Die von Uroguanylin und STh abgeleiteten Peptide Uroguanylin A3R D6E,

Die strukturellen Voraussetzungen der Bindung zwischen GC-C und den Liganden Guanylin, Uroguanylin und STa (Abb. 1.2) wurden auf Seiten der Peptidliganden durch Mutationsstudien untersucht. Dabei wurde eine Reihe von Sequenzpositionen identifziert, die einen großen Beitrag bei der Vermittlung der Bindung zu GC-C leisten. Bei STh ist dies vor allem die Asn-12-Pro-13-Ala-14-Sequenz, die als wahrscheinliche Bindungsstelle gilt, da die Substitution von Asn-12 durch Alanin und von Ala-14 durch D-Alanin die Rezeptorbindung des Enterotoxins stark beeinträchtigt (Carpick & Gariepy, 1991). Andererseits führt eine Substitution von Pro-13 durch Glycin nur zu einer moderaten Reduktion der Affinität in kompetitiven Bindungsstudien (Waldman & O'Hanley, 1989). Die Asn-12-Pro-13-Ala-14-Sequenz wird auch mit der von STh gezeigten Proteaseresistenz in Verbindung gebracht, da ein Guanylin-Analogon, welches diese Sequenz enthält, eine deutlich höhere Stabilität im Dünndarm von Mäusen aufweist (Carpick & Gariepy, 1993). Auch für das Peptidrückgrat von Cys-5-Cys-6-Glu-7-Leu-8 wurde eine Interaktion mit dem Rezeptor

vorausgesagt (Wolfe & Waldman, 2002). Bei Uroguanylin konnte gezeigt werden, dass die Substitution von Asp-3 durch Glutamat zu einer um den Faktor 5 – 8 erhöhten Affinität des Peptids zu GC-C führt (Liu et al., 2009).

Die Tatsache, dass die Prosequenz von Prouroguanylin dazu in der Lage ist, auch die Faltung von STh in seine native Konformation zu unterstützen, zeugt von einer beträchtlichen Toleranz des Prosequenz-vermittelten disulfidgekoppelten Faltungsmechanismus gegenüber der Sequenz des C-terminalen Peptids. Um das Potential dieser neuen Expressionsstrategie zu Herstellung verschiedener von Uroguanylin bzw. STh abgeleiteter disulfidverbrückter Peptide näher zu untersuchen wurden vier Varianten von Prouroguanylin bzw. Prouro-STh entworfen (Abb. 4.22).

Bei der Auswahl der in die Konstrukte eingeführten Mutationen dienten Ergebnisse früherer Studien zur Struktur-Aktivitätsbeziehung von STh und Uroguanylin (Waldman & O'Hanley, 1989; Carpick

& Gariepy, 1991; Wolfe & Waldman, 2002; Liu et al., 2009) sowie der beiden synthetischen GC-C-Agonisten Linaclotide und Plecanatide als Richtlinien. Zudem wurde versucht, durch das Einführen zusätzlicher Arginin-Reste in die Sequenz die Position der Trypsin-Spaltstellen und damit die Länge der C-terminalen Fragmente zu bestimmen. Wie aus den Ergebnissen der Massenspektrometrie eindeutig hervorgeht (Abb. 4.24), war jedoch die Einführung neuer Trypsin-Spaltstellen sowohl bei den von STh abgeleiteten Peptiden, als auch bei den Uroguanylin-Derivaten erfolglos, da in allen Fällen die C-terminalen Fragmente als 19 Aminosäuren lange Peptide identifiziert wurden, die ggfs.

ein zusätzliches Arginin in ihren N-Termini enthielten (Abb. 4.22). Offensichtlich schneidet Trypsin nicht in unmittelbarer N-terminaler Nähe der zweifach oder dreifach disulfidverbrückten Kernregionen, worin sich die bei STh und Uroguanylin nachgewiesene Resistenz gegenüber proteolytischem Abbau zeigt (Carpick & Gariepy, 1993).

Alle vier neu erstellten Konstrukte konnten in E. coli exprimiert und gereinigt werden und nach dem Verdau mit Trypsin konnten jeweils alle C-terminalen Fragmente durch RP-HPLC isoliert werden (Abb. 4.23). Zudem bestätigten die durch ESI-Massenspektrometrie bestimmten Molekulargewichte, neben der Länge der C-terminalen Fragmente, auch, dass alle in den Peptiden vorhandenen Cysteine oxidiert vorliegen (Abb. 4.24).

STh L9Y sowie STh Y5R L9Y wurden jeweils auch ¹⁵N-markiert gereinigt. Die gemessenen [¹H, ¹⁵N]-HSQC-Spektren zeigen eine weitgehende Übereinstimmung der chemischen Verschiebungen der Aminosäuren, die zugeordnet werden können (Abb. 4.25). Da ähnliche chemische Verschiebungen der Resonanzsignale auf eine ähnliche magnetische Umgebung der Amidprotonen schließen lassen, ist dies ein starker Hinweis darauf, dass die Konformation des Peptidrückgrats und damit die Faltung und Disulfidverbrückung der einzelnen Peptide in STh, STh L9Y und STh Y5R L9Y gleich sind. Da in allen drei Peptiden nur jeweils die 7 bzw. 8 C-terminalen

Aminosäuren zugeordnet werden können, während die Punktmutationen von STh in der N-terminalen Hälfte der Peptide lokalisiert sind, führen die Sequenzunterschiede der Peptide bei den beobachtbaren Signalen nicht zu größeren Unterschieden der chemischen Verschiebungen. Diese Beobachtung lässt auch den Schluss zu, dass der Austausch der Aminosäuren zu keiner deutlichen Beeinflussung der Konformation des Peptidrückgrats führt, zumal dieses neben den Disulfidbrücken in erster Linie durch Wasserstoffbrückenbindungen der Rückgratamidgruppen stabilisiert ist, während die Seitenketten der Aminosäuren in der Kristallstruktur von STp nach außen orientiert sind (Ozaki et al., 1991).

Der Nachweis der biologischen Aktivität von STh L9Y und STh Y5R L9Y erfolgte, wie schon bei STh und Uroguanylin, durch die Bestimmung der von den Peptiden in T84-Zellen stimulierten intrazellulären cGMP-Produktion (Abb. 4.26). Beide Peptide sind demnach biologisch aktive Agonisten der GC-C. In Abb. 4.26 fällt auf, dass die Zunahme der cGMP-Menge bei den beiden Peptiden geringer ausfällt als bei STh. STh L9Y bewirkt bei extrazellulären Peptidkonzentrationen von 10 – 100 nM eine deutlich geringere Zunahme der intrazellulären cGMP-Menge als STh. Bei STh Y5R L9Y ist bei Peptidkonzentrationen von 10 nM und 50 nM sogar fast keine Aktivierung der Produktion zu detektieren. Gemäß den beim Aktivitätstest bestimmten cGMP-Konzentrationen nimmt die Aktivität der getesteten Peptide in der Reihe STh > STh L9Y > STh Y5R L9Y ab. Dies ist nicht verwunderlich angesichts der Annahme wonach STh als „Superagonist“

der GC-C im Zuge einer konvergenten Evolution entstanden ist und die Sequenz von STh auf maximale Aktivierung der GC-C hin optimiert wurde (Lin et al., 2010b). Offensichtlich führen sowohl die L9Y- als auch die Y5R-Mutation zu einer Verringerung der Aktivität des Enterotoxins.

Die L9Y-Mutation ist auch in der Sequenz von Linaclotide vorhanden (Busby et al., 2010). Y5R führt eine positive Ladung in die flexible N-terminale Region des Peptids ein, die seine biologische Aktivität moduliert, obwohl der N-Terminus keine entscheidende Rolle bei der Rezeptorbindung hat (Yoshimura et al., 1985).

Auch die Aktivitäten von Uroguanylin A3R D6E und Uroguanylin ΔTIA D6E wurden untersucht. Die Vorläuferproteine Prourouroguanylin A72R D75E und Prourouroguanylin Δ(70-72) D75E unterschieden sich lediglich durch eine Deletion der drei Aminosäuren Thr-70, Ile-71 und Arg-72 in Prouroguanylin Δ(70-72) D75E. Uroguanylin ΔTIA D6E geht also aus einem Vorläuferprotein hervor, in dem die Linkerregion zwischen Propeptid und Hormonsequenz verkürzt ist. Die C-terminalen Fragmente, die aus beiden Vorläuferproteinen freigesetzt werden, haben aber die gleiche Länge und unterscheiden sich lediglich in der Sequenzposition 2, die bei Uroguanylin A3R D6E von einem Isoleucin und bei Uroguanylin ΔTIA D6E von einem Leucin gebildet wird (Abb. 4.22). Abb. 4.27 zeigt, dass Uroguanylin A3R D6E eine mit Uroguanylin vergleichbare biologische Aktivität

aufweist. Im Gegensatz dazu hat Uroguanylin ΔTIA D6E fast keinerlei detektierbaren Effekt auf die cGMP-Konzentration im Cytosol der T84-Zellen. Erst bei der größten verwendeten Peptidkonzentration, 1000 nM, ist eine geringe Menge cGMP in den Zelllysaten nachweisbar. Da es nicht wahrscheinlich ist, dass dieser bedeutende Unterschied in der biologischen Aktivität der beiden Uroguanylin-Analoga auf den doch eher geringfügigen Unterschied ihrer Sequenzen zurückzuführen ist, kann aus dem durchgeführten Experiment geschlossen werden, dass eine Verkürzung des C-Terminus der Prosequenz von Prouroguanylin ebenfalls zu einem Verlust ihrer Funktion als intramolekulares Chaperon führt. Im verkürzten Vorläuferprotein kommt es nicht mehr zur Ausbildung der nativen Struktur des C-terminalen Hormons. Die entscheidende Rolle des N-Terminus der Prosequenz bei der Faltung von Uroguanylin wurde bereits gezeigt (Hidaka et al., 2000) aber anhand der Lösungsstruktur von Proguanylin und eines auf dieser Grundlage erstellten Homologiemodells von Prouroguanylin (Abb. 5.1) kann leicht erkannt werden, dass die korrekte Anordnung der Hormonregion im Kontext des Gesamtproteins durch eine Verkürzung des C-Terminus der Prosequenz ebenfalls beeinträchtigt ist (Lauber et al., 2003; Lauber, 2003).

Insgesamt folgt aus den durchgeführten Mutationsstudien, dass die Prosequenz von Prouroguanylin das Vorliegen von Punktmutationen an einigen Positionen der C-terminalen Hormon- oder Enterotoxinregion toleriert, dass aber eine Verkürzung des Proteins, und damit eine Änderung der Positionen der zu bildenden Disulfidbrücken innerhalb der Sequenz, zu einer Fehlfaltung des C-Terminus führt.

Abb. 5.1: Darstellung eines Strukturmodells von Prouroguanylin (Lauber, 2003). Disulfidbrücken sind gelb dargestellt. Die Hormonregion ist magenta und der Sequenzabschnitt Thr-70-Ile-71-Ala-72, der in Prouroguanylin Δ(70-72) D75E deletiert wurde, ist blau hervorgehoben.

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5.4 Vergleich der Ausbeuten bei der Herstellung der verschiedenen GC-C-Agonisten