Die Domänenstruktur von GC-C

GC-C hat mit den anderen Vertretern der Familie der partikulären Guanylatzyklasen eine charakteristische Domänenstruktur gemein (Abb. 1.5). Das 1050 Aminosäuren große Protein untergliedert sich in eine extrazelluläre Domäne (406 AS), eine einzelne Transmembranhelix, eine Kinase-Homologie-Domäne (260 AS), eine Dimerisierungsdomäne (43 AS), eine katalytische Guanylatzyklase Domäne (130 AS) sowie eine C-terminale Domäne (63 AS).

Extrazelluläre Domäne

Die Extrazelluläre Domäne (ECD) ist die Region, die innerhalb der membrangebundenen Guanylatzyklasen die geringste Homologie aufweist. So beträgt beispielsweise die Sequenzidentität

Abb. 1.5: Dimerisierung und Domänenstruktur von GC-C (schematisch). ECD: extrazelluläre Domäne; TM: Transmembrandomäne;

KHD: Kinase-Homologie-Domäne;

Linker: Linkerregion mit Dimerisierungsmotiv; GC: katalytische Domäne; C-terminal: Carboxy-terminale Region.

der Extrazellulären Domänen von GC-C und GC-A lediglich 17 % (Hasegawa et al., 2005). Die ECD von GC-C ist 406 Aminosäuren groß, enthält vier Disulfidbrücken sowie 8-10 potentielle N-Glykosylierungsstellen (Vaandrager et al., 1993). Ihre wichtigste Funktion besteht in der Bindung der extrazellulären Liganden Guanylin, Uroguanylin und STa. Es konnte kein direkter Einfluss der N-Glykane auf die Ligandenbindung der ECD nachgewiesen werden (Ghanekar et al., 2004).

Jedoch wurde gezeigt, dass Mutanten der ECD, bei denen Glykosylierungsstellen eliminiert wurden, eine geringere Stabilität und eine deutlich geringere Ligandenbindungskapazität aufweisen (Hasegawa et al., 1999b). Zwar ist die Struktur der ECD von GC-C bis zum jetzigen Zeitpunkt unbekannt, jedoch existieren Kristallstrukturen der ECD von GC-A in Abwesenheit und Gegenwart des Liganden ANP (van den Akker et al., 2000b; van den Akker, 2001; Ogawa et al., 2004). In beiden Strukturen liegt die ECD von GC-A als Dimer vor. Dies ist im Einklang mit früheren Beobachtungen, wonach die ECD von GC-A zur Dimerisierung ausreicht (Chinkers & Wilson, 1992) und diese Dimerisierung unabhängig von der Gegenwart von Liganden ist (Lowe, 1992).

Auch für GC-C wurde eine Liganden-unabhängige Dimerbildung der ECD nachgewiesen (Hirayama et al., 1993).

Kinase Homologie Domäne

Der intrazelluläre Teil von GC-C, der proximal zur Membran liegt, weist große Sequenzhomologie mit Tyrosin-Kinasen auf und wird deswegen als Kinase Homologie Domäne (KHD) bezeichnet.

Jedoch ist die KHD katalytisch inaktiv und hat in erster Linie regulatorische Funktionen, da ein in katalytisch aktiven Proteinkinasen essentielles HRD-Motiv in der KHD fehlt (Hanks et al., 1995).

Phylogenetische Studien konnten zeigen, dass die KHD, die Dimersierungsdomäne und die katalytische GC Domäne evolutionär gemeinsam entstanden sind (Biswas et al., 2009). Die KHD übt einen inhibierenden Einfluss auf die katalytische Domäne aus, der erst durch die Bindung eines Liganden an die extrazelluläre Domäne aufgehoben wird (Koller et al., 1992; Rudner et al., 1995).

Die allosterische Bindung von ATP an die KHD ist wichtig für die Aktivierung von Guanylatzyklasen durch extrazelluläre Liganden. Für GC-A wurde besonders ausführlich beschrieben, dass zusätzlich zur Bindung eines natriuretischen Peptids an die extrazelluläre Domäne auch ATP als intrazellulärer Ligand an ein ATP-reguliertes Modul innerhalb der KHD binden muss, um das Signal bis zur katalytischen Domäne weiterzuleiten (Chinkers et al., 1991; Duda et al., 1993; Duda et al., 2001; Duda & Sharma, 2005). Bei GC-C wurde in Abwesenheit von ATP eine schnelle Inaktivierung der katalytischen Domäne nach STa-Bindung beobachtet (Vaandrager et al., 1993; Bakre et al., 2000) und Lys-516 als essentiell für die ATP-Bindung identifiziert (Bhandari et al., 2001). Im Gegensatz zu GC-A wurde bei GC-C keine Phosphorylierung der KHD beobachtet

(Potter & Hunter, 1998; Ghanekar et al., 2003).

Dimerisierungsdomäne

Ähnlich wie GC-A bildet auch GC-C Homooligomere in der Membran (Rudner et al., 1995;

Thompson & Garbers, 1995). Für die isolierten extrazellulären Domänen wurde eine Dimerbildung nachgewiesen. Zusätzlich wurde die intrazelluläre Region zwischen KHD und GC als Dimerisierungsdomäne identifiziert (Wilson & Chinkers, 1995). Basierend auf ihrer Sequenz wird für das Dimerisierungsmotiv eine Coiled-Coil-Struktur angenommen welche die Wechselwirkung der beiden Partner vermittelt. Bei heterolog in HEK293 und Insektenzellen exprimiertem GC-C wurden sowohl für isolierte extrazelluläre als auch für isolierte intrazelluläre Domänen Homotrimere detektiert (Vaandrager et al., 1994; Hasegawa et al., 1999c; Vijayachandra et al., 2000) wobei die Trimerisierung der extrazellulären Domäne ligandenabhängig zu sein scheint.

Aufgrund der ungeklärten Rolle der beobachteten Trimerisierung ist der native Assoziationsgrad von GC-C sowie die relativen Beiträge der intra- und extrazellulären Domänen umstritten.

Katalytische Domäne

Die katalytische Domäne von GC-C ist der Teil des Proteins, der am stärksten innerhalb der Familie der partikulären Guanylatzyklasen konserviert ist. Sie weißt zudem eine ausgeprägte Homologie zu den katalytischen Domänen löslicher Guanylatzyklasen und Adenylatzyklasen aus Säugetieren auf.

Ebenso wie diese gehört GC-C zur Klasse III der Purin-Nukleotidylzyklasen (Kamenetsky et al., 2006). Wie bei löslichen Guanylatzyklasen ist auch bei membrangebundenen Guanylatzyklasen eine Dimerisierung nötig, um ein katalytisches Zentrum zu bilden. Dabei sind Aminosäuren beider Untereinheiten am Aufbau des katalytischen Zentrums beteiligt (Thorpe & Garbers, 1989;

Krupinski et al., 1989). Im Gegensatz zu den löslichen Guanylatzyklasen, die Heterodimere mit nur einem katalytischen Zentrum bilden (Kamisaki et al., 1986; Harteneck et al., 1990), sind partikuläre Guanylatzyklasen homodimer aufgebaut und enthalten zwei katalytische Zentren (Chrisman et al., 1975; Wong et al., 1995).

Carboxy-terminale Region

GC-C sowie die sensorischen Guanylatzyklasen D bis F enthalten eine unstrukturierte C-terminale Region, die nicht in GC-A, GC-B oder GC-G vorkommt (Lucas et al., 2000). Zwar ist die genaue Funktion dieser 63 Aminosäuren langen Region bislang nicht eindeutig geklärt, jedoch werden ihr eine Reihe von regulatorischen Wechselwirkungen zugeordnet. So wurde gezeigt, dass Ser-1029 von Proteinkinase C phosphoryliert wird und dass es ohne diese Phosphorylierung nicht zu einer STa-abhängigen Aktivierung der cGMP-Produktion kommen kann (Wada et al., 1996). Außerdem

wurde in der C-terminalen Region eine Signalsequenz identifiziert, die essentiell für die apikale Lokalisierung von GC-C in polarisierten Epithelzellen ist (Hodson et al., 2006). Schließlich wurde der C-Terminus von GC-C als Bindungsstelle des PDZ-Proteins NHERF4 identifiziert. Zwar ist die Rolle der Interaktion zwischen NHERF4 und GC-C nicht bekannt, jedoch wurde gezeigt, dass die Coexpression von NHERF4 zu einer Inhibierung STa-abhängiger cGMP Synthese führt (Scott et al., 2002; Thelin et al., 2005).