Expression der extrazellulären Domäne von GC-C in Säugerzellen

Die Expression der ECD von GC-C wurde in einem weiteren Expressionssystem getestet. Da es sich gezeigt hat, dass mit P. pastoris kein Fragment von GC-C stabil exprimiert und gereinigt werden konnte, wurden Säugerzellen als mögliche Alternative ausgewählt. Die Ausarbeitung eines Expressionsprotokolls erfolgte mit Hilfe von Dr. Hanna Berkner und im Rahmen einer Kooperation mit Dr. Martin Klose aus dem Laboratorium von Prof. Dr. Markus Missler (Westfälische Wilhelms-Universität Münster).

4.4.4.1 DNA-Konstrukt für die Expression der ECD von GC-C

Die der Expression zugrundeliegende Strategie wird im Labor von Prof. Missler erfolgreich zur Expression von Proteinen angewendet. Als Konstrukt für die transiente Transfektion von Säugerzellen diente ein modifizierter pCMV5-Vektor (Kap. 3.2.4). In diesem Plasmid befindet sich die Transkription des Fremdgens unter der Kontrolle des Promotors von humanem Cytomegalovirus (CMV). Außerdem enthält es DNA-Sequenzen, die für das N-terminale Sekretionssignal von Neurexin-1 (NRXN) sowie eine C-terminal von der Multiplen Klonierungsstelle (MCS) gelegene IgG-Fusion kodieren. Der IgG-Fusionspartner dient zur Reinigung des Gesamtproteins durch Affinitätschromatographie mit Protein A Separose Beads (Kap. 3.7). In die MCS wurde das Gen der ECD von GC-C mit einer C-terminalen Thrombin-Proteaseschnittstelle kloniert. Das damit erhaltene Konstrukt wurde mit pCMV_Nrxn_ECD-GC-C-Thr bezeichnet (siehe Anhang, Kap. 10.1.11).

4.4.4.2 Expressionsversuche in HEK 293T und COS-7 Zellen

Zur Expression der Konstrukte wurden die Zelllinien COS-7 (abgeleitet von Nierenzellen der Westlichen Grünmeerkatze Chlorocebus sabaeus) und HEK 293T (engl. human embryonic kidney cells) verwendet. Die Zellen wurden in 10 cm Petrischalen mit DMEM-Medium, 10 % Fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung angezogen und bei Erreichen von etwa 50 % Konfluenz mit dem Expressionsplasmid transfiziert. Insgesamt wurden pro Zelltyp 2 Petrischalen mit insgesamt 20 ml Kulturmedium angezogen. COS-7 Zellen wurden unter Verwendung der sog.

DEAE Dextran Methode und HEK 293T Zellen durch die Calciumphosphat-Methode transfiziert (siehe Kap. 3.34.2). Da es sich um eine transiente Transfektion der Zellen handelt, ist es nicht

notwendig, den Expressionsvektor in den Zellen durch die Verwendung eines Selektionsmittels, etwa eines Antibiotikums, zu stabilisieren. Etwa 14 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium der Kulturen zu DMEM mit 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung gewechselt, da im Fetalen Rinderserum IgG-Proteine enthalten sind, die bei der Reinigung des Zielproteins aus dem Medium stören würden. Die Expression des Fusionsproteins erfolgte für drei Tage bei 37 °C und 5

% CO2-Sättigung. Anschließend wurden die Überstande geerntet. Aus diesen wurde das Fusionsprotein durch die hochaffine Wechselwirkung des IgG-Anhangs mit Protein A Sepharose Beads isoliert (siehe Kap. 3.34.3). Zur Kontrolle der Expression wurde anschließend ein Teil Beads mit gebundenem ECD-GC-C-Thr-IgG in SDS-Puffer gelöst und durch SDS-PAGE analysiert (Abb.

4.46).

Aus Abb. 4.46 geht hervor, dass in den Überständen der HEK 293T Zellen deutlich mehr Protein enthalten ist als in den Überständen der COS-7 Zellen. In allen Überständen ist eine intensive Bande bei etwa 230 – 250 kDa zu erkennen, bei der es sich um das sekretierte Zielprotein in dimerer Form handelt. Die starke Dimerisierung ist auf den IgG-Fusionsanhang zurückzuführen, wie aus Kontrollexperimenten, bei denen nur IgG exprimiert wurde, hervorgeht (siehe Kap.

4.4.4.3).

Wegen der größeren Expressionsrate der HEK 293T Zellen, wurden diese für die weiteren Versuche verwendet.

Abb. 4.46: Expression der ECD-GC-C-Thr-IgG in COS-7 und HEK 293T Zellen. 12 % SDS-Polyacrylamidgel beladen mit den durch Protein A Beads isolierten Proteine aus dem Kulturüberstand. Aufgetragen ist jeweils die Menge an Protein, die in 10 ml Kulturmedium enthalten ist. S: Molekulargewichtsstandard

Nach den beschriebenen Expressionstests wurde eine größere Kultur von HEK 293T Zellen, 27 Petrischalen mit insgesamt 270 ml Kulturmedium , mit pCMV_Nrxn_ECD-GC-C-Thr transfiziert.

Als Negativkontrolle wurde eine 10 ml Petrischale mit H2O transfiziert. Außerdem wurden die Zellen in einer weiteren Schale mit dem leeren pCMV_Nrxn Vektor, der nur für IgG kodiert, transfiziert. Die Anzucht wurde wie bei den Expressionstests beschrieben durchgeführt und nach drei Tagen wurden die Zellüberstande geerntet und das sekretierte Fusionsprotein mit Protein A Beads isoliert. Außerdem wurde ein Teil der Zellen lysiert. Abb. 4.47 A zeigt ein SDS-Acrylamidgel auf dem die Kulturüberstände und Zelllysate der angezogenen Zellen, inklusive beider Kontrollen, analysiert wurden.

Sowohl im Kulturüberstand als auch im Zelllysat ist jeweils eine intensive Bande bei etwa 250 kDa zu erkennen, die dem dimerisierten Fusionsprotein entspricht (Abb. 4.47 A, Bahnen 4 und 5). Dies konnte auch durch einen Peptidmassen-Fingerprint nachgewiesen werden (siehe Kap. 3.36). Die IgG-Kontrolle zeigt sehr dicke Banden, die einer großen Menge an sekretiertem IgG im Zellüberstand entsprechen. Die Bande, die IgG entspricht, wandert auf einer Höhe von etwa 54 kDa und repräsentiert ein IgG-Dimer. Das monomere IgG, mit einem Molekulargewicht von 26,8 kDa, wird erst nachdem die Gelprobe für 10 min bei 95 °C gekocht wurde, detektierbar (Abb. 4.47 A, Bahnen 1 und 2 bzw. 7 und 8). Weiterhin fällt auf, dass in den Proben der mit pCMV_Nrxn_ECD-GC-C-Thr transfizierten Zellen deutlich mehr Fremdbanden detektierbar sind als in der Negativkontrolle, die mit Wasser transfiziert wurde (Abb. 4.47 A, Bahnen 3 und 6). Auch in der IgG-Kontrolle sind weniger intensive fremde Banden zu erkennen. Aus diesem Befund wird geschlossen, dass es sich bei den Fremdbanden nicht um Wirtsproteine handelt, sondern vermutlich um Fragmente des exprimierten Fusionsproteins, welche durch proteolytischen Abbau entstehen.

Das exprimierte ECD-GC-C-Thr-IgG weißt wohl nur eine stark begrenzte Stabilität im Kulturüberstand der Zellanzucht auf.

4.4.4.3 Einfluss der Glykosylierung auf die Expression von ECD-GC-C-Thr-IgG in HEK 293T

In einem weiteren Experiment wurde die Proteinexpression in Gegenwart von 2,5 µg/ml Tunicamycin durchgeführt und die Ergebnisse durch SDS-PAGE analysiert (Abb. 4.47 B).

Abb. 4.47: Expression von pCMV_Nrxn_ECD-GC-C-Thr in HEK 293T. 12 % SDS-Polyacrylamdigele die mit Proben von aus Kulturüberständen isoliertem Protein und Zelllysaten beladen wurden. Die Expression erfolgte in A) Abwesenheit bzw. B) Gegenwart von 2,5 µg/ml Tunicamycin. Als Kontrollen wurden Zellen verwendet, die mit Wasser oder pCMV_Nrxn transfeziert wurden. S: Molekulargewichtsstandard; 1 und 9: Kulturüberstand der mit pCMV_Nrxn transfezierten Zellen, Probe gekocht; 2 und 10: Kulturüberstand der mit pCMV_Nrxn transfezierten Zellen, Probe nicht gekocht; 3 und 11: Kulturüberstand der mit Wasser transfezierten Zellen; 4 und 12: Kulturüberstand der mit pCMV_Nrxn_ECD-GC-C-Thr transfezierten Zellen; 5 und 13: Zelllysat der mit pCMV_Nrxn_ECD-GC-C-Thr transfezierten Zellen; 6 und 14: Zelllysat der mit Wasser transfezierten Zellen; 7 und 15: Zelllysat der mit pCMV_Nrxn transfezierten Zellen, Probe nicht gekocht; 8 und 16: Zelllysat der mit pCMV_Nrxn transfezierten Zellen, Probe gekocht.

Die aufgetragenen Proben der Kulturüberstände entsprechen jeweils dem in 10 ml (Kontrollen, Banden 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 14, 15, 16) bzw. 30 ml (Zielprotein, Banden 4, 5, 12, 13) Medium enthaltenen Protein.

Tunicamycin inhibiert die Synthese von N-Glykanen und resultiert somit in der Expression von nicht glykosyliertem ECD-GC-C-Thr-IgG (Tkacz & Lampen, 1975). Abb. 4.47 B zeigt, dass nach Verwendung von Tunicamycin im Nährmedium, kaum ECD-GC-C-Thr-IgG in Kulturüberstand und Zelllysat detektierbar war, ganz im Gegensatz zur IgG-Kontrolle, bei der kein großer Einfluss von Tunicamycin auf die Menge an exprimiertem Protein erkennbar war. Offensichtlich wird durch die fehlende Glykosylierung entweder die Expression des Fusionsproteins stark gehemmt oder seine Stabilität so stark reduziert, dass das exprimierte Protein schnell abgebaut wird.

4.4.4.4 Stabilität von isoliertem ECD-GC-C-Thr-IgG

Das aus dem Kulturüberstand der HEK 293T Zellen isolierte ECD-GC-C-Thr-IgG Fusiosprotein war durch die von seinem IgG-Anhang vermittelte hochaffine Wechselwirkung an die Protein A Sepharose gebunden. Da in diesem Zustand eine weiter Charakterisierung des Proteins unmöglich ist, musste es von den Beads eluiert werden. Dazu standen zwei Strategien zur Verfügung. Die Elution des Gesamtproteins durch einen sehr sauren Puffer (50 mM Glycin; pH 1,8; 100 mM NaCl), bei dem die Interaktion von IgG und Protein A aufgehoben wird, oder die Spaltung des Fusionsproteins durch Thrombin, bei der ECD-GC-C freigesetzt wird. Die erste erwähnte Strategie eignet sich nicht zur Reinigung des Proteins, da es bei dem niedrigen pH-Wert zur irreversiblen Entfaltung der ECD von GC-C kommt. Dies wurde von Dr. Hanna Berkner und Dr. Martin Klose in einem Experiment überprüft, in dem durch Oberflächenplasmonresonanz-Spektroskopie keine Wechselwirkung zwischen dem sauer eluierten Fusionsprotein und Uroguanylin bzw. STh nachgewiesen werden konnte. Um das an die Protein A Beads gebundene Fusionsprotein zu spalten wurden diese in Thrombin-Puffer (20 mM Tris/HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 2,5 mM CaCl2) gewaschen und resuspendiert. Nach Zugabe von Thrombin wurde die Probe für 16 h bei 4 °C inkubiert und anschließend durch SDS-PAGE analysiert (Abb. 4.48).

Nach der Thrombin-Spaltung kann an den Protein A Sepharose Beads der gespaltene IgG-Fusionspartner deutlich nachgewiesen werden. Im Überstand der Thrombin-Spaltung kann jedoch kein lösliches ECD-GC-C nachgewiesen werden (Abb. 4.48, Bahnen 3 und 4). Zudem sind an den Beads verschiedene schwache Banden detektierbar, die auf einen Abbau des Proteins hinweisen könnten. Möglicherweise kommt es zu unspezifischer Spaltung des rekombinanten Proteins durch die Thrombin-Protease (Di Cera & Cantwell, 2001) oder aber andersartiger Wirtsproteasen, die in der Probe mitgeschleppt werden. Der Überstand der Thrombin-Spaltung zeigte noch eine schwache Absorption bei 280 nm (A280 = 0,1), die einer Konzentration von ECD-GC-C von 1,7 µM

entsprechen würde (V = 800 µl). Jedoch konnte, aufgrund der geringen Probenmenge, durch SDS-PAGE nicht geklärt werden, ob es sich dabei um ein Protein mit der passenden Größe handelte.

Abb. 4.48: Stabilität von ECD-GC-C-Thr-IgG nach der Isolierung aus dem Kulturüberstand von HEK 293T Zellen. S: Molekulargewichtsstandard; 1: Protein A Beads beladen mit ECD-GC-C-Thr-IgG, Probe nicht gekocht; 2: Protein A Beads beladen mit ECD-ECD-GC-C-Thr-IgG, Probe gekocht; 3: Protein A Beads nach Thrombin-Spaltung, Probe nicht gekocht; 4:

Überstand der Thrombin-Spaltung, durch Vivaspins MWCO 10000 ca. 5fach aufkonzentriert.

Die in Bahnen 1 und 2 aufgetragene Probe entspricht dem aus 40 ml Kulturüberstand isolierten Protein.