DNA-Analytik

2.2.2.1 Konzentrationsbestimmung von DNA

Für die Berechnung des DNA-Gehalts wurde für 1 A260 eine Konzentration von 50 µg/mL doppelsträngiger DNA bzw. 30 µg/mL einzelsträngiger DNA zugrunde gelegt (Cavaluzzi & Borer 2004).

2.2.2.2 Isolation von genomischer DNA aus Mikroorganismen

Die Isolation von genomischer DNA aus E. coli erfolgte durch thermische Lyse. Dazu wurde eine Übernachtkultur durch Zentrifugation (6.500 x g, 5 min) pelletiert, in 100 µL TE-Puffer resuspendiert und anschließend für zehn Minuten bei 95°C inkubiert. In Folge der Lyse entstandener Zelldebris wurde durch eine einminütige Zentrifugation bei 12.000 x g entfernt. Der Überstand wurde in ein neues Reagenzgefäß überführt und enthielt die genomische DNA.

2.2.2.3 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die PCR-Reaktion (Mullis et al., 1992) wurde mit den puRe Taq Ready-To-Go PCR Beads (Amersham, Freiburg) durchgeführt. Der PCR-Ansatz bestand aus 1 – 50 ng

Templat-DNA, 10 pmol Vorwärts- bzw. Rückwärts-Primer, je 100 µM dNTPs und 2,5 U Taq-DNA-Polymerase in 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 50 mM KCl und 1,5 mM MgCl₂. Die Wahl der Annealing-Temperatur und der Elongationszeit richteten sich nach der Schmelztemperatur der verwendeten Oligonukleotide sowie nach der Größe des zu amplifizierenden DNA-Fragments. Dabei wurde von einer Syntheserate der im Ansatz enthaltenen Taq-DNA-Polymerase von 1.000 bp/min ausgegangen. Die Annealing-Temperatur für die Amplifikation des uidA- bzw. der 16S rDNA-Gene betrug 50°C und die Elongation erfolgte in beiden Fällen für 30 sek. Um eine Matrize für Sequenzierungsreaktionen zu erstellen, wurde die Pfu-DNA-Polymerase, die eine proof-reading-Aktivität besitzt, verwendet. Diese weist eine Syntheserate von etwa 500 bp/

min auf.

Bei der asymmetrischen PCR wurde der entsprechende Primer, der für die Amplifikation des nicht zu detektierenden Stranges sorgt, in einem 50-fachen Unterschuss eingesetzt.

Zur Herstellung der dsDNA-Matrizen für die komplementären miRNA-Sonden wurden 25 pmol der beiden äußeren Oligonukleotide (z. B. miR-21_1 und miR21_6) und 25 fmol der inneren Oligonukleotide verwendet (z. B. miR-21_2 bis miR21_5). Dabei betrug die Annealing-Temperatur 50°C und die Elongation erfolgte bei 72°C für 30 sek.

Die Amplifikation wurde in dem Personal Cycler-Thermocycler (Biometra, Göttingen) durchgeführt.

2.2.2.4 Verdau von phosphorylierten PCR-Produkten mittels λ-Exonuclease

Der Reaktionsansatz enthielt das PCR-Produkt in 67 mM Glycin-KOH (pH 9,3), 2,5 mM MgCl2 und 5 U λ-Exonuclease. Nach einer Inkubation der Reaktion für 30 min bei 37°C wurde die λ-Exonuclease durch Zugabe von 250 mM EDTA (pH 8,0) inaktiviert.

Der erzeugte DNA-Einzelstrang wurde ohne weitere Aufreinigungsschritte für den Biochip-Nachweis eingesetzt.

2.2.2.5 Reinigung von PCR-Produkten

Die Aufreinigung von PCR-Produkten, die als Matrize für Sequenzierungsreaktionen dienen, erfolgte mit Hilfe des High Pure PCR Product Purification Kits (Roche, Mannheim). Dieser sorgt für die Abtrennung von Nukleotiden, Oligonukleotiden, Polymerasen und des PCR-Puffers. Grundlage der Reinigung ist die Bindung von 100 bp bis 10 kbp langen DNA-Fragmenten an eine Silika-Gel-Membran der im Kit enthaltenen Säulchen.

2.2.2.6 Phenolextraktion und Ethanolfällung

Durch Phenolisieren wurden Nukleinsäuren von Proteinen und anderen Verunreinigungen befreit (Colter et al., 1962). Durch die Ethanolfällung wurden Nukleinsäuren konzentriert und Salze entfernt. Die Durchführung dieser Schritte erfolgte gemäß Sambrook und Russell (2001).

2.2.2.7 In vitro-Transkription

Nach PCR-Amplifikation des gewünschten genomischen Bereichs unter Verwendung eines Primers mit T7-Promotor-Sequenz wurde dieses PCR-Produkt für die in vitro-Transkription eingesetzt. Dabei wurden 2,5 µg PCR-Produkt in Gegenwart von 5 U T7 RNA-Polymerase in 40 mM Tris-HCl (pH 8,1), 20 mM MgCl₂, 1 mM Spermidin, 5 mM DTE, 0,01% (v/v) Triton X-100, jeweils 4 mM NTP und 80 U RNasin für 3 h bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 2 U RNase-freier DNase und einer weiteren Inkubation bei 37°C für 15 min wurde die RNA durch Phenolextraktion und EtOH-Fällung isoliert. Die Integrität der RNA wurde gelelektrophoretisch überprüft, während die Konzentrationsbestimmung spektralphotometrisch erfolgte.

2.2.2.8 Schneiden von DNA mit Restriktionsenzymen

Der Restriktionsverdau erfolgte jeweils bei den vom Hersteller angegebenen Bedingungen (Restriktionsenzyme und –puffer von NEB, Frankfurt am Main). Zu analytischen Zwecken wurden 0,5 µg Plasmid-DNA in einem Volumen von 20 µL für 1-2 h hydrolysiert. Durch eine Gelelektrophorese des Restriktionsansatzes in einem Agarosegel und nachfolgender Färbung des Gels in einer Ethidiumbromid-Lösung wurden die entsprechenden Banden unter UV-Licht lokalisiert (siehe Kapitel 2.2.1.5.1).

2.2.2.9 Elution von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen

Mit einem Skalpell wurde die gewünschte Bande aus dem Agarose-Gel ausgeschnitten.

Die Elution erfolgte mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben.

2.2.2.10 Klonierung von PCR-Fragmenten

PCR-Fragmente wurden mittels TA-Klonierung in Vektoren inseriert (Clark 1988; Hu 1993). Der T-Vektor - ein 3003 bp großes, linearisiertes Derivat des pGEM-5Zf(+) Vektors - ist ein Vektor mit Thymidin-Überhang. Die Ligation von PCR-Amplifikaten in den pGEM-T-Klonierungsvektor wurde gemäß dem Herstellerprotokoll mit dem pGEM-T Vector System (Promega, Mannheim) durchgeführt.

2.2.2.11 Ligation von DNA-Molekülen

Der Reaktionsansatz für die Ligation bestand aus einer Mischung aus Insert- und Vektor-DNA, wobei die Insert-DNA in einem etwa dreifach molaren Überschuss eingesetzt wurde und aus 0,5 U T4 DNA-Ligase in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM DTT. Das Gesamtvolumen des Ligationsansatzes betrug jeweils 20 μL. Der Ligationsansatz wurde für 18 h bei 4°C inkubiert.

2.2.2.12 Transformation von E. coli

2.2.2.12.1 Herstellung von chemisch-kompetenten E. coli

Die Herstellung und Transformation von E. coli-Zellen erfolgte nach dem Protokoll von Inoue et al. (1990). Die Arbeitsschritte bei der Anzucht kompetenter Zellen müssen alle auf Eis erfolgen.

100 mL Psi-Broth wurden mit 1 mL einer ÜN-Kultur angeimpft und bei 37°C und 170 rpm bis zu einer OD600 von 0,5 kultiviert. Unverzüglich wurde die Kultur für 15 min auf Eis gestellt und anschließend die Bakterienzellen für 5 min bei 5.000 x g und 4°C konzentriert. Der Überstand wurde entfernt und das Zellpellet in 0,4 Volumen kaltem TfbI-Puffer resuspendiert, erneut 15 min auf Eis inkubiert und wie oben beschrieben abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 0,04 Volumen kaltem TfbII-Puffer resuspendiert und für 15 min auf Eis inkubiert. Aliquots von 100 µL wurden unverzüglich in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend bei – 80°C gelagert.

Um die Kompetenz der Zellen zu testen, verwendete man frisch verdünnte Vektor-DNA, die man anschließend transformierte (s. Kapitel 2.2.2.12.2) und die Koloniezahl nach 18-stündiger Inkubation bei 37°C bestimmte.

2.2.2.12.2 Transformation von chemisch-kompetenten E. coli-Zellen

Zur Transformation wurde ein 100 µL Aliquot chemisch kompetenter E. coli-Zellen auf Eis aufgetaut und 0,1 µg Plasmid-DNA bzw. 5 – 10 µL Ligationsansatz zugegeben. Die Mischung wurde für 30 min auf Eis belassen, gefolgt von einer Inkubation bei 42°C für 90 sek (Hitzeschock). Nach Abkühlen des Transformationsansatzes für zwei Minuten, wurde 1 mL LB-Medium zugegeben. Die transformierten Zellen wurden für eine Stunde bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Anschließend pelletierte man die Zellen bei 1.000 x g für 3 min bei 25°C und resupendierte das Pellet in 100 µL LB-Medium (vorgewärmt auf 37°C). 50 – 100 µL der Zellsuspension plattierte man auf LB-Agar (vorgewärmt auf 37°C) mit dem gewünschten Antibiotikum aus und inkubierte die Platte bei 37°C für 16 – 18 h. Im Falle der Transformation des pGEM-T-Vektors gab man zur Zellsuspension 80 mM IPTG und 8 mg/mL X-Gal-Lösung (gelöst in DMF) und plattierte diese wie oben beschrieben auf LB-Agarplatten aus (Blau-Weiß-Selektion).