4.1.1 Einfluss der Fängerkonzentration auf das elektrochemische Messsignal Die elektrochemische Signalstärke hängt von der zur Immobilisierung eingesetzten Fänger-ODN-Konzentration ab. Dazu wurde die Goldelektrode mit unterschiedlichen Konzentrationen an Fänger-ODN für 18 Stunden behandelt und das resultierende

Biochip-Signal nach Hybridisierung mit komplementärer 16S rRNA gemessen (Abb. 3-5).

Geringe Fängerkonzentrationen von 0,002 und 0,02 µM ergaben lediglich eine Signalstärke von etwa 7 % bzw. 12 % gegenüber einer Fängerkonzentration von 0,2 µM (100% Signalstärke). Eine weitere Steigerung der Konzentration an Fängermolekülen hatte keinen signifikanten Anstieg des Messsignals zur Folge (Abb. 3-5). Das heißt, die Goldelektrode ist mit Oligonukleotiden vollständig besetzt. Weiterhin zeigt dieses Experiment, dass eine Goldelektrode ohne Fänger unter den angewandten Bedingungen nahezu kein Messsignal (0,03 nA/sek) produziert und somit keine unspezifische Bindung des EST2-ODN-Konjugats an der Goldelektrode stattfindet.

Abbildung 3-5: Abhängigkeit des elektrochemischen Messsignals von der für die Immobilisierung eingesetzten Fängerkonzentration. Goldelektroden wurden mit den angegebenen Konzentrationen reduziertem Fänger-ODN inkubiert und anschließend mit 1 mM Oktanthiol behandelt. Das elektrochemische Signal bei Verwendung von 0,2 µM Fängerkonzentration wurde als 100% Steigung definiert.

3.1.4.1.2 Reale Fängerkonzentration auf der Goldelektrode nach Immobilisierung Das Ergebnis aus dem vorherigen Abschnitt zeigt, dass ab einer bestimmten Konzentration an Fänger-ODN die Goldelektrode vollständig gesättigt vorliegt. Daraus lässt sich aber nicht die Konzentration an immobilisierten Fängermolekülen auf der Elektrode ableiten. Um diese Fragestellung zu beantworten, wurde eine Methode, die ursprünglich zur Bestimmung der Oligonukleotidkonzentration auf Goldnanopartikeln entwickelt wurde, verwendet (Hurst et al., 2006). Das Prinzip dieser Methode ist in Abbildung 3-6 A dargestellt.

Fänger-ODNs, die am 3‗-Ende eine Thiol- und am 5‗-Ende eine Fluoresceingruppe tragen, wurden für 18 h in Kontakt mit einer gesäuberten Goldelektrode gebracht, wodurch sich die Fängeroligonukleotide an die Goldelektrode adsorbieren und nach einiger Zeit eine selbst-assemblierte Monoschicht (SAM) ausbilden. Diese Monoschicht wurde mit einem Überschuss an Mercaptoethanol für 18 Stunden behandelt, dessen

schnellere Immobilisierungskinetik eine Verdrängung der Fängeroligonukleotide zur Folge hat. Die in Lösung vorliegenden Fluorescein-markierten Fängermoleküle konnten nun mittels Fluoreszenzspektroskopie detektiert werden. Nach Erstellung einer Kalibrationsgeraden (Abb. 3-6 B) konnte eine Stoffmenge von 8,32 pmol Fänger-ODN pro cm² Goldelektrode bestimmt werden. Dies entspricht 5 x 10¹² Molekülen/cm² und in etwa der Menge an immobilisierten Fängermolekülen, die bereits mit elektrochemischen Methoden (Steel et al., 1998) bzw. mit radioaktiv markierter DNA (Boon et al., 2002b) ermittelt wurde. Dies zeigt die Zuverlässigkeit der etablierten Methode zur Bestimmung der Oberflächenbesetzung mit Fängeroligonukleotiden. Dagegen führte etwa die elektrochemische Bestimmung der Fängerkonzentration auf Goldoberflächen zu Fehlerraten von bis zu 65% innerhalb eines Experiments (Ceres et al., 2007).

Abbildung 3-6: Fluorometrische Bestimmung der immobilisierten Fängerkonzentration. (A) Nach Behandlung einer blanken Goldelektrode mit Thiol- und Fluorescein-modifizierten Fänger-ODNs (1) bildete sich auf der Elektrode eine Schicht mit Fängern aus. Diese wurden in einem weiteren Schritt (2) durch Behandlung der Elektrode mit Mercaptoethanol desorbiert und liegen anschließend in Lösung vor.

Der Fluoreszenzmesswert der Lösung erlaubte die Bestimmung der Konzentration an immobilisierten Fängermolekülen. (B) Ermittelte Standardkurve zwischen der Konzentration an Fluorescein-modifiziertem Fänger und Fluoreszenzsignal. Die Anregungswellenlänge λ_ex betrug 495 nm, während bei einer Emissionswellenlänge λ_em von 525 nm die Messung durchgeführt wurde. Die ermittelte Geradengleichung lautet y = 1433,43x + 3,23.

3.1.4.1.3 Nachsättigung mit Thiol-modifizierten Blockierungsreagenzien

Da unterschiedliche Blockierungsreagenzien Einfluss auf die Parameter Sensitivität, Selektivität und Reproduzierbarkeit ausüben können, sollte die Verwendung unterschiedlicher Reagenzien verglichen werden. Abbildung 3-7 zeigt schematisch den Effekt der Nachsättigung mit Mercaptohexanol. Eine Behandlung einer mit Fängeroligonukleotiden besetzten Elektrode mit Mercaptohexanol führte zur Entfernung unspezifisch adsorbierter Fängermoleküle. Zusätzlich stellt diese ausgebildete selbst-assemblierte Monoschicht eine Art Blockierung der Goldoberfläche gegenüber unspezifischer Bindung von Proteinen an der Goldelektrode dar (Herne & Tarlov 1997).

Abbildung 3-7: Nachsättigung einer mit Fängeroligonukleotiden besetzten Goldelektrode mit Thiol-modifizierten Reagenzien. Im ersten Schritt erfolgte die Chemisorption der Thiol-Thiol-modifizierten Fänger-ODNs an die blanke Goldelektrode für 18 h bei 25°C (1). Darauf wurde die Goldelektrode für 1 h mit einem Thiol-Reagenz – hier beispielhaft Mercaptohexanol – behandelt.

Mehrere potentielle Blockierungsreagenzien, die sich hinsichtlich ihrer funktionellen Gruppen und auch ihrer chemischen Zusammensetzung unterscheiden, wurden getestet.

In der Literatur wird vor allem die Anwendung von Mercaptohexanol (MCH) beschrieben (Herne & Tarlov 1997). In dieser Arbeit wurden weiterhin Oktanthiol (OT), oligo-Thymidin-SH (oligo-(dT)), Methyl-PEO8-NHS-Ester (PEG), Triethylenglykolmono-11-mercaptundecylether (TEG), BSA und das kommerziell erhältliche Blockierungsreagenz BlockIT verwendet.

Grundsätzlich führte die nachträgliche Behandlung der Goldelektrode mit diesen Reagenzien zu reproduzierbareren Messsignalen als ohne Behandlung (nicht gezeigt), da – wie bereits beschrieben – eine gleichmäßige Schicht an Fängermolekülen ausgebildet wurde, an die komplementäre Nukleinsäure effizient binden konnte.

Dagegen kann es ohne Nachsättigung zu stärkeren molekularen Defekten in der Fänger-Monoschicht kommen, was zu unterschiedlichen Hybridisierungseffizienzen führt (Ceres & Barton 2003; Love et al., 2005).

Der Einfluss der Nachsättigungsreagenzien ist in Abbildung 3-8 gezeigt. Die Elektroden ohne Fänger (BLANK) bzw. mit LISTERIA-Fänger gaben unabhängig vom Blockierungsreagenz kein Signal. Ohne jede Absättigung der Goldelektrode kam es dagegen zu Hintergrundsignalen von etwa 10% - 15% für diese beiden Fängermoleküle (nicht gezeigt). Die Elektrode, auf der Fängermoleküle für das mit E. coli näher

verwandte Enterobacteriaceae H. alvei immobilisiert sind, zeigte ein Signal von etwa 20 – 30% für die Nachsättigung mit BSA, MCH, oligo-(dT), OT und BlockIT, jedoch lediglich ein Signal von etwa 1% - 5% für PEG bzw. TEG. Bei keiner nachträglichen Absättigung beobachtet man für die HALVEI-Elektrode ein starkes Hintergrundsignal (nicht gezeigt).

Abbildung 3-8: Einfluss unterschiedlicher Blockierungsreagenzien auf die Selektivität der Bakterienidentifizierung mittels elektrochemischen Biochip. Gesamt-RNA aus 10⁸ KbE E. coli wurde für die Hybridisierung eingesetzt und auf Goldelektroden mit ECOLI- (schwarz), LISTERIA- (grün) und HALVEI-Fängern (gelb) bzw. unbehandelten Goldelektroden (BLANK, rot) nachgewiesen. Das Signal der ECOLI-Elektrode wurde jeweils als 100% Signal definiert.

Die hohe Spezifität für PEG ist bedingt durch eine effiziente und homogene Ausbildung einer Monoschicht aus PEG-Molekülen, die sich durch van der Waals-Wechselwirkungen und hydrophobe Waals-Wechselwirkungen anziehen (Jans et al., 2008;

Zhang et al., 2008). Dadurch wird ein Binden der Zielnukleinsäure an sehr ähnliche Fänger (HALVEI) unterbunden.

Neben PEG zeigte auch TEG eine höhere Spezifität im Vergleich zu den anderen Blockierungsreagenzien. Jedoch weist TEG neben einer Thiolgruppe am anderen Ende eine Hydroxylgruppe auf, die bei den Hybridisierungsbedingungen negativ geladen ist.

Dies hat eine abstoßende Wirkung auf die Analytnukleinsäure zur Folge, wodurch geringere Signalstärken erreicht wurden (6,47 ± 1,98 nA/sek für TEG im Vergleich zu 18,32 ± 0,51 nA/sek). Eine Nachsättigung mit PEG zeigte das beste Ergebnis in Hinblick auf Selektivität und Sensitivität.