Expression der gesamten ECD von GC-C in E. coli

Die Expression von GC-C oder ihrer Rezeptordomäne in Säugerzellen führt zu Proteinen, die die Fähigkeit zur Ligandenbindung haben, aber nur in geringen Mengen exprimiert werden und nur schwer gereinigt werden können (Schulz et al., 1990; Hirayama et al., 1993). Die gesamte extrazelluläre Domäne von GC-C kann in Insektenzellen als lösliches Glykoprotein exprimiert werden, welches zum Liganden STp(4-17) eine ähnliche Affinität hat wie das Gesamtprotein (Hasegawa et al., 1999c). Die ECD wurde auch in E. coli exprimiert, um damit anschließend Antikörper gegen GC-C zu produzieren. Die Autoren dieser Studien berichten, dass die auf diese Weise hergestellte Domäne die Fähigkeit zur Bindung von STh behält (Nandi et al., 1996). Die Expression der gesamten ECD von GC-C in E. coli schien aufgrund dieser Daten ein guter Weg zur Herstellung eines GC-C-Fragments zu sein, welches in genügender Menge und Reinheit zugänglich sein sollte, um die Ligandenbindung von GC-C auf molekularer Ebene zu studieren. Mit einem bakteriellen Expressionssystem können zumeist deutlich höhere Ausbeuten an rekombinantem

Protein erzielt werden als dies mit eukaryotischen Systemen der Fall ist. Außerdem erlaubt die Expression in E. coli oft eine einfache und kostengünstige Markierung des Zielproteins mit NMR-aktiven Isotopen.

Für die Expression und Reinigung der ECD von GC-C aus E. coli wurde eine Strategie gewählt, die dem bei MiniGC-C verwendeten Vorgehen sehr ähnlich ist. Aufgrund der im Protein vorliegenden vier Disulfidbrücken (Hasegawa et al., 2005) wurde die Expression des Proteins in Origami B (DE3) durchgeführt. Es wurden zwei Konstrukte getestet, die sich in ihren Löslichkeitsanhängen unterscheiden: pET32a-ECD-GC-C kodiert für einen N-terminalen Trx-Anhang während pET43.1a-NusA-ECD-GC-C für den bekannten N-terminalen NusA-Anhang kodiert. Beide Fusionsproteine enthalten einen Hexahistidin-Anhang, der ihre Reinigung durch Metallionen-Affinitätschromatographie ermöglichen soll. Keines der getesteten Konstrukte erlaubt eine Produktion der ECD als lösliches Protein in genügender Reinheit. Das Trx-ECD-GC-C-Fusionsprotein ist in großen Teilen unlöslich und kann nach der Lyse nur durch 8 M Harnstoff teilweise in Lösung gebracht werden (Abb. 4.37 B). Da die Rückfaltung mit dem Verlust von großen Mengen des löslichen Proteins einhergeht und das übrige Protein im Verlauf der folgenden Nickelionen-Affinitätschromatographie fast vollständig ausfällt ist anzunehmen, dass die ECD in diesem Konstrukt nicht die native, lösliche Faltung annimmt. Das NusA-ECD-GC-C-Fusionsprotein ist über einen längeren Zeitraum hinweg löslich und bindet an die Nickelsäule (Abb.

4.37 C u. D). Allerdings kann das 104 kDa Fusionsprotein nicht von zwei kleineren Proteinen getrennt werden, welche Molekulargewichte von etwa 66 und 75 kDa besitzen. Möglicherweise handelt es sich bei diesen um kleinere Fragmente des Fusionsproteins, welche durch proteolytischen Verdau von NusA-ECD-GC-C entstehen. Außerdem verläuft die Abspaltung des NusA-Anhangs nicht vollständig und führt zu einer Probe, in der noch großenteils das ungespaltene Fusionsprotein sowie ein Protein von etwa 66 kDa vorliegt (Abb. 4.38). Diese beiden Proteine konnten erst durch Größenausschlusschromatographie voneinander getrennt werden (Abb. 4.39). Bei der Größenausschlusschromatographie zeigte sich, dass das Fusionsprotein NusA-ECD-GC-C nicht die erwartete Größe eines 104 kDa Proteins hat, sondern im Totvolumen der Säule zusammen mit dem polymeren Farbstoff Blue Dextran eluiert. Dies lässt auf eine Oligomersierung des Proteins schließen und könnte auch eine Erklärung für die Beobachtung sein, dass sich das Fusionsprotein kaum mit PreScission-Protease spalten lässt. Da für die native ECD von GC-C eine Oligomerisierung vorgeschlagen wurde, die unabhängig von der intrazellulären Dimersisierungsdomäne zustandekommt (Hirayama et al., 1993), und andererseits auch eine auf der Fehlfaltung des Proteins beruhende Oligomerisierung des Proteins durch intermolekulare Disulfidbrückenbildung vorstellbar war, wurde das Verhalten des Proteins bei der SDS-PAGE unter

reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen untersucht (Abb. 4.40). Dabei zeigte sich, dass NusA-ECD-GC-C unter nicht-reduzierenden Bedingungen nicht oder nur in geringem Umfang in das Gel eindringen kann, während es unter reduzierenden Bedingungen auf der für ein 104 kDa Protein erwarteten Position läuft. Dieses Ergebnis deutet auf eine Bildung von Oligomeren des Fusionsproteins hin, welche durch intermolekulare Disulfidbrücken stabilisiert sind. Dieses Verhalten unterscheidet die ECD von GC-C von dem unter ähnlichen Bedingungen exprimierten MiniGC-C (siehe Kap. 4.4.1.3). Zwar ist damit eine Fehlfaltung des Proteins unter den gewählten Expressionsbedingungen wahrscheinlich, um aber dennoch zu testen, ob das exprimierte Fusionsprotein in der Lage ist, den Liganden Uroguanylin zu binden wurde eine NMR-Titration durchgeführt (Abb. 4.41). Das [¹H, ¹⁵N]-HSQC-Spektrum von ¹⁵N-markiertem Uroguanylin ändert sich, wie zu erwarten war, nicht bei Zugabe von NusA-ECD-GC-C, womit ausgeschlossen werden kann, dass das in E. coli exprimierte und gereinigte Protein die nativen Ligandenbindungseigenschaften von GC-C besitzt.

Im Rahmen von einigen Bachelor- und Masterarbeiten, die am Lehrstuhl durchgeführt wurden, konnten noch eine Reihe von anderen Konstrukten auf ihre Eignung zur rekombinanten Expression der ECD in E. coli untersucht werden:

– pET43.1a-NusA-ECD-GC-C, welches das wildtypische NusA als Löslichkeitsanhang verwendet (Weirich, 2009)

– pET15b-ECD-GC-C, welches für ein Fusionsprotein aus der ECD von GC-C und lediglich einem Hexahistidn-Anhang kodiert und in E. coli Origami B (DE3) exprimiert wurde (Best, 2010)

– ein pPET43.1a-NusA-Cys^--ECD-GC-C Konstrukt wurde auch in E. coli BL21 (DE3) exprimiert (Best, 2010)

– pMal-p5x-hu-ECD-GC-C kodiert für eine Fusion aus dem Maltose-Bindungsprotein (MBP) und der ECD von GC-C und besitzt ein Signalsequenz für die sekretierte Expression des Proteins durch E. coli BL21 (Fischer, 2010)

Mit keinem dieser Ansätze gelang die Reinigung des nativ gefalteten Zielproteins. In allen Fällen wurden Hinweise auf die Fehlfaltung des Proteins gefunden oder das exprimierte Fusionsprotein hat sich als äußerst anfällig für proteolytischen Abbau erwiesen.

Als möglicher Grund dafür, dass sich E. coli offensichtlich nicht als Expressionssystem für die ECD von GC-C eignet, kommt das Fehlen von posttranslationalen Modifikationen, insbesondere von

Glykosylierungen, in Frage. GC-C wird in Säugerzellen als Gykoprotein exprimiert (Schulz et al., 1990; Vaandrager et al., 1993) jedoch ist die Rolle der Saccharidreste für die Funktion der Rezeptordomäne umstritten. Während einige Ergebnisse darauf hindeuten, dass die Glykosylierungen essentiell für die Bindung der Liganden sind (Hasegawa et al. , 1999c) deuten andere Studien darauf hin, dass die Glykosylierungen dazu dienen, die Faltung der extrazellulären Domäne in die native Konformation zu ermöglichen ohne selbst an der Ligandenbindung beteiligt zu sein (Hasegawa et al., 1999b; Ghanekar et al., 2004). Ein anderer Grund für die beobachtete Fehlfaltung der ECD ist möglicherweise das Fehlen einer für das humane Protein geeigneten Faltungsmaschinerie in E. coli. Möglicherweise sind spezielle eukaryotische Chaperone nötig um die ECD von GC-C zu falten, oder aber die korrekte Faltung des Membranproteins ist abhängig von einem eukaryotischen Sekretionssystem und vollzieht sich parallel zum Export ins extrazelluläre Medium. Da ein solcher Sekretionsapparat, bestehend aus endoplasmatischem Reticulum und Golgi-Apparat, in E. coli nicht vorhanden ist, kann sich möglicherweise die native Konformation der Rezeptordomäne nicht ausbilden.

Um die Einschränkungen des bakteriellen Expressionssystems zu überwinden wurde die Expression der ECD schließlich in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris unternommen.