Gelelektrophorese

3.10.1 Agarose-Gelelektrophorese von DNA

Zur Kontrolle von Größe und Reinheit von DNA, zumeist handelte es sich dabei um Plasmidpräparationen (Kap. 3.11) oder durch PCR amplifizierte DNA-Fragmente (Kap. 3.15.4), wurde Agarose-Gelelektrophorese eingesetzt. Die Elektrophorese wurde in MINI-SUB® CELL GT Gelkammern (Bio-Rad Laboratories GmbH, München) mit etwa 10 cm × 6 cm großen Gelen durchgeführt. Zur Herstellung der Gele wurde 0,8 % (w/v) oder 1,5 % (w/v) Agarose in TBE-Puffer (90 mM Tris/HCl, 90 mM H3BO3, 2 mM EDTA, pH 8,0) durch Erhitzen gelöst. Nach dem Abkühlen der Lösung auf etwa 60 °C wurden 5 µl 1 % Ethidiumbromid-Lösung pro 100 ml Gel zugegeben.

Die zu analysierenden DNA-Proben wurden mit 2/5 Volumen eines Gelauftragspuffers (50 mM

EDTA, 50 % Glycerin (v/v), 0,15 % Bromphenolblau (w/v) und 0,15 % Xylencyanol (w/v)) gemischt und auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei 99 V und 65 mA durchgeführt und bei einem Unterschied der Laufstrecken der beiden Farbmarker von etwa 2 cm beendet. Die fluoreszenzmarkierten DNA-Banden wurden mit Hilfe eines Geldokumentationssystems (GEL DOC^TM 2000 bzw. GEL DOC^TM XR+, Bio-Rad Laboratories GmbH, München) aufgezeichnet. Als DNA-Längenstandard wurden λ/Hind III DNA (23,13 kb; 9,415 kb; 6,557 kb; 4,631 kb; 2,322 kb;

2,027 kb; 0,564 kb; 0,125 kb) oder peqGOLD DNA-Leiter Mix (10 kb; 8 kb; 6 kb; 4 kb; 3,5 kb; 3 kb; 2,5 kb; 2 kb; 1,5 kb; 1,2 kb; 1 kb; 0,9 kb; 0,8 kb; 0,7 kb; 0,6 kb; 0,5 kb; 0,4 kb; 0,3 kb; 0,2 kb;

0,1 kb; peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) verwendet.

3.10.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteinen

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde verwendet um Proteingemische zu charakterisieren und die Reinheit von Proteinproben zu kontrollieren. Dabei wurde das diskontinuierliche System nach Laemmli (Laemmli, 1970) verwendet. Die Gelelektrophorese wurde als vertikale Plattengelelektrophorese in Mighty Small SE 250 Elektrophoresekammern (Hoefer Scientific Instruments, Holliston, MA, USA) bei 32 mA und 200 V durchgeführt. Die Gele waren zusammengesetzt aus etwa 7 cm langen Trenngelen und etwa 1 cm langen Sammelgelen und waren 10 cm breit und etwa 0,75 cm mächtig.

Tab. 3.4: Pipettierschema zur Herstellung von je 6 10 %igen, 15 %igen und 19 %igen SDS-Polyacrylamidgelen.

Trenngel

Sammelgel

10% 15% 19%

30 % Acrylamid 11,7 ml 17,5 ml 22,2 ml 3 ml

2 % N,N'-Methylenbisacrylamid 4,7 ml 7,0 ml 8,9 ml 1 ml

3 M Tris/HCl, pH 8,8 4,4 ml 4,4 ml 4,4 ml

-0,5 M Tris/HCl, pH 6,8 - - - 5 ml

10 % SDS 350 µl 350 µl 350 µl 120 µl

H2O 13,4 ml 5,5 ml - 10,7 ml

Na2SO3 5 mg 5 mg 5 mg

-10 % APS 300 µl 300 µl 300 µl 200 µl

TEMED 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl

Je nach der Größe der zu erwartenden Proteine wurden 19 %ige, 15 %ige oder 10 %ige SDS-Gele gegossen. Beim Gießen der Gele wurde das in Tab. 3.4 dargestellte Pipettierschema eingehalten.

Natriumdodecylsulfat (SDS) wurde als denaturierendes Detergens verwendet. Als radikalische Polymerisations-Starter dienen die Chemikalien Ammoniumperoxodisulfat (APS) und N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED), nach deren Zugabe die Gellösung in die Kammern gegossen wurde.

Als Laufpuffer wurde 50 mM Tris/HCl, pH 8,3, 385 mM Glycin und 0,1 % (w/v) SDS verwendet.

Die Proteinproben wurden mit gleichem Volumen Probenpuffer (2 × Roti-Load® (Roth Karlsruhe)) gemischt und bei 98 °C für 5 min denaturiert. Bakterienzellpellets wurden mit 100 µl 1 × Roti-Load® versetzt und bei 98 °C 10 min lang denaturiert. Hefezellpellets wurden 100 µl Breaking Buffer (50 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM EDTA, 5 % Glycerol) resuspendiert, mit etwa einem Volumen sauer behandelter Glasperlen (Durchmesser 0,5 mm) versetzt und anschließend 8 Mal je etwa 30 s am Vortex gemischt. Die Proben wurden dann durch Zentrifugation von den Glasperlen und Zelltrümmern getrennt, 1 : 1 mit 2 × Roti-Load® gemischt und 10 min bei 98 °C inkubiert.

Die Gelelektrophorese wurde üblicherweise beendet sobald der im Probenpuffer enthaltene Bromphenolblau-Farbmarker, der im Probenpuffer enthalten ist, das untere Gelende erreicht hatte.

Die Probeinbanden wurden sichtbar gemacht, indem die Gele für etwa 30 min in einer Färbelösung (0,05 % (w/v) Coomassie Brilliant Blau R-250, 10 % (v/v) Essigsäure) inkubiert wurden.

Anschließend wurden die Gele bis zum vollständigen Entfärben des Gelhintergrundes, für etwa 8 h, in einer Entfärbelösung (10 % (v/v) Essigsäure) geschüttelt.

3.10.3 Western Blot

Der Western Blot diente dem spezifischen Nachweis der ECD von GC-C bei der Expression in P.

pastoris. Dabei wurden die Proteine durch SDS-PAGE (Kap. 3.10.2) aufgetrennt und auf eine Nitrozellulose-Membran (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Göttingen) transferiert. Der Nachweis erfolgte schließlich über einen spezifischen Antikörper. Im hier beschriebenen Fall wurde ein polyklonaler Anti-Hexahistidin-Antikörper (Genscript, Cat.-Nr. A00174) verwendet, der in Hasen hergestellt wurde und den Hexahistidin-Anhang des exprimierten GC-C-Konstrukts erkennt. Dieser gebundene primäre Antikörper wurde durch einen sekundären Antikörper, der in Ziegen hergestellt wurde und mit dem Enzym Alkalische Phosphatase (AP) gekoppelt war, detektiert. Die Bande der ECD von GC-C auf der Membran wurde durch eine Farbreaktion sichtbar gemacht.

Der Transfer der Proteine vom 10 % SDS-Gel auf die Nitrozellulose-Membran wurde als sog. semi-trockener Elektroblot durchgeführt. Nach der SDS-PAGE wurde der Blot wie in Abb. 3.5 dargestellt aufgebaut. Die Anode wurde mit einer Abdichtfolie bedeckt, aus der ein der Größe des Gels entsprechendes Fenster ausgeschnitten wurde. Auf die Anode wurden drei Lagen, Whatman Papier (Chromatography Paper, 3 MM CHR, Whatman International Ltd, Maidstone, UK), die Nitrozellulose-Membran, das SDS-Gel und schließlich drei weitere Lagen Whatman Papier passgenau gelegt. Das Whatman Papier und die Membran wurden mit Transfer-Puffer (25 mM Tris/HCl, pH 8,3, 192 mM Glycin, 20 % Methanol (v/v)) befeuchtet. Der Transfer wurde bei einer Stromstärke von 40 mA für eine Dauer von 1 h in einer SEMI-PHOR^TM Blotting-Kammer (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA, USA) durchgeführt.

Dann wurde die Membran für 5 min in 20 ml Blocking-Puffer (1 × PBS, 10 % Milchpulver (w/v), 0,05 % Tween 20 (v/v)) geschwenkt. Über Nacht wurde die Membran in 20 ml Blocking-Puffer mit 1 µg/ml des anti-6xHis-Antikörpers (Cat.-Nr. A00174, Genscript, Piscataway, NJ, USA) inkubiert und anschließend 3 mal je 5 min in jeweils 20 ml Wasch-Puffer (1 × PBS, 0,05 % Tween 20 (v/v)) geschwenkt um den ungebundenen primären Antikörper zu entfernen. Die Membran wurde danach in 20 ml Blocking-Puffer mit 0,7 µg/ml des anti-Hasen Antikörper (Anti-Rabbit IgG – Alkaline Phosphatase, Sigma-Aldrich, Steinheim) für 2 h inkubiert. Schließlich wurde sie 3 mal 5 min in je 20 ml 1 × PBS und 3 mal 5 min in je 20 ml AP-Puffer (100 mM Tris/HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) gewaschen. Um schließlich die Farbreaktion, mit der die positiven Banden sichtbar gemacht werden, zu starten wurden zu den letzten 20 ml AP-Puffer 33 µl 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP, 42 mg/ml in DMF) und 66 µl Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT, 83 mg/ml in 70 % DMF (v/v)) zupipettiert. Durch die Aktivität von AP wird BCIP dephosphoryliert und anschließend von NBT oxidiert. Dabei bildet sich aus BCIP ein blauer Indigofarbstoff und aus Abb. 3.5: Schematischer Aufbau des semi-trockenenen Elektroblots, wie er in dieser Arbeit eingesetzt wurde.

NBT ein roter Farbstoff. Zusammen ergibt sich nach 5 – 10 min ein violetter Farbumschlag, der die durch die Antikörper detektierten Banden markiert.