Plasmide

Tabelle 3.2 zeigt eine Liste der in dieser Arbeit verwendeten, oder im Rahmen dieser Arbeit neu klonierten, DNA-Konstrukte.

Tab. 3.2: Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten bzw. konstruierten Plasmide.

Plasmid Verwendung Referenz

pET32a E. coli Expressionsvektor mit T7-Promotor; DNA-Sequenzen für einen N-terminalen Thioredoxin-(Trx) und Hexahistidin-(6xHis) Anhang

Novagen (Madison, USA) pET43.1a-NusA-C489A E. coli Expressionsvektor mit T7-Promotor;

DNA-Sequenzen für einen N-terminalen NusA-C489A-und Hexahistidin-Anhang

(Tidten, 2003)

pET43.1a-NusA-Cys^- E. coli Expressionsvektor mit T7-Promotor; DNA-Sequenzen für einen N-terminalen

pET32a-Derivat; integriert in die MCS ist das Gen für humanes Prouroguanylin mit einer N-terminalen

(Schuster, 2004)

Spaltstelle für PreScission Protease, vor der die Sequenz für 5 Aspartat-Reste kloniert ist;

verwendete Restriktionsenzyme: SacI und EcoRI pET32a-Asp-pres-prouro-STh pET32a-Derivat; integriert in die MCS ist das Gen

für humanes Prouro-STh mit einer N-terminalen

pET43.1a-C489A-Derivat; zur Expression von MiniGC-C; kodiert für eine PreScission-Schnitt-stelle zwischen NusA-C489A und MiniGC-C

pPIC9K-ECD-GC-C-6xHis pPIC9K-Derivat; zur Expression der ECD von humanem GC-C mit einem C-terminalen das Sekretionssignal von Neurexin 1 a sowie in 3'-Position der MCS für die Sequenz des Fc-Fragments von humanem IgG.

(Reissner et al., 2008)

pCMV_Nrxn_ECD-Thr Kodiert für die ECD von humanem GC-C als Fusionsprotein mit einem C-terminalen IgG-Anhang. Zwischen ECD-GC-C und IgG befindet sich eine Erkennungssequenz für Thrombin.

diese Arbeit

3.2.1 pET32a

pET32a ist ein Vektor für die induzierte Überexpression von Fremdgenen in E. coli (Abb. 3.1). Die Gene werden als genetische Fusion mit N-terminalem Thioredoxin (Trx) exprimiert. Zwischen Trx und dem Fremdprotein befindet sich außerdem noch eine Hexahistidin-Sequenz zur Reinigung durch immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie. Trx wirkt als Löslichkeitsanhang und soll die Faltung bzw. spätere Solubilisierung des Fusionspartners aus unlöslichen Proteinaggregaten unterstützen. Das Gen für das Fusionsprotein steht unter der Kontrolle des T7-Promotors und seine Expression kann damit in Bakterienstämmen, die den DE3-Prophagen enthalten, durch IPTG-Zugabe induziert werden.

Abb. 3.1: Plasmidkarte von pET32a. Der T7 Promotor steht unter der Kontrolle des lac Operators und reguliert die Expression eines Fusionsproteins, dass aus einem N-terminalen Thioredoxin (trxA), einem 6xHis-Anhang und dem Zielprotein besteht. Der Vektor kodiert zusätzlich noch den Repressor lacI sowie eine Ampicillin-Resistenz (AmpR) für die Selektion.

ori: pBR322 Replikationsursprung; f1 ori:

Replikationsursprung des Bakteriophagen f1 (für die Produktion einzelsträngiger DNA). Das in dieser Arbeit verwendete Gen für die ECD von GC-C wurde mit Hilfe der Restriktionsenzyme NcoI und BamHI in die Multiple Klonierungsstelle (MCS) eingefügt.

pET32a wurde zur Expression von von Prouroguanylin, Prouro-STh und deren mutierten Derivaten verwendet. Außerdem wurde in dieser Arbeit die Verwendung von pET32a zur Expression der ECD von GC-C in E. coli untersucht.

3.2.2 pET43.1a-NusA-C489A und pET43.1a-NusA-Cys

-Ein weiterer Expressionsvektor für E. coli ist pET43.1a, von dem die beiden in dieser Arbeit verwendeten Vektoren pET43.1a-NusA-C489A und pET43.1a-NusA-Cys^- abgeleitet sind (Abb.

3.2). Sie kodieren für einen N-terminalen NusA-Löslichkeitsanhang sowie einen Hexahistidin-Reinigungsanhang.

Abb. 3.2: Plasmidkarte von pET43.1a. Wie andere pET-Vektoren auch kodiert pET43.1a für einen T7 Promotor, ein Ampicillin-Resistenzgen (AmpR), den lac Repressor (lacI) und Replikationsursprünge für E. coli (ori) und Bakteriophage f1 (f1 ori). Der Einbau des Fremdgens erfolgt hinter den Sequenzen für einen NusA-Löslichkeitsanhang sowie einen Hexahistidinanhang. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei modifizierte Varianten des Vektors verwendet, bei denen das Cystein 489 bzw. die drei Cysteine 251, 454 und 489 in NusA durch Alanine ersetzt wurden. Das Gen für MiniGC-C wurde durch die Restriktionsenzyme SmaI und BamHI in die Multiple Klonierungsstelle (MCS) eingefügt, während beim Gen für die gesamte ECD von GC-C die Enzyme SacI und EcoRI verwendet wurden.

Auch in diesen Vektoren steht das Fusionsprotein unter der Transkriptionskontrolle des T7-Promotors. Da er zur Expression von Proteinen mit Disulfidbrücken verwendet werde sollte, wurde der ursprüngliche pET43.1a-Vektor so verändert, dass im NusA-Anhang enthaltene Cysteine durch Alanin ersetzt wurden. Dies betrifft Cys-489 im Falle von pET43.1a-NusA-C489A sowie Cys-251, Cys-454 und Cys-489 im Falle von pET43.1a-NusA-Cys^-. Die Maßnahme diente dazu, zu verhindern, dass sich im oxidativen Cytoplasma von Origami B (DE3) Disulfidbrücken zwischen dem NusA-Anhang und seinen Fusionspartnern bilden.pET43.1A-NusA-C489A wurde zur Expression von MiniGC-C verwendet während pET43.1a-NusA-Cys^- bei der Expression der ECD von GC-C eingesetzt wurde.

3.2.3 pPIC9K

Der Vektor pPIC9K eignet sich zur sekretierten Expression rekombinanter Proteine in P. pastoris (Abb. 3.3).

Abb. 3.3: Vektorkarte von pPIC9K. Der Vektor enthält Gene für die Histidinol-Dehydrogenase (HIS4), die zur Synthese von Histidin essentiell ist, sowie zur Vermittlung von Resistenzen gegen Ampicillin (AmpR; in E. coli) und Geneticin (KmR; in P. pastoris). Das exprimierte Fremdgen steht unter der Kontrolle des Promotors der Hefe-eigenen Alkoholoxidase 1 (5' AOX1). Das Sekretionssignal des α-Faktors von S. cerevisiae (aF) wird zur Sekretion des Zielproteins ins Medium benötigt. Der Vektor wird in linearisierter Form in P. pastoris eingeführt und integriert durch homologe Rekombination ins Hefegenom. ori: Replikationsursprung für E.

coli; TT: Transkriptions-Terminator; 5' AOX1: 5'-Region des AOX1 Promotors; 3' AOX1: 3'-5'-Region des AOX1-Promotors. Das Fremdgen wurde durch XhoI in den Vektor eingeführt. Vorher wurde eine zusätzliche XhoI-Schnittstelle im KmR-Gen des Vektors durch Mutagenese entfernt.

Er enthält den Replikationsursprung von pBR322 sowie ein Ampicillin-Resistenzgen zur Manipulation des Vektors in E. coli. Das Gen HIS4 kodiert für die Histidinol-Dehydrogenase und dient der Selektion positiver Transformanten in HIS4-defizienten P. pastoris Stämmen. Zusätzlich enthält der Vektor das Kanamycin-Resistenzgen, welches ebenfalls Resistenz gegen das bei Eukaryonten eingesetzte Antibiotikum Geneticin verleiht. Diese Resistenz dient dem in vivo screening von Klonen mit Multi-Kopien-Insertionen des Vektors. Das Sekretionssignal des α-Faktors aus S. cerevisiae dient der Sekretion von Zielproteinen und wird in P. pastoris während dem Export abgespalten.

Der Vektor wurde in dieser Arbeit zur Expression von GC-C-6xHis verwendet. Das Fremdgen wurde dabei mit dem Restriktionsenzym XhoI in die MCS des Vektors insertiert. Vorher wurde ein zweite XhoI-Schnittstelle im Kanamycin-Resistenzgen des Vektors durch ortsgerichtete Mutagenese entfernt.

3.2.4 pCMV_Nrxn

pCMV_Nrxn ist ein Vektor zur Expression rekombinanter Proteine in Säugerzellen (Abb. 3.4).

pCMV_Nrxn ist abgeleitet vom pCMV5 Expressionsvektor (Andersson et al., 1989) und eignet sich zur transienten Transfektion von Säugerzellen. Die Transkription eines in den Vektor klonierten Abb. 3.4: Vektorkarte von pCMV_Nrxn. Der Vektor enthält das Ampicillin-Resistenzgen (AmpR) zur Stabilisierung in E. coli. Außerdem enthält er Replikationsursprünge für E. coli (ori) und den Phagen f1 (f1 ori). Der Vektor kodiert für den CMV Promotor und enthält zur Multiplen Klonierungsstelle (MCS) benachbarte Sequenzen, die für ein N-terminales Sekretionssignal (NRXN) sowie für einen C-terminalen IgG-Reinigungsanhang kodieren.

Zielproteins steht unter der Kontrolle des humanen Cytomegalovirus (CMV) Promotors. In 5'-Richtung der Multiplen Klonierungsstelle ist das Sekretionssignalpeptid des synaptischen Membranproteins Neurexin 1a aus Rattus norvegicus während sich am 3'-Ende der MCS die Sequenz eines 26,8 kDa IgG-Anhangs befindet. Dieser Anhang dient der späteren Reinigung eines Fusionsproteins durch Affinitätschromatographie mit Protein A Sepharose. Die IgG kodierende Sequenz ist 1296 bp lang und wird nach der Transkription durch Spleißen zum fertigen Transkript prozessiert.

Das Gen der extrazellulären Domäne von GC-C mit einer C-terminalen Thrombin-Erkennungssequenz wurde unter Verwendung der Restriktionsendonukleasen SalI und BamHI in die MCS des Vektors eingefügt.