PCR-Amplifikation

Die PCR bietet eine schnelle Möglichkeit die gewünschte Zielnukleinsäure im Probenmaterial zu vermehren. Nach PCR-Amplifikation des gewünschten genomischen Bereichs kommt es zur Hybridisierung des PCR-Amplikons mit dem immobilisierten Fänger und dem EST2-ODN-Reporterkonjugat (Abb. 3-53 A). Dies erlaubt die Detektion von genomischen Bereichen, die die Identifizierung von Mikroorganismen erlauben, z. B. von Virulenz-, Toxin- oder anderen Markergenen. Ein solches Markergen ist die β-Glucuronidase aus E. coli, welche durch das uidA-Gen kodiert wird (McDaniels et al., 1996). Innerhalb des uidA-Gens wurde ein 116 bp großes Fragment mittels PCR amplifiziert (Abb. 3-53 B) und anschließend auf einem Biochip mit Sonden komplementär zu einem Teil des Amplikons appliziert.

Eine Denaturierung des doppelsträngigen Amplikons ist für eine effiziente Hybridisierungsreaktion zwischen Fänger-ODN, PCR-Produkt und EST2-ODN-Reporterkonjugat entscheidend (Wojciechowski et al., 1999). In dieser Arbeit erfolgte die Amplifizierung eines Abschnitts des uidA-Gens zum einen in Gegenwart der beiden Primer, welche als Helfer-ODNs fungierten und somit die schnelle Reassoziation der

beiden Einzelstränge verhindern sollten. Zum anderen wurde der entsprechende Genabschnitt durch asymmetrische PCR amplifiziert, d.h. ein Primer liegt im Überschuss vor und erzeugt den gewünschten Einzelstrang in einer linearen Amplifikationsreaktion (Abb. 3-53 B). Vor der Hybridisierung auf dem Biochip wurde sowohl mit dem Produkt aus der symmetrischen als auch aus der asymmetrischen PCR ein thermischer Denaturierungsschritt durchgeführt (95°C, 5 Minuten).

Abbildung 3-53: Detektion von PCR-Produkten zur Bakterienidentifikation mittels immobilisierter Fänger und EST2-ODN-Konjugaten auf einem elektrochemisch-auslesbaren Biochip. (A) Prinzip der elektrochemischen PCR-Produkt-Detektion. Im ersten Schritt wird der entsprechende Bereich der genomischen DNA (hier uidA-Gen) mittels PCR amplifiziert (1). Im zweiten Schritt erfolgte die Drei-Komponenten-Sandwich-Hybridisierung zwischen immobilisierten Fänger-ODN, EST2-ODN-Konjugat und denaturiertem PCR-Produkt (2). (B) 2%ige Agarose-Gelelektrophorese nach PCR-Amplifikation genomischer DNA aus E. coli mit dem Primerpaar uidA_for und uidA_rev. Bahn 1 zeigt das gebildete Amplikon nach asymmetrischer PCR (uidA_rev im 50-fachen Unterschuss im Vergleich zu uidA_for).

Auf Bahn 2 ist die symmetrische PCR-Reaktion aufgetragen, während Bahn 3 eine PCR-Reaktion ohne genomisches Templat zeigt. Zur Orientierung ist ein DNA-Größenstandard (M) aufgetragen und die Banden mit 100 und 300 bp sind gekennzeichnet. Das gewünschte PCR-Produkt ist mit einem blauen Pfeil markiert.

Weiterhin wurde ein dritter Ansatz gewählt, bei dem eine symmetrische PCR in Anwesenheit eines phosphorylierten Primers durchgeführt wurde, der den nicht zu detektierenden Strang amplifiziert. Dieses PCR-Produkt wurde im Folgenden mit λ-Exonuklease verdaut, die spezifisch phosphorylierte DNA-Stränge degradiert (Mitsis &

Kwagh 1999). Der so erhaltene Einzelstrang wurde anschließend auf einem elektrochemisch-auslesbaren Biochip mit immobilisierten komplementären Fängern

appliziert und vermessen (Abb. 3-54). Aus den elektrochemischen Messungen wird ersichtlich, dass sowohl die Methode der asymmetrischen PCR mit thermischer Denaturierung als auch die Methode der symmetrsichen PCR und anschließendem λ-Exonuklease-Verdau vergleichbare Ergebnisse erzielten. Dagegen erweist sich die Methode der symmetrischen PCR und thermischer Denaturierung als sehr ineffektiv.

Diese ergibt lediglich ein Signal von etwa 1% verglichen mit der Methode der asymmetrischen PCR (Abb. 3-54). Verzichtet man auf die thermische Denaturierung im Anschluss an die symmmetrische PCR, war kein elektrochemisches Signal zu detektieren. Nach Hybridisierung einer PCR ohne Templat (E. coli genomische DNA) konnte ebenfalls kein Messsignal detektiert werden.

Abbildung 3-54: Elektrochemischer Nachweis des uidA-Amplikons mittels Hybridisierung auf Goldelektroden und Nachweis mit EST2-ODN-Reporterkonjugat. Verschiedene Denaturierungsmethoden wurden gewählt: (A) Asymmetrische PCR und thermische Denaturierung des PCR-Produkts bei 95°C für 5 min und anschließende Helfer-Bindung bei 50°C für 1 min. (B) Symmetrische PCR und thermische Denaturierung des PCR-Produkts bei 95°C für 5 min und anschließende Helfer-Bindung bei 50°C für 1 min. (C) Symmetrische PCR mit phosphoryliertem Primer, der den Gegenstrang amplifiziert und anschließendem λ-Exonuklease-Verdau des PCR-Produkts. (D) Symmetrische PCR und keine thermische Denaturierung. (E) PCR ohne genomische DNA aus E. coli (Negativ-Kontrolle). Alle Lösungen wurden anschließend auf einem Biochip mit immobilisierten Fängern, welche spezifisch das uidA-Amplikon erkennen, und in Gegenwart eines spezifischen EST2-ODN-Reporterkonjugats bei 45°C für 20 Minuten hybridisiert. Nach einem Waschschritt erfolgte die Detektion von hybridisiertem EST2-uidA-Konjugat durch Zugabe von 2 mM pAPB und Analyse des Stromverlaufs. Der elektrochemische Signalwert für die Methode (A) wurde als 100% definiert.

Da das uidA-Gen als Markergen für den Nachweis von E. coli dient, sollte diese Nachweismethode mit einigen E. coli-Stämmen getestet werden. Darüberhinaus wurde auch genomische DNA aus zwei EHEC-Stämmen, H. alvei, L. innocua und B. subtilis für die PCR eingesetzt und das Reaktionsprodukt darauf elektrochemisch charakterisiert. Alle verwendeten E. coli-Stämme produzierten ein Signal von 20 – 25 nA/sek, was die Anwesenheit des uidA-Amplikons bestätigte (Abb. 3-55 A). Dagegen

generierten keine der anderen Stämme (L. innocua, H. alvei oder B. subtilis) ein elektrochemisches Signal, da sie kein uidA-Gen in ihrem Genom besitzen. Interessant ist die Tatsache, dass bei Verwendung von genomischer DNA aus E. coli O157:H7 (EHEC) ein Signal von 10 – 13 nA/sek detektiert wurde. Dies deutet auf eine Fehlbasenpaarung im Fänger- bzw. Detektionsbereich hin. Diese Fehlbasenpaarung befindet sich am 5‗ terminalen Ende des Fänger-ODNs (vorletzte Position).

Die Sensitivität des Nachweises von E. coli mittels PCR-Amplifikation des uidA-Markergens ist in Abbildung 3-55 B dargestellt. Amplifizierte genomische DNA aus 5.000 bis etwa einer E. coli-Zelle konnte mit einem elektrochemischen Signal von etwa 20 – 25 nA/sek detektiert werden. Da es sich bei der PCR um eine Endpunktreaktion handelt, ergibt sich kein linearer Verlauf, sondern für alle Zellzahlen etwa das gleiche Signal.

Abbildung 3-55: Elektrochemische Detektion von mittels PCR-amplifiziertem Markergen (uidA) aus E. coli. (A) Selektivität des Nachweises von E. coli. Aus verschiedenen Isolaten von E. coli wurde genomische DNA isoliert und für den Nachweis verwendet. Dies waren die Isolate E. coli 163, E. coli 831, E. coli 866 und E. coli 878. Dabei handelt es sich um Praxisisolate aus der Stammsammlung des Max Rubner-Instituts. Weiterhin wurde der Laborstamm E. coli BL21 (DE3) verwendet. Bei den Proben EHEC1 und EHEC2 handelt es sich um genomische DNA aus E. coli O157:H7. Als Negativ-Kontrollen wurden weiterhin genomische DNA aus H. alvei (H.a), B. subtilis (B.s) und L. innocua (L. i) eingesetzt.

Darüber hinaus erfolgte auch die Vermessung einer PCR ohne bakterielle genomische DNA (Neg.). (B) Sensitivität der elektrochemischen Detektion von E. coli. Dabei wurde genomische DNA aus verschiedenen Zellzahlen E. coli 163 isoliert und für die PCR und den anschließenden Hybridisierungsnachweis eingesetzt. Als Reporterenzym-ODN-Konjugat wurde EST2-uidA verwendet.

Die direkte Analyse von 16S rRNA aus einigen Gram-positiven Bakterien erweist sich unter Umständen als schwierig, da die Lyse dieser Bakterien ohne Degradation der RNA nur sehr ineffizient durchgeführt werden kann. Deshalb sollte hier auch die Möglichkeit des Nachweises von B. subtilis mittels PCR-Amplifikation eines Teilbereiches der 16S rRNA-Gene und anschließender Vier-Komponenten-Sandwich-Hybridisierung getestet werden. Dazu wurde aus verschiedenen Zellzahlen von B.

subtilis genomische DNA isoliert und in die asymmetrische PCR eingesetzt. Die Entstehung eines PCR-Produkts mit einer Größe von 295 bp wurde mittels 2%iger Agarose-Gelelektrophorese kontrolliert (Abb. 3-56). Nach thermischer Denaturierung der PCR-Produkte erfolgte die Hybridisierung auf einem elektrochemisch auslesbaren Biochip mit immobilisierten BSUBTILIS-Fängern in Gegenwart von Helfer-ODN und EST2-ODN-Reporterkonjugat (EST2-UD1082).

Abbildung 3-56: Detektion von B. subtilis nach PCR-Amplifikation der 16S rRNA-Gene und Sandwich-Hybridisierung. Oben dargestellt ist die 2%ige Agarose-Gelelektrophorese von isolierter Gesamt-RNA aus den unten angegebenen B. subtilis-Zellzahlen. Links aufgetragen ist ein DNA-Größenstandard und die Fragmente mit der Größe 300, 200 und 100 bp sind gekennzeichnet. Die Größe des PCR-Produkts ist mit einem Pfeil (blau) rechts markiert. Im unteren Teil sind die elektrochemisch gemessenen Signale gegen die B. subtilis-Zellzahl aufgetragen.

Unabhängig von der zur genomischen DNA-Isolation verwendeten B. subtilis-Zellzahl liegen nach der PCR immer nahezu identische Konzentrationen an PCR-Amplikon vor (Abb. 3-56). Auffällig ist aber, dass die Signalstärken in diesem Fall nur bei etwa 1,0 bis 1,2 nA/sek liegen im Vergleich zu den mit dem uidA-Amplikon erzielten Signalen von mehr als 20 nA/sek (Abb. 3-55). Der Unterschied in den beiden Ansätzen liegt zum einem an dem Aufbau aus Fänger, Detektor und PCR-Einzelstrang beim uidA-Nachweis. Dagegen besteht der Aufbau beim 16S rRNA-Gen-Nachweis aus Fänger-, Helfer-, Detektor-ODN und einzelsträngigem PCR-Amplikon. Dies sollte einen geringen Einfluss auf die Signalstärke haben, da das Reporterenzym im zweiten Fall weiter von der Elektrode entfernt wird. Ein weiterer Unterschied zwischen den beiden Nachweismethoden sind die Längen der Amplifikate. Bei der Detektion des uidA-Gens umfasst das Amplikon genau die Länge aus Fänger und Detektor, wobei an beiden

Enden die Primer binden können. Beim Nachweis der 16S rRNA-Gene aus B. subtilis beträgt die Länge des Amplikon 295 bp, während der Bereich aus Fänger-, Helfer- und Detektor-ODN nur etwa 100 nt abdeckt.