Serienexperiment zur Validierung des elektrochemischen Nachweissystems

Nachweis von E. coli in Fleischproben erfolgen. Diese Studie wurde in Kollaboration mit dem Institut für Mikrobiologie und Biotechnologie (Prof. Gareis) am Max Rubner-Institut in Kulmbach durchgeführt.

Da die Sensitivität und Stabilität der gesamten Nachweisprozedur wesentlich von einer quantitativen RNA-Isolierung abhängt, wurden unterschiedliche Methoden in Form verschiedener Kit-Systeme verglichen (PrestoSpin R, Molzym; RNAqueous, Ambion;

Nexttec Bacteria, Nexttec; Dianova UltraClean, Dianova; RNeasy Mini Kit, Qiagen).

Hierbei zeigte der RNeasy Mini Kit von Qiagen die besten Ergebnisse. Weitere Versuche zur Optimierung der RNA-Isolierung aus Lebensmittelproben ermöglichten die Etablierung einer Dreischritt-Lyse, bestehend aus Lysozym-, Proteinase K- und Ultraschallbehandlung. Diese führte zu einer signifikanten Steigerung der RNA-Ausbeute für E. coli in Lebensmittelmatrices. Dieses wurde auch durch die erhöhte Sensitivität des E. coli-Nachweises mittels Biochip nach Anreicherung von natürlich mit E. coli kontaminiertem Fleischtropfsaft bestätigt (Heidenreich et al., 2009).

Da der 16S rRNA-Gehalt von E. coli in Abhängigkeit des physiologischen Zustandes um das bis zu zehnfache variiert und E. coli in der Lebensmittelmatrix während der Prozessierung eher suboptimale Bedingungen vorfindet, ist die Sensitivität des 16S rRNA-Direktnachweises aufgrund des vermutlich geringeren Ribosomengehaltes gegenüber exponentiell wachsenden Bakterien reduziert (Bremer & Dennis 1987). Aus diesem Grund wurde eine Anreicherung etabliert, die E. coli zum einen in die exponentielle Wachstumsphase versetzt, in der sich die höchste 16S rRNA-Konzentration in den Zellen befindet (siehe Kapitel 3.1.8.8). Zum anderen wurde die Anreicherungszeit dahingehend optimiert, dass eine hohe Sensitivität des Gesamtnachweises erreicht wird. In den Untersuchungen zur Voranreicherung stellte sich eine Anreicherung für 5 h in gepuffertem Peptonwasser als die beste der untersuchten Möglichkeiten heraus (Heidenreich et al., 2009).

Das Versuchsschema zur Validierung des gesamten Nachweissystems, bestehend aus Anreicherung, RNA-Isolation und Biochipmessung von E. coli 16S rRNA ist in Abbildung 3-25 dargestellt. Als Realproben wurden 25 Schweine- bzw.

Rindfleischproben verwendet. Das Serienexperiment wurde durch klassische mikrobiologische Analysen begleitet.

Abbildung 3-25: Versuchsaufbau der Serienexperimente zur Validierung des Gesamtnachweises von E. coli in Fleischproben. TS = Tropfsaft, G^-= Gram-negativ.

Nach fünfstündiger Anreicherung und RNA-Isolierung wurde die Gesamt-RNA in Gegenwart von immobilisierten ECOLI-Fängern, Helfer-ODN und EST2-ODN-Konjugat nachgewiesen. Als Negativ-Kontrolle wurde eine Elektrode auf dem Biochip unbehandelt gelassen.

Um einen Grenzwert für die Zuverlässigkeit der Biochip-Werte festzulegen, wurde das Biochip-Signal für eine Probe, welche keine Nukleinsäure enthält, herangezogen. Alle gemessenen elektrochemischen Signale, die den Mittelwert dieser Negativ-Probe zuzüglich deren dreifachen Standardabweichung übertrafen, wurden als signifikant betrachtet. Es zeigte sich eine relativ gute Korrelation zwischen mikrobiologisch bestimmter E. coli-Koloniezahl und elektrochemischen Messsignal (Abb. 3-26). Alle Messwerte für Keimzahlen größer 2.000 KbE E. coli nach Anreicherung konnten als signifikant angesehen werden. Im Bereich unterhalb dieses Grenzwertes ist eine sichere Aussage zur Anwesenheit von E. coli nicht möglich, da etwa der Signal-Mittelwert für eine Fleischprobe mit etwa 700 KbE/mL E. coli nach Anreicherung knapp unterhalb des ermittelten Detektionslimits liegt, wohingegen ein Tropfsaft mit etwa 500 KbE/mL E.

coli nach Anreicherung ein sicheres Messsignal produzierte.

Für 23 Fleischproben ergaben der elektrochemische Nachweis und die traditionell mikrobiologische Plattierungsmethode identische Ergebnisse. Zwei der Tropfsaft-Anreicherungen resultierten in keinem elektrochemsichen Signal ( 0 nA/sek). Das heißt, keine Analyse war im Falle des elektrochemischen Biochips falsch positiv, zwei Analysen von den 25 Proben waren falsch negativ (negativer Befund mit

elektrochemischer Methode, positives Ergebnis mittels Kultivierungsmethode).

Auffällig war, dass diese zwei falsch negativen Proben im Bereich der niedrigen Keimzahlen nach Anreicherung lagen. Dies könnte in den unterschiedlichen Probenmengen, die für den mikrobiologischen bzw. elektrochemischen Nachweis verwendet wurden, und der Ungleichverteilung der E. coli-Zellen in den Anreicherungen begründet liegen.

Abbildung 3-26: Korrelation der mikrobiologisch ermittelten Keimzahlen für E. coli nach Anreicherung mit den gemessenen elektrochemischen Biochip-Signalen. Die horizontale Linie zeigt die Nachweisgrenze (Blank + 3 x Standardabweichung) an. Das Bestimmtheitsmaß R² beträgt 0,69.

Die parallel durchgeführte Überprüfung der Selektivität des elektrochemischen Nachweissystems durch die mitgeführten Negativ-Kontrollen des Serienexperimentes zeigte, dass nahezu alle Kontrollen kein signifikantes Biochip-Signal generierten.

Lediglich jene Negativ-Kontrollen, die RNA der Tropfsaftisolate Enterobacter spp. und Pantoeae spp. isoliert aus jeweils 6 x 10⁸ KbE enthielten, erzeugten ein signifikantes Biochip-Signal. Die Kreuzreaktivität dieser Proben mit den ECOLI-Fängern beruht auf dem hohen Überschuss an Nicht-Ziel 16S rRNA. Derartige unspezifische Effekte sind auch für andere molekularbiologische Nachweissysteme beschrieben, haben aber, wie auch in diesem Fall, keine praxisrelevante Bedeutung, da derartige Überschussverhältnisse an Nicht-Ziel RNA einer einzigen Spezies nahezu nicht anzutreffen sind (Pozhitkov et al., 2007a; Rule et al., 2009). Als weitere Negativ-Kontrollen wurden Anreicherungen von Tropfsäften des Serienexperimentes verwendet, die einen mikrobiologisch negativen E. coli Befund aufwiesen (Heidenreich et al., 2009).

3.1.11.1.1 Verlässlichkeit der E. coli-Detektion

Es wurde bereits dargestellt, dass die verwendete E. coli Sonde 100% Homologie zu dem entsprechenden 16S rRNA-Bereich vieler Laborstämme aufweist. Inwieweit dies auch auf E. coli aus Fleischproben zutrifft, wurde untersucht. Hierzu wurden unter

anderem aus Fleischproben des Serienexperimentes E. coli-Stämme isoliert und die 16S rDNA sequenziert. Das Alignment der 16S rDNA-Sequenzen für unterschiedliche E.

coli-Stämme aus Fleischproben mit dem E. coli-spezifischen Fänger des Biochips (Abb.

3-27) zeigte, dass der E. coli-Stamm 163, ein Fleischproben-Isolat des MRI, 100%

Homologie zur Fängersonde aufweist. Ebenso sind die 16S rDNA weiterer Fleischtropfsaft-Isolate 100% homolog zum E. coli-spezifischen Fänger. Allerdings wurden insbesondere aus den Fleischproben des Serienexperimentes E. coli-Stämme isoliert, die im Sondenbereich Fehlbasenpaarungen aufweisen. Von den zwölf E. coli-Isolaten des Serienexperimentes zeigten lediglich fünf Isolate 100% Homologie zur E.

coli-Sonde. Dagegen wurden sieben Isolate mit Fehlbasenpaarungen gefunden.

Besonders interessant hierbei ist, dass vier der Isolate ein Sequenzmuster im Sondenbereich aufzeigten, das ebenso bei einigen pathogenen E. coli-Stämmen anzutreffen ist. Diese Isolate hatten im Sondenbereich sechs Fehlpaarungen. Dies führt aufgrund der Stringenz des Biochipnachweises dazu, dass 16S rRNA mit dieser Sequenz nicht detektiert wird. Allerdings zeigt sich im Falle einiger genomisch sequenzierter EHEC-Stämme, dass nicht alle sieben rDNA-Operons diese Sequenz tragen. So enthalten sechs Operons des EHEC-Stammes Sakai im Sondenbereich die in Abbildung 3-29 dargestellte Sequenz, ein Operon hingegen besitzt 100% Homologie zur verwendeten Sonde des Biochips. Auch in dem EHEC-Stamm EDL 933 sind beide Sequenzvariationen in den sieben rDNA-Operons enthalten.

Abbildung 3-27: Alignment der 16S rDNA-Sequenzen von E. coli-Isolaten aus Fleisch mit der E.

coli-spezifischen Sonde des Biochips. Die Sequenz der E. coli-spezifischen Sonde ist rot markiert. Die 16S rDNA-Sequenz vom Operon rrsB des E. coli O157:H7-Stammes Sakai als Beispiel für ein bei EHEC-Stämmen vorkommendes Sequenzmuster im Sondenbereich des Biochips ist ebenfalls angegeben.

3.1.12 Antibiotikanachweis durch Wachstumsselektion und 16S rRNA-Nachweis