6.1 Chemische Arbeiten
6.1.2 Synthetische Arbeiten
6.1.2.1 Tetrazinbausteine und Linker 6-Cyanonikotinsäure 52[89]
6-Cyanonikotinsäure (52) wurde ausgehend von Nikotinsäure-N-oxid (53) nach einer Vorschrift von Vorbrügge et al.[89] hergestellt. Nach Umkristallisation in H2O wurde ein bräunlicher kristalliner Feststoff in 68 % Ausbeute erhalten.
6-(6-(Pyrimidin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)nikotinsäure 37 [84]
Verbindung 37 wurde in Anlehnung an eine allgemeine von Wießler et al.[75c]
beschriebene Synthesevorschrift für Diaryl-substituierte Tetrazine dargestellt. 3,41 g (23 mmol, 1 eq) 6-Cyanonikotinsäure (52) und 2,42 g (23 mmol, 1 eq) 2-Pyrimidincarbonitril (51) wurden in 95 mL Ethanol suspendiert und auf 40° C erwärmt. Bei dieser Temperatur wurden unter Rühren 5,6 mL (115 mmol, 5 eq) Hydrazinmonohydrat
106 Experimenteller Teil
zugegeben. Für 8 h wurde bei dieser Temperatur weitergerührt. Nach dem Abkühlen wurde der orange Feststoff über einen Büchnertrichter abfiltriert, zweimal in je 100 mL Aceton ausgekocht, heiß abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Der orange Feststoff (2,6 g) wurde in 30 mL Eisessig suspendiert und bei Raumtemperatur wurden 1,8 mL (13,75 mmol, 1,5 eq) Isopentylnitrit zu getropft. Dabei färbte sich die Suspension nach 5 min violett. Nach 2 h Rühren bei RT wurden 100 mL Diethylether zugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei 4° C aufbewahrt. Der ausgefallene violette Feststoff wurde über einen Büchnertrichter abfiltriert, mit Diethylether nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. Der Feststoff wurde in 140 mL frisch destilliertem DMF auf 80° C erwärmt und nach Erreichen der Temperatur sofort abfiltriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt. Der feste Rückstand wurde in ca. 50 mL Methanol digeriert, abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Erhalten wurden 709 mg (11 % Ausbeute) violetter Feststoff.
Die analytischen Daten stimmen mit den Daten von Henning Beckmann[84] überein.
DC: Rf = 0,30 (DCM/MeOH 1:1)
1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): = 13.71 (br. s, 1H; COOH), 9.39 (dd, J = 2.1, 0.9 Hz, 1H;
H-2), 9,22 (d, 1H, J = 4,9 Hz, 2H, H-4‘‘ und H-6‘‘), 8.76 (dd, J = 8.3, 0.9 Hz, 1H; H-5), 8.61 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H, H-4), 7.86 (t, J = 4.9 Hz, 1H, H-5‘‘) ppm
13NMR (100,6 MHz, d6-DMSO): = 165.7, 162.9, 162.9 (quartäre C), 158.9 (4‘‘ und C-6‘‘), 158.5, 152.9 (quartäres C), 151.0 (C-2), 138.7 (C-4), 128.8 (quartäres C), 124.4 (C-5), 123.1 (C-5‘‘) ppm
2-(2-(2-(2-Azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)ethanol 60 [90]
Verbindung 60 wurde ausgehend von Tetraethylenglycol 58 nach einer Vorschrift von Shirude et al.[90] als gelbliches Öl in einer Ausbeute von 85 % über zwei Stufen erhalten.
6.1 Chemische Arbeiten 107
2-(2-(2-(2-Aminoethoxy)ethoxy)ethoxy)ethanol 61 [91]
Verbindung 61 wurde ausgehend von 60 nach einer Vorschrift von Svedhem et al.[91] als gelbliches Öl in 90 % Ausbeute erhalten.
N-(2-(2-(2-(2-Hydroxyethoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl)-6-(6-(pyrimidin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)nikotinamid 62
250 mg (0,88 mmol, 1 eq) Tetrazin 37 wurden in 10 mL abs. DMSO und 0,5 mL abs. Pyridin gelöst. 163 mg (1,42 mmol, 1,6 eq) N-Hydroxysuccinimid und 250 mg (1,3 mmol, 1,5 eq) EDC*HCl wurden bei Raumtemperatur zugegeben. Die Lösung wurde dann für 100 min auf 40° C erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 170 mg (0,88 mmol, 1 eq) Linker 61 in 5 mL abs. DMSO gelöst und während 1 h zugegeben. Es wurde eine weitere Stunde bei RT gerührt und die Lösung dann im Vakuum eingeengt.
Der Rückstand wurde einmal mit Toluol coevaporiert. Der rote Rückstand wurde in 40 mL DCM aufgenommen und zweimal mit je 25 mL H2O gewaschen. Die wässrigen Phasen wurden dreimal mit je 50 mL DCM und zweimal mit je 20 mL DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit 50 mL H2O gewaschen, die wässrige Phase wurde noch einmal mit 40 mL DCM re-extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet, filtriert und am Rotationsverdampfer eingeengt.
Das Produkt wurde nach säulenchromatographischer Aufreinigung mit DCM/ MeOH 10:1 als rotes Öl in 35 % Ausbeute erhalten.
DC: Rf = 0,38 (DCM/MeOH 10:1)
1H-NMR (400,1 MHz, CDCl3): = 9.40 (s, 1H; H-2), 9.12 (dd, J = 4.9, 1.3 Hz, 2H; H-4’’ und H-6’’), 8.80 (d, J = 8.0 Hz, 1H; H-5), 8.61 (t, J = 5.3 Hz, 1H; NH), 8.50 (dt, J = 8.5, 1.5 Hz, 1H, H-4), 7.59 (t, J = 4.9 Hz, 1H; H-5‘‘), 4.18 (bs, 1H; OH), 3.73-3.56 (m, 16H, CH2) ppm
13C-NMR (100,6 MHz, CDCl3): = 165.1, 163.7, 163.6, 159.4 (quartäre C), 158.6 (C-4‘‘ und C-6‘‘), 151.3 (quartäres C), 150.0 (C-2), 137.4 (C-4), 133.2 (quartäres C), 124.6 (C-5), 122.9 (C-5‘‘), 72.5, 70.7, 70.5, 70.2, 70.1, 69.8 (CH2), 61.4 (CH2OH), 40.3 (CH2NH) ppm
108 Experimenteller Teil
ESI-TOF-HRMS: ber.: [M+H]+: 457.1942, [M+Na]+: 479.1762, [M+K]+: 495.1501; gef.:
[M+H]+: 457.1775, [M+Na]+: 479.1578, [M+K]+: 495.1320
4-(6-(Pyrimidin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzoesäure 63[76b]
4-Cyanobenzoesäure (64) (7 g, 48 mmol, 1,0 eq) und Pyrimidin-2-carbonitril (51) (5 g, 48 mmol, 1,0 eq) wurden in abs. EtOH (20 mL) gelöst. Hydrazinmonohydrat (11,5 mL, 238 mmol, 5.0 eq) wurden zugegeben. Anschließend wurde die Reaktionsmischung für 9 h zum Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen auf RT wurde der orange Feststoff abfiltriert und mit wenig EtOH gewaschen. Um das symmetrisch substituierte Nebenprodukt Bis(pyrimidin-2-yl)-1,2,4,5-dihydrotetrazin (54) zu entfernen, wurde der Feststoff zweimal in Aceton (30 mL) zum Rückfluss erhitzt und heiß abfiltiriert. Der filtrierte orange Feststoff wurde in Eisessig (115 mL) suspendiert, und durch langsame Zugabe von Isopentylnitrit (4,5 mL, 33 mmol, 1,5 eq) wurde oxidiert. Nach Rühren über Nacht wurde Diethylether (190 mL) zugegeben, um den gebildeten rosa Feststoff auszufällen. Nach Abfiltrieren wurde das rosa Rohprodukt dreimal in Eisessig umkristallisiert, um das symmetrisch substituierte Nebenprodukt 4,4’-(1,2,4,5-Tetrazin-3,6-diyl)dibenzoesäure (67) zu entfernen. Das gewünschte Tetrazin 63 wurde als rosa Feststoff (3,0 g, 10,7 mmol, 23 %) erhalten, welcher geringe Spuren der Tetrazindibenzoesäure 67 enthielt.[76b]
DC: Rf = 0,11 (DCM/MeOH 10:1)
1H-NMR (400,1 MHz, DMSO-d6): = 13.35 (br. s, 1 H; COOH), 9.21 (d, J = 4.9 Hz, 2H; H-4”und H-6”), 8.71 (m, 2H; H-2 und H-6 oder H-3 und H-5), 8.25 (m, 2H; H-2 und H-6 oder H-3 undH-5), 7.84 (t, J = 4.9 Hz, 1 H; H-5”) ppm
13C-NMR (100,6 MHz, DMSO-d6): = 166.7 (COOH), 163.2, 162.9, 159.0 (quartäre C),158.5 (C-4” und C-6”), 135.3, 134.5 (quartäre C), 130.2 (C-2 und C-6 oder C-3 und C-5), 128.3(C-2 und C-6 oder C-3 und C-5), 127.9 (quartäre C), 123.0 (C-5”) ppm
ESI-TOF-HRMS: ber.: [M-H]-: 279.0645; gef.: [M-H]-: 279.0645
6.1 Chemische Arbeiten 109
N-(2-(2-(2-(2-Hydroxyethoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl)-4-(6-(pyrimidin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzamid 68[86]
101 mg (0,36 mmol, 1 eq) Tetrazin 63 wurden in 4 mL abs. DMSO und 0,2 mL abs. Pyridin gelöst. 104 mg (0,54 mmol, 1,5 eq) EDC*HCl und 62,2 mg (0,54 mmol, 1,5 eq) NHS wurden zugegeben und die rote Lösung wurde auf 45° C erwärmt. Nach 2,5 h Rühren wurde auf RT abgekühlt. 70 mg (0,36 mmol, 1 eq) Linker 61 wurden in 1 mL abs. DMSO gelöst und über 1 h zugetropft. Es wurde noch weitere 30 min gerührt, im Vakuum eingeengt und einmal mit Toluol coevaporiert. Der rote Rückstand wurde in 40 mL DCM aufgenommen und zweimal mit je 30 mL H2O gewaschen. Die wässrigen Phasen wurden viermal mit je 30 mL DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit 20 mL H2O gewaschen und diese Wasserphase wurde noch einmal mit 20 mL DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Nach säulenchromatographischer Aufreinigung (DCM/ MeOH 15:1) wurde das Produkt als rotes Öl (91 mg, 55 %) erhalten.[86]
DC: Rf = 0,31 (DCM/MeOH 15:1)
1H-NMR (400,1 MHz, CDCl3): = 9.14 (d, J = 4.9 Hz, 2H; H-4‘‘ und H-6‘‘), 8.79 (d, J = 8.4 Hz, 2H; 2 und 6 oder 3 und 5), 8.13 (d, J = 8.5 Hz, 2H; 2 und 6 oder H-3 und H-5), 8.05 (m, 1H, NH), 7.60 (t, J = 4.9 Hz, 1H; H-5‘‘), H-3.76-H-3.62 (m, 16H; CH2) ppm
13C-NMR (100,6 MHz, CDCl3) ): = 166.9, 164.3, 163.3, 159.6 (quartäre C), 158.6 (C-4‘‘
und C-6‘‘), 139.4, 133.7 (quartäre C), 128.8 (C-2 und C-6 oder C-3 und C-5), 128.6 (C-2 und C-6 oder C-3 und C-5), 122.7 (C-5‘‘), 72.6, 70.7, 70.6, 70.2, 69.9 (CH2), 61.5 (CH2OH), 40.2 (CH2NH) ppm
Elementaranalyse: ber.: C: 55,38, H: 5,53, N: 21,53, gef: C:55,15, H: 5,51, N: 21,44
2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl 4-(6-(pyrimidin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzoat 87[76b]
110 Experimenteller Teil
Tetrazin 63 (605 mg, 2,14 mmol, 1 eq) wurde in abs. DMSO/Pyridin (19:1, 25 mL) suspendiert. N-Hydroxysuccinimid (370 mg, 3,21 mmol, 1,5 eq) und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (500 mg, 3,22 mmol, 1,5 eq) wurden zugegeben. Die Lösung wurde für zwei Stunden auf 40 °C erwärmt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der rote Rückstand wurde in DCM (40 mL) aufgenommen und einmal mit Wasser (40 mL) gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit DCM extrahiert (dreimal mit je 40 mL). Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4
getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in DCM (40 mL) fast vollständig gelöst und durch Zugabe von Diethylether (ca.
300 mL) wurde das Produkt ausgefällt. Nach Filtration und Waschen mit Diethylether wurde Tetrazinsuccinimidylester 87 als roter kristalliner Feststoff (689 mg, 1,8 mmol, 85 %) erhalten. Hydrazinmonohydrat wurden zugegeben. Nach Abklingen der exothermen Reaktion wurden weitere 10 mL abs. Ethanol zugegeben und das Gemisch wurde für 2 h auf 80 °C erwärmt. Nach Zugabe von 10 mL Aceton wurde das Gemisch kurz bis zum Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde der braune Rückstand über einen Büchnertrichter abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Der erhaltene braune Feststoff (11,43 g) wurde in 200 mL Eisessig weitestgehend gelöst. 6,24 mL (60,8 mmol, 1,5 eq) Isoamylnitrit wurden zu getropft. Die zuvor braune Lösung färbte sich sofort violett. Für 3 h wurde bei RT
6.1 Chemische Arbeiten 111
gerührt, dann wurden 200 mL Et2O zugegeben. Über Nacht fiel ein violetter Feststoff aus.
Dieser wurde abfiltriert und in kaltem Eisessig suspendiert. Der verbleibende Feststoff wurde abfiltriert. Durch Zugabe von Et2O zum Filtrat fiel das gewünschte Produkt (3,81 g, 34 % Ausbeute) als violetter Feststoff aus.
DC: Rf = 0,28 (DCM/MeOH 1:1)
1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): = 9.38 (d, J = 2.0 Hz, 1H; H-2), 8.96 (dt, J = 4.7, 1.2 Hz, 1H; H-6‘‘), 8.73 (d, J = 8.1 Hz, 1H; H-5), 8.64 (d, J = 7.9 Hz, 1H; H-4), 8.60 (dd, J = 8.2, 2.1 Hz, 1H; 3‘‘) 8.17 (td, J = 7.8, 1.8 Hz, 1H; 4‘‘), 7.75 (ddd, J = 7.6, 4.7, 1.1 Hz, 1H; H-5‘‘) ppm
13C-NMR (100,6 MHz, d6-DMSO): = 165.8, 163.2, 163.0, 152.9 (quartäre C), 151.0 (C-2), 150.7 (C-6‘‘), 150.0 (quartäres C), 138.6 (C-3‘‘), 137.9 (C-4‘‘), 126.8 (C-5‘‘), 124.5 (C-4), 124.1 (C-5) ppm
ESI-TOF-HRMS: ber.: [M+H]+: 281.0781, gef.: [M+H]+: 281.0685
2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl 6-(6-(pyridin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)nikotinat 88
300 mg (1,07 mmol, 1 eq) Tetrazin 78 wurden in 10 mL abs. DMSO und 1 mL abs. Pyridin gelöst. 308 mg (1,6 mmol, 1,5 eq) EDC*HCl und 184 mg (1,6 mmol, 1,5 eq) NHS wurden zugegeben und die Lösung wurde für 2 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der rote Rückstand wurde in 100 mL DCM aufgenommen und mit 50 mL H2O gewaschen. Die wässrige Phase wurde dreimal mit je 50 mL DCM extrahiert.
Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit 50 mL H2O gewaschen, über MgSO4 getrocknet, filtriert und im Vakuum bis auf ca. 30 mL DCM eingeengt. 150 mL Et2O wurden zugegeben und das gewünschte Produkt fiel als rosa Feststoff aus. Dieser wurde über einen Büchnertrichter abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Das Produkt enthielt noch Verunreinigungen von NHS, und wurde nochmal in 30 mL DCM aufgenommen und mit 150 mL Et2O überschichtet. Nach erneutem Abfiltrieren wurde das Produkt als rosa Feststoff (401 mg, 1,07 mmol) erhalten. Das Produkt enthielt noch Verunreinigungen von NHS, wurde jedoch so weiter umgesetzt.
DC: Rf = 0,73 (DCM/MeOH 10:1)
112 Experimenteller Teil 151.2 (C-2), 150.8 (C-6‘‘), 150.7, 149.9 (quartäre C), 139.6 (C-4), 137.9 (C-4‘‘), 126.9 (C-5‘‘), 124.7 (C-4), 124.5 (C-5), 123.0 (quartäres C), 25.6 (CH2CH2) ppm
N-(2-(2-(2-(2-Hydroxyethoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl)-6-(6-(pyridin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)nikotinamid 82
100 mg (0,36 mmol. 1 eq) Tetrazin 78 wurden in 4 mL abs. DMSO und 0,2 mL abs. Pyridin suspendiert. 103 mg (0,54 mmol, 1,5 eq) EDC*HCl und 62 mg (0,54 mmol, 1,5 eq) NHS wurden zugegeben und die rote Lösung wurde für 2 h bei RT gerührt. 70 mg (0,36 mmol, 1 eq) Linker 61 wurden in 1 mL abs. DMSO gelöst und während 40 min zugetropft. Die Reaktionslösung wurde im Vakuum eingeengt und einmal mit Toluol coevaporiert. Der rote ölige Rückstand wurde in 40 mL DCM aufgenommen und zweimal mit je 30 mL H2O gewaschen. Die vereinigten wässrigen Phasen wurden dreimal mit je 30 mL DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit 25 mL H2O gewaschen, über MgSO4 getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Die Reinigung erfolgte säulenchromatographisch (DCM/ MeOH 10:1). Erhalten wurden 104 mg (63 % Ausbeute) roter Feststoff. (C-2), 150.0 (C-6‘‘), 137.7 (C-4‘‘), 137.2 (C-3‘‘), 133.0 (quartäres C), 126.8 (C-5‘‘), 124.8, 124.1 (C-4 und C-5), 72.5, 70.7, 70.5, 70.4, 70.2, 70.0 (CH2), 61.5 (CH2OH), 40.3 (CH2NH) ppm Elementaranalyse: ber.: C: 55,38, H: 5,53, N: 21,53, gef.: C:54,86, H: 5,57, N: 21,51
6.1 Chemische Arbeiten 113
4-(1,2,4,5-Tetrazin-3-yl)benzoesäure 83[94]
Die Vorschrift von Karver et al.[94] wurde etwas abgeändert, so dass das gewünschte Produkt nicht durch HPLC aufgereinigt werden musste. 4 g (27 mmol, 1 eq) 4-Cyanobenzoesäure (64), 11,2 g (108 mmol, 4 eq) Formamidinacetat (84) und 866 mg (27 mmol, 1 eq) Schwefel wurden als Feststoffe vorgelegt und gemischt. 13,2 mL (270 mmol, 10 eq) Hydrazinhydrat wurden zugegeben, anschließend 10 mL EtOH. Bis zum Abklingen der Gasentwicklung wurde die Reaktionsmischung im Eisbad gekühlt, danach 40 min zum Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde vom gelben Feststoff abfiltriert. Das orange Filtrat wurde in 50 mL Essigsäure gelöst und im Eisbad gekühlt. 9,3 g (135 mmol, 5 eq) NaNO2 wurden in 15 mL H2O gelöst und während 30 min zugetropft. Die Lösung färbte sich dabei rosa. Nach 1 h Rühren wurde der ausgefallene rosa Feststoff abfiltriert und zweimal in Essigsäure umkristallisiert. Erhalten wurde ein rosa Feststoff (346 mg, 6 % Ausbeute), der noch Spuren von Essigsäure enthielt. Die analytischen Daten stimmten mit der Literatur überein.
DC: Rf = 0,26 (DCM/MeOH 10:1)
1NMR (400,1 MHz, d6-DMSO): = 10.66 (s, 1H; 6’), 8.61 (d, J = 8.2 Hz, 2H; 3 und H-5 oder H-2 und H-6), 8.21 (d, J = 8.2 Hz, 2H; H-3 und H-H-5 oder H-2 und H-6) ppm
13C-NMR (100,6 MHz, d6-DMSO): = 166.7, 165.1 (quartäre C), 158.3 (C-6‘), 135.8, 134.33 (quartäre C), 130.3 (C-2 und C-6 oder C-3 und C-5), 128.0 (C-2 und C-6 oder C-3 und C-5) ppm
2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl 4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzoat 89
326 mg (1.6 mmol, 1 eq) Tetrazin 83 wurden in 10 mL abs. DMSO und 500 µL abs. Pyridin gelöst. 276 mg (2.4 mmol, 1.5 eq) NHS und 460 mg (2.4 mmol, 1.5 eq) EDC*HCl wurden zugegeben. Die Lösung wurde für 2 h bei RT gerührt und dann im Vakuum eingeengt. Der rote Rückstand wurde in 30 mL DCM aufgenommen und mit 30 mL H2O gewaschen. Die
114 Experimenteller Teil
wässrige Phase wurde 3 mal mit je 30 mL DCM extrahiert, Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit 20 mL H2O gewaschen, über MgSO4 getrocknet, filtriert und im Vakuum vom Lösungsmittel befreit. Der rote Rückstand wurde in 20 mL DCM gelöst und mit 80 mL Et2O überschichtet. Der ausgefallene Feststoff wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Erhalten wurden 87 mg (18 % Ausbeute) rosa Feststoff, der noch leichte
300 mg (1,48 mmol, 1 eq) Tetrazin 83 wurden in 10 mL abs. DMSO und 500 µL abs. Pyridin gelöst. 257 mg (2,23 mmol, 1,5 eq) NHS und 427 mg (2,23 mmol, 1,5 eq) EDC Hydrochlorid wurden zugegeben. Nach 2 h Rühren bei Raumtemperatur zeigte die DC Kontrolle (DCM/MeOH 10:1) eine vollständige Aktivierung. 286 mg (1,48 mmol, 1 eq) Linker 61 wurden in 1 mL abs. DMSO gelöst und innerhalb 1 h zugetropft. Nach weiteren 3 h Rühren wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand einmal mit Toluol coevaporiert. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch aufgereinigt.
(DCM/MeOH 20:1). Da das so erhaltene Produkt noch Verunreinigungen enthielt, wurde es in 40 mL DCM aufgenommen und mit 40 mL H2O gewaschen. Die wässrigen Phasen wurden mit DCM extrahiert (2*50 mL). Nach Trocknen der vereinigten organischen Phasen über MgSO4 und Entfernung des Lösungsmittels wurde es zusätzlich durch HPLC (40-80 % B in 20 min mit 0,1 % Ameisensäure) aufgereinigt. Es wurden 31 mg (6%
6.1 Chemische Arbeiten 115
13C-NMR (100,6 MHz, CDCl3): = 166.9, 166. 9 (quartäre C), 158.0 (6‘), 128.6 (2 und C-6 oder C-3 und C-5), 128.4 (C-2 und C-C-6 oder C-3 und C-5), 72.C-6, 70.7, 70.C-6, 70.C-6, 70.2, 69.9, 40.2 (CH2) ppm
N-Propylpent-4-enamid 70
1 g (5 mmol, 1 eq) Succinimidyl-Pent-4-enoat (47) wurden in DCM (10 mL) gelöst. 417 µL (5 mmol, 1 eq) Propylamin wurden zugegeben. Nach 5 h Rühren bei RT wurde das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand säulenchromatographisch (PE/EE 1:1) aufgereinigt. Das Produkt (618 mg, 86 % Ausbeute) wurde als weißes Öl erhalten.
DC: Rf = 0,26 (PE/EE: 1:1)
1H-NMR (400,1 MHz, CDCl3): = 5.81 (ddt, J = 16.9, 10.2, 6.5 Hz, 1H; =CH), 5.59 (bs, 1H;
NH), 5.06 (dd, J = 17.2, 1.7 Hz, 1H; =CH2), 4.99 (dd, J = 10.3, 1.5 Hz), 3.24-3.16 (m, 2H;
CH2CH2CH3), 2.41-2.34 (m, 2H; C(O)CH2CH2), 2.29-2.22 (m, 2H; C(O)CH2CH2), 1.50 (h, J = 7.4 Hz, 2H; CH2CH2CH3), 0.97 (t, J = 7.4 Hz, 3H; CH2CH2CH3) ppm
13C-NMR (100,6 MHz, CDCl3): = 172.3 (CO), 137.3 (=CH), 115.6 (=CH2), 41.3 (CH2CH2CH3), 36.1 (C(O)CH2CH2), 29.8 (C(O)CH2CH2), 23.0 (CH2CH3), 11.5 (CH2CH3) ppm
4-(4/5-(3-Oxo-3-(propylamino)propyl)-6-(pyrimidin-2-yl)pyridazin-3-yl)-N-propylbenzamid[86]
36,6 mg (0,11 mmol, 1 eq) Tetrazinpropylamid 69 wurden in 2 mL DMSO gelöst. 19 mg Pentensäurepropylamid 70 wurden in 0,5 mL DMSO gelöst und zugegeben. Nach Rühren
116 Experimenteller Teil
bei Raumtemperatur für 3 Tage wurde das Lösungsmittel entfernt, der Rückstand säulenchromatographisch (DCM/MeOH 10:1) aufgereinigt und das Produkt wurde als Tautomerengemsich in nahezu quantitativer Ausbeute (50,3 mg, 0,11 mmol) erhalten, wobei die LCMS Analyse bereits teilweise Oxidation zeigte. Zur vollständigen Oxidation wurde das Tautomerengemisch (50,3 mg) in 2 mL Essigsäure gelöst, 17 µL (0,12 mmol, 1,1 eq) Isoamylnitrit wurden zugegeben, und es wurde für 3 h bei RT gerührt. Nach säulenchromatographischer Aufreinigung (DCM/MeOH 10:1) wurde das Pyrimidin als Gemisch der Regioisomeren 73 und 74 (1:1,6) (37 mg, 78 %) erhalten. Ein Teil des Produktes wurde zusätzlich durch RP-HPLC mit Acetonitril in Wasser mit je 0,1 % Ameisensäure (30-80 % in 30 min) aufgereinigt, um die Regioisomere zu trennen.
DC: Rf = 0,45 (DCM/MeOH 10:1) C-6‘‘), 139.7, 139.4, 135.6 (quartäre C), 129.5 3 und C-5), 127.2 2 und C-6), 126.9 (C-5’), 121.2 (C-5’’), 41.9 (Ar-C(O)NHCH2), 41.4 (CH2C(O)NHCH2), 35.3 (CH2C(O)NH), 27.7 C-6‘‘), 157.3, 140.7, 138.7, 136.4 (quartäre C), 127.7 (C-2 und C-6 oder C-3 und C-5), 127.7
6.1 Chemische Arbeiten 117
(C-3 und C-5 oder C-2 und C-6), 125.8 (C-4’), 120.8 (C-5’’), 42.0 (Ar-C(O)NHCH2), 41.5 (CH2C(O)NHCH2), 36.7 (CH2C(O)NH), 28.1 (CH2CH2C(O)NH), 23.1 (Ar-C(O)NHCH2CH2), 22.9 (CH2C(O)NHCH2CH2), 11.6 (Ar-C(O)NHCH2CH2CH3), 11.4 (CH2C(O)NHCH2CH2CH3) ppm 6.1.2.2 Kohlenhydratderivate
Succinimidyl-Pent-4-enoat 47[85]
4-Pentensäure wurde nach Smulik et al.[85] zum Succinimidylester 47 in 85 % Ausbeute umgesetzt.
Succinimidyl-Hex-5-enoat 48[86]
364 mg (3,19 mmol, 1 eq) Hexensäure und 514 mg (4,46 mmol, 1,4 eq) NHS wurden in 12 mL abs. THF gelöst. 790 mg (3,83 mmol, 1,2 eq) DCC wurden in 6 mL abs. THF gelöst und zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht bei RT gerührt. Der ausgefallene weiße Feststoff wurde abfiltriert und mit THF nachgewaschen. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt. Nach säulenchromatographischer Aufreinigung (PE/ EE 1:1) wurde das Produkt (600 mg, 89% Ausbeute) als milchiges Öl erhalten.
DC: Rf = 0,5 (PE/ EE 1:1)
1H-NMR (400,1 MHz, CDCl3): = 5.80-5.69 (m, 1H; =CH, H-2), 5.07-4.97 (m, 2H; =CH2, H-1), 2.77 (s, 4H, CH2, H-10 und H-11), 2.57 (t, J = 7.1 Hz, 2H; CH2, H-5), 2.14 (q, J = 7.1 Hz, 2H; CH2, H-3), 1.81 (quint., J = 7.2 Hz, 2H; CH2, H-4) ppm
13C-NMR (100,6 MHz, CDCl3): = 169.3, 168.5 (CO), 136.9 (C-2), 116.1 (C-1), 32.5 (C-3), 30.1 (C-5), 25.6 (C-10 und C-11), 23.7 (C-4) ppm
118 Experimenteller Teil
1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-N-4-pentenoylmannosamin 49[86]
506 mg (2,3 mmol, 1 eq) Mannosaminhydrochlorid 46 wurden in 17 mL abs. MeOH vorgelegt. 4,6 mL (2,3 mmol, 1 eq) einer 0,5 M NaOMe Lösung in Methanol wurden unter N2-Atmosphäre zugetropft. Nach 90 min Rühren bei RT wurden 532 mg (2,7 mmol, 1,2 eq) Succinimidyl-Pent-4-enoat (47) in 2 mL abs. MeOH gelöst, und zugetropft. Nach 46 h Rühren wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde säulenchromatographisch (DCM/ MeOH 5:1) aufgereinigt. Das Produkt 44 wurde als klares Öl (348 mg, 58 % Ausbeute) erhalten. 118 mg davon wurden in 3 mL abs. Pyridin gelöst und mit 0,6 mL Essigsäureanhydrid versetzt. Nach 3 h Rühren bei RT wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der gelbe Rückstand wurde in 25 mL DCM aufgenommen und mit je 20 mL 10 %iger KHSO4, ges. NaHCO3 und ges. NaCl gewaschen, über MgSO4 getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Die Aufreinigung erfolgte durch Säulenchromatographie (PE/ EE 1:1). Das Produkt (143 mg, 74 % Ausbeute) wurde als gelblicher schaumiger Feststoff als Mischung der Anomeren (/ 1,4:1) erhalten. Ein Teil der Anomerenmischung wurde durch Normalphasen-HPLC (45 % EE in n-Hexan) aufgreinigt, um die Anomeren zu trennen.
DC: Rf = 0,2 (PE/ EE 1:1)
Elementaranalyse: ber.: C: 53.14, H: 6.34, N: 3.26, gef: C: 52.98, H: 5.91, N: 3.39
49-: 1H-NMR (400,1 MHz, CDCl3): = 6.01 (d, J = 1.8 Hz, 1H; H-1), 5.93-5.79 (m, 1H;=CH),
6.1 Chemische Arbeiten 119
3.80 (ddd, J = 9.6, 5.1, 2.5 Hz, 1H; H-5), 2.47-2.34 (m, 4H; CH2CH2), 2.10 (s, 6H; 2 OAc), 2.06 (s, 3H; OAc), 2.00 (s, 3H; OAc) ppm
13C-NMR (100,6 MHz, CDCl3): = 173.0, 170.6, 170.2, 169.8, 168.4 (C=O), 136.8 (=CH), 116.2 (=CH2), 90.8 (C-1), 73.6 (C-5), 71.5 (C-3), 65.4 (C-4), 62.0 (C-6), 49.6 (C-2), 36.1 (CH2), 29.7 (CH2), 20.93, 20.90, 20.87, 20.83 (C(O)CH3) ppm
1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-N-5-hexenoylmannosamin 50[86]
527 mg (2,4 mmol, 1 eq) Mannosaminhydrochlorid 46 wurden in 17 mL abs. MeOH vorgelegt. Unter N2-Atmosphäre wurden 4,8 mL (2,4 mmol, 1 eq) einer 0,5 M Natriummethanolatlösung in Methanol zu getropft und für 90 min bei RT gerührt. 582 mg (2,7 mmol, 1,13 eq) Succinimidyl-Hex-5-enoat (48) wurden in 0,5 mL abs. MeOH gelöst und zu getropft. Es wurde für 18 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der gelbe Rückstand wurde in 15 mL abs. Pyridin gelöst und mit 3 mL Essigsäureanhydrid versetzt. Die Lösung wurde für 24 h bei RT gerührt, anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der orange Rückstand wurde in 125 mL DCM aufgenommen und mit je 100 mL 10 %iger KHSO4, ges. NaHCO3 und ges. NaCl gewaschen, über MgSO4 getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Die Aufreinigung erfolgt durch Säulenchromatographie (PE/ EE 1:1). Das Produkt wurde als gelblicher schaumiger Feststoff (460 mg, 45 % Ausbeute) als Anomerengemisch (/ 2:1) erhalten.
Ein Teil der Anomerenmischung wurde durch Normalphasen-HPLC (45 % EE in n-Hexan) auf gereinigt, um die Anomeren zu trennen.
DC: Rf = 0,2 (PE/ EE 1:1)
Elementaranalyse: ber.: C: 54,17, H: 6,59, N: 3,16, gef: C: 54,14, H: 6,63, N: 3,30
50-: 1H-NMR (400,1 MHz, CDCl3): = 6.02 (d, J = 1.8 Hz, 1H; H-1), 5.85-5.72 (m, 1H; =CH), 5.65 (d, J = 9.2 Hz, 1H; NH), 5.33 (dd, J = 10.2, 4.4 Hz, 1H; 3), 5.17 (t, J = 10.2 Hz, 1H; H-4), 5.12-4.99 (m, 2H; =CH2), 4.66 (ddd, J = 9.3, 4.5, 1.9 Hz, 1H; H-2), 4.28 (dd, J = 12.5, 4.6 Hz, 1H; H-6b), 4.09-4.01 (m, 2H; H-5 und H-6a), 2.26 (t, J = 7.4 Hz, 2H; =CHCH2), 2.16-2.11 (m, 2H; C(O)CH2), 2.18 (s, 3H; OAc), 2.10 (s, 3H; OAc), 2.06 (s, 3H; OAc), 2.00 (s, 3H; OAc), 1.84-1.68 (m, 2H; =CHCH2CH2) ppm
120 Experimenteller Teil
13C-NMR (100,6 MHz, CDCl3): = 172.9, 170.6, 170.1, 169.8, 168.3 (C=O), 137.8 (=CH), 115.8 (=CH2), 91.9 (C-1), 70.3 (C-5), 69.1 (C-3), 65.6 (C-4), 62.2 (C-6), 49.3 (C-2), 35.8 (=CHCH2), 33.0 (C(O)CH2), 24.7 (=CHCH2CH2), 21.0, 20.87, 20.86, 20.78 (C(O)CH3) ppm 50-: 1H-NMR (400,1 MHz, CDCl3): = 5.86 (d, J = 1.8 Hz, 1H; H-1), 5.83-5.70 (m, 1H; =CH), 5.73 (d, J = 9.1 Hz, 1H; NH), 5.16-5.00 (m, 4H; =CH2, H-3 und H-4), 4.79 (ddd, J = 9.0, 3.9, 1.8 Hz, 1H; H-2), 4.29 (dd, J = 12.5, 5.1 Hz, 1H; H-6b), 4.11 (dd, J = 12.5, 2.5 Hz, 1H; H-6a), 3.80 (ddd, J = 9.6, 5.1, 2.5 Hz, 1H; H-5), 2.30 (dt, J = 7.2, 1.2 Hz, 2H; C(O)CH2), 2.18-2.10 (m, 2H; =CHCH2), 2.10 (s, 6H; 2 OAc), 2.06 (s, 3H; OAc), 2.01 (s, 3H; OAc), 1.78 (quint. J = 7.3 Hz, 2H; =CHCH2CH2) ppm
13C-NMR (100,6 MHz, CDCl3): = 173.6, 170.6, 170.2, 169.8, 168.4 (C=O), 137.9 (=CH), 115.8 (=CH2), 90.8 (C-1), 73.6 (C-5), 71.6 (C-3), 65.3 (C-4), 62.0 (C-6), 49.5 (C-2), 36.0 (=CHCH2), 32.9 (C(O)CH2), 24.9 (=CHCH2CH2), 20.93, 20.89, 20.86, 20.82 (C(O)CH3) ppm
Succinimidyl-Pent-4-inoat 114
In Anlehnung an eine Vorschrift von Chang et al.[31] wurden 500 mg (5 mmol, 1 eq) Pentinsäure und 806 mg (7 mmol, 1,4 eq) NHS in 20 mL abs. THF gelöst und auf 0 °C gekühlt. 1,3 g (6 mmol, 1,2 eq) DCC wurden zugegeben und nach 10 min wurde die Kühlung entfernt. Über Nacht wurde bei RT gerührt, dann wurde der weiße Feststoff abfiltriert und mit THF nachgewaschen. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt. Der verbleibende Rückstand wurde säulenchromatographisch (PE/ EE 1:1) auf gereinigt und das Produkt wurde als weißer Feststoff (913 mg, 94 % Ausbeute) erhalten.
DC: Rf = 0,39 (PE/ EE 1:1)
1H-NMR (400,1 MHz, CDCl3): = 2.87 (dd, J = 8.3, 6.6 Hz, 2H; CH2, H-4), 2.83 (s, 4H; CH2, H-9 und H-10), 2.67-2.57 (m, 2H; CH2, H-3) 2.05 (t, J = 2.6 Hz, 1H, H-1) ppm
13C-NMR (100,6 MHz, CDCl3): = 169.0, 167.1 (CO), 80.9 (C-2), 70.2 (C-1), 30.5 (C-4), 25.7 (C-9 und C-10), 14.3 (C-3) ppm
6.1 Chemische Arbeiten 121
1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-N-4-pentinoylmannosamin 110[31]
Verbindung 110 wurde ausgehend von Mannosaminhydrochlorid 46 und Succinimidyl-Pent-4-inoat (114) in 77 % Ausbeute in Anlehnung an eine Vorschrift von Chang et al.[31]
synthetisiert.
1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-N-azidoacetylmannosamin 105[30]
1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-N-azidoacetylmannosamin (105) wurde ausgehend von Mannosaminhydrochlorid 46 nach einer Vorschrift von Saxon und Bertozzi[30] über zwei Stufen in 23 % Ausbeute synthetisiert.
1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-N-azidoacetylglucosamin115[32a]
1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-N-azidoacetylglucosamin (115) wurde ausgehend von Glucosaminhydrochlorid nach einer Vorschrift von Vocadlo et al.[32a] über zwei Stufen in 22 % Ausbeute dargestellt.
122 Experimenteller Teil
1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-N-azidoacetylgalactosamin 104[23]
1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-N-azidoacetylgalactosamin (104) wurde ausgehend von Galactosaminhydrochlorid nach einer Vorschrift von Hang et al.[23] in 17 % Ausbeute über zwei Stufen synthetisiert.
6.1.2.3 Biotinkonjugate
N-(13-Amino-4,7-10-trioxatridecanyl)biotinamid 97[97]
Verbindung 97 wurde ausgehend von Biotin 98 in 2 Schritten nach einer Vorschrift von Charvet et al.[97] in 28 % Ausbeute dargestellt.
N-(15-Oxo-19-((4S)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)-4,7,10- trioxa-14-azanonadecyl)-4-(6-(pyrimidin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzamid 100[86]
6.1 Chemische Arbeiten 123
300 mg (0,8 mmol, 1 eq) Tetrazinsuccinimidylester 87 wurden in 15 mL abs. DMF und 1,5 mL abs. Pyridin gelöst. 390 mg (0,88 mmol, 1,1 eq) Amin 97 wurden in 1 mL abs. DMF gelöst, zugegeben und die Lösung wurde für 30 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der rote Rückstand wurde in 40 mL DCM aufgenommen, mit 40 mL H2O gewaschen und die wässrige Phase wurde dreimal mit je 40 mL DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit 40 mL H2O gewaschen, über MgSO4 getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Nach säulenchromatographischer Aufreinigung (DCM/ MeOH 8:1 zu 7:1) wurde das Produkt (98 mg, 17 % Ausbeute) als roter kristalliner Feststoff erhalten.
DC: Rf = 0,1 (DCM/MeOH 10:1)
1H-NMR (400,1 MHz, CDCl3): = 9.11 (d, J = 4.9 Hz, 2H; H-4‘‘ und H-6‘‘), 8.74 (d, J = 8.5 Hz, 2H; H-2 und H-6 oder H-3 und H-5), 8.09 (d, J = 8.5 Hz, 2H; H-3 und H-5 oder H-2 und H-6), 8.25 (t, J = 5.3 Hz, 1H; NH), 7.59 (t, J = 4.9 Hz, 1H; H-5‘‘), 6.7 (t, J = 5.5 Hz, 1H; NH), 6.46 (bs, 1H; NH), 4.47 (dd, J = 7.9, 4.7 Hz, 1H; CHNH), 4.26 (dd, J = 7.8, 4.6 Hz, 1H; CHNH), 3.72-3.47 (m, 16H; CH2CH2O und CH2), 3.26 (q, J = 6.2 Hz, 2H; CH2), 3.08 (td, J = 7.3, 4.5 Hz, 1H; CHS), 2.84 (dd, J = 12.8, 4.8 Hz, 1H; CHexo), 2.7 (d, J = 12.7 Hz, 1H; CHendo), 2.14 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH2), 1.92 (quin., J = 5.8 Hz, 2H; CH2), 1.81-1.55 (m, 6H; CH2), 1.36 (quin., J = 7.3 Hz, 2H; CHCH2) ppm
13C-NMR (100,6 MHz, CDCl3): = 173.3, 166.3, 164.2, 164.0, 163.2, 159.4 (quartäre C), 158.5 (C-4‘‘ und C-6‘‘), 139.1, 133.6 (quartäre C), 128.9 (C-2 und C-6 oder C-3 und C-5), 128.3 (C-3 und C-5 oder C-2 und C-6), 122.8 (C-5‘‘), 70.7, 70.5, 70.5, 70.3, 70.0, 69.9 (OCH2), 61.9 (CHNH), 60.3 (CHNH), 55.7 (CHS), 40.6 (CH2S), 39.1, 37.7, 36.1, 29.1, 28.9, 28.3, 28.2, 25.8 (CH2) ppm
ESI-TOF-HRMS: ber.: [M+H]+: 709.3239, [M+Na]+: 731.3058, [M+K]+: 747.2798; gef.:
[M+H]+: 709.3217, [M+Na]+: 731.3037, [M+K]+: 747.2788
124 Experimenteller Teil
N-(15-Oxo-19-((4S)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)-4,7,10- trioxa-14-azanonadecyl)-6-(6-(pyridin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)nicotinamid 101
395 mg (1,04 mmol, 1 eq) Tetrazinsuccinimidylester 88 wurden in 20 mL abs. DMF und 2 mL abs. Pyridin gelöst. 510 mg (1,1 mmol, 1,1 eq) Amin 97 wurden in 5 mL abs. DMF gelöst und während 30 min bei RT zugetropft. Nach Rühren für 20 h wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der rote Rückstand wurde säulenchromatographisch (DCM/ MeOH 10:1 zu 8:1) aufgereinigt. Das Produkt (74 mg, 10 % Ausbeute) wurde als roter kristalliner Feststoff erhalten.
DC: Rf = 0,28 (DCM/MeOH 10:1)
1H-NMR (400,1 MHz, CDCl3): = 9.37 (d, J = 1.55 Hz, 1H; 2), 8.97 (d, J = 4.16 Hz, 1H; H-6‘‘), 8.79 (d, J = 8.06 Hz, 1H; H-5), 8.74 (d, J = 8.06 Hz, 1H; H-4), 8.51 (dd, J = 8.10, 2.13 Hz, 1H; H-3‘‘), 8.09 (t, J = 5.15 Hz, 1H; NH), 8.03 (dt, J = 8.06 , 1.52 Hz, 1H; H-4‘‘), 7.60 (dq, J = 4.85, 0.84 Hz, 1H; H-5‘‘) 6.72 (t, J = 5.11 Hz, 1H; NH), 6.23 (s, 1H; NH), 5.72 (s, 1H; NH), 4.50 (dd, J = 4.85, 2.88 Hz, 1H; CHNH), 4.31 (dd, J = 4.85, 2.84 Hz, 1H; CHNH), 3.72-3.51 (m, 12H; CH2CH2O), 3.49 (quint., J = 5.97 Hz, 2H; CH2), 3.28 (q, J = 7.51, 5.81 Hz, 2H; CH2), 3.15-3.07 (m, 1H; CHS), 2.88 (dd, J = 6.51, 5.11 Hz, 1H; CHexo), 2.73 (d, J = 12.9 Hz, 1H;
CHendo), 2.16 (t, J = 7.54 Hz, 2H; CH2), 1.94 (quint., J = 5.55 Hz, 2H; CH2), 1.79-1.53 (m, 6H;
CH2), 1.39 (quint., J = 7.29 Hz, 2H; CH2) ppm
13C-NMR (100,6 MHz, CDCl3) ): = 173.41, 164.64, 164.20, 163.81, 163.58, 151.59 (quaternäre C), 151.12 (C-6‘‘), 149.83 (C-2), 149.65, 137.84 (C-4‘‘), 137.16 (C-3‘‘), 132.89 (quaternäres C), 127.01 (C-5‘‘), 124.82 (C-5), 124.26 (C-4), 70.50, 70.43, 70.41, 70.19, 70.00 (CH2), 62.05 (CHNH), 60.40 (CHNH), 55.66 (CHS), 40.62, 39.06, 37.83, 35.99, 29.05, 28.79, 28.22, 28.08, 25.67, 25.60 (CH2) ppm
6.1 Chemische Arbeiten 125
ESI-TOF-HRMS: ber.: [M+H]+: 709.3239, [M+Na]+: 731.3058, [M+K]+: 747.2798; gef.:
[M+H]+: 709.3050, [M+Na]+: 731.3229, [M+K]+: 747.2790
N-(15-oxo-19-((4S)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)-4,7,10-trioxa-14-azanonadecyl)-4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzamid 102
87 mg (0.29 mmol, 1 eq) Tetrazinsuccinimidylester 89 wurden in 5 mL abs. DMF und 500 µL abs. Pyridin gelöst. 129.4 mg (0.29 mmol, 1 eq) Amin 97 wurden in 3 mL abs. DMF gelöst und während 30 min bei RT zugetropft. Nach weiteren 2 h Rühren wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der rote Rückstand wurde säulenchromatographisch (DCM/ MeOH 10:1 bis 5:1) aufgereingt. Erhalten wurden 16.6 mg (9 % Ausbeute) roter Feststoff.
DC: Rf = 0,15 (DCM/MeOH 8:1)
1H-NMR (400,1 MHz, CDCl3): = 10.26 (s, 1H; H-6‘), 8.67 (d, J = 8.5 Hz, 2H; H-2 und H-6 oder H-3 und H-5), 8.08 (d, J = 8.5 Hz, 2H; H-2 und H-6 oder H-3 und H-5), 7.68 (t, J = 5.4 Hz; 1H; NH), 6.53 (t, J = 5.5 Hz; 1H; NH), 6.07 (s, 1H; NH), 5.27 (s, 1H; NH), 4.51-4.43 (m, 1H; CHNH), 4.32-4.23 (m, 1H; CHNH), 3.27-3.44 (m, 16H; CH2), 3.29 (q, J = 6.2 Hz; 2H;
CH2), 3.11 (td, J = 7.4, 4.5 Hz, 1H; CHS), 2.94-2.83 (m, 1H; CHexo), 2.71 (d, J = 12.8 Hz, 1H;
CHendo), 2.16 (t, J = 7.4 Hz, 2H; CH2), 1.97-1.54 (m, 8H; CH2), 1.40 (quint., J = 7.7 Hz; 2H;
CHCH2) ppm
13C-NMR (100,6 MHz, CDCl3) ): = 173.2, 166.4, 166.1, 163.7 (quaternäre C), 158.1 (C-6‘), 139.0 (quaternäre C), 134.0 (C-2 und C-6 oder C-3 und C-5), 128.3 (C-2 und C-6 oder C-3 und C-5), 70.7, 70.5, 70.5, 70.3, 70.1, 70.0 (OCH2), 61.9 (CHNH), 60.2 (CHNH), 55.6 (CHS), 40.7 (CH2S), 39.1, 37.9, 36.1, 29.1, 28.9, 28.3, 28.2, 25.7 (CH2) ppm
ESI-TOF-HRMS: ber.: [M+H]+: 631.3021, [M+Na]+: 653.2840, [M+K]+: 669.2580; gef.:
[M+H]+: 631.3009, [M+Na]+: 653.2834, [M+K]+: 669.2579
126 Experimenteller Teil
6.1.2.4 Farbstoffkonjugate
Tert-butyl (3-(2-(2-(3-aminopropoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)carbamat 91[96]
Der monogeschützte Linker 91 wurde analog Braun et al.[96] in 94 % Ausbeute als gelbes Öl erhalten. Das Produkt enthielt auch geringe Spuren an doppelgeschütztem Produkt. Es wurde so weiter umgesetzt.
2-(6-(Diethylamino)-3-(diethyliminio)-3H-xanthen-9-yl)-5-(N-(2,2-dimethyl-4-
oxo-3,9,12,15-tetraoxa-5-azaoctadecan-18-yl)sulfamoyl)benzensulfonat 93[103]
Verbindung 93 wurde nach einer modifizierten Vorschrift von Anderson[103] dargestellt.
1 g (1,73 mmol, 1 eq) Lissaminsulfonylchlorid 92 wurde in 50 mL abs. DMF und 711 µL (4,2 mmol, 2,4 eq) DIPEA gelöst. 664 mg (2,1 mmol, 1,2 eq) Linker 91 wurde in 1 mL abs.
DMF gelöst und bei RT zu getropft. Für 24 h wurde bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der rote Rückstand wurde säulenchromatographisch (DCM/
MeOH 10:1) aufgreinigt. Erhalten wurden 927 mg (62 % Ausbeute) roter öliger Feststoff.
DC: Rf = 0,25 (DCM/MeOH 10:1)
1H-NMR (400,1 MHz, CDCl3): = 8.70 (d, J = 1.8 Hz, 1H; Ar), 8.01 (s, 1H; Ar), 7.98 (dd, J = 7.9, 1.9 Hz), 7.26 (d, J = 9.45 Hz, 2H; Ar), 7.20 (d, J = 7.9 Hz, 1H; Ar), 6.81 (dd, J = 9.5, 2.4, 2H; Ar), 6.67 (d, J = 2.5 Hz, 2H; Ar), 3.72-3.47 (m, 20H;CH2CH2O), 3.19 (t, J = 6.5 Hz;
6H, 3x CH2), 2.94(s, 6H; 2x CH3), 2.87 (s, 6H; 2x CH3), 1.86-1.69 (m, 4H; 2x CH2)1.41 (s, 9H;
3x CH3), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 12H; 4x CH3) ppm
6.1 Chemische Arbeiten 127
5-(N-(3-(2-(2-(3-aminopropoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)sulfamoyl)-2-(6-(diethylamino)-3-(diethyliminio)-3H-xanthen-9-yl)benzensulfonat 94[103]
924 mg(1 mmol, 1 eq) 93 wurde in 20 mL DCM und 20 mL TFA gelöst und über Nacht bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand wurde säulenchromatographisch (DCM/ MeOH 10:1 bis 5:1) auf gereinigt. Erhalten wurde 1 g roter Feststoff. Das Produkt lag als TFA Salz vor und wurde so weiter umgesetzt.
DC: Rf = 0,1 (DCM/ MeOH 7:1)
1H-NMR (400,1 MHz, CDCl3): = 8.65 (d, J = 1.9 Hz, 1H; Ar), 8.11 (dd, J = 8.0, 1.9 Hz, 1H;
Ar), 7.53 (d, J = 8.0 Hz, 1H; Ar), 7.40 (d, J = 9.5 Hz, 2H; Ar), 7.0 (dd, J = 9.5, 2.4 Hz, 1H; Ar), 6.94 (d, J = 2.4 Hz, 2H; Ar) 3.75-3.52 (m, 20H; 4x NCH2CH3, 6x OCH2), 3.16-3.05 (m, 4H;
CH2NHSO2, CH2NH2), 1.92 (quint. J = 6.4 Hz, 2H; CH2CH2CH2NHSO2), 1.80 (quint. J = 6.4 Hz, 2H; CH2CH2CH2NHSO2), 1.30 (t, J = 7.1 Hz, 12H; 4x CH2CH3) ppm
13C-NMR (100,6 MHz, CDCl3) ): = 159.4, 157.5, 157.1, 147.1, 143.8, 135.4, 133.6, 132.60, 129.3, 127.7, 115.3, 115.0, 97.0 (Ar), 71.4, 71.2, 71.1, 70.2, 69.4 (6x OCH2), 46.8, (2x NCH2CH3), 41.7, 39.9 (2x CH2CH2NH), 30.7, 28.1 (2x CH2), 12.9 (4x CH3) ppm
128 Experimenteller Teil
2-(6-(Diethylamino)-3-(diethyliminio)-3H-xanthen-9-yl)-5-(N-(1-oxo-1-(4-(6-
(pyrimidin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)-6,9,12-trioxa-2-azapentadecan-15-yl)sulfamoyl)benzensulfonat 95
246 mg (0,65 mmol, 1 eq) Tetrazinsuccinimidylester 87 wurden in 25 mL abs. DMF und 2 mL abs. Pyridin gelöst. 495 mg (0,65 mmol, 1 eq) Amin 94 wurden in 10 mL abs. DMF und 500 µL abs. Pyridin gelöst und zugetropft. Anschließend wurde 134 µL (0,78 mmol, 1,2 eq) DIPEA zugegeben und über Nacht rühren gelassen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde säulenchromatographisch (DCM/ MeOH 8:1) gereinigt. Erhalten wurden 246 mg (37 % Ausbeute) eines roten kristallinen Feststoffs.
DC: Rf = 0,6 (DCM/ MeOH 5:1)
1H-NMR (400,1 MHz, CDCl3): = 9.15 (d, J = 4.8 Hz, 2H; H-4‘‘ und H-6‘‘), 8.86 (d, J = 1.8 Hz, 1H; Ar-H), 8.63 (d, J = 8.5 Hz, 2H; H-2 und H-6 oder H-3 und H-5), 8.22-8.14 (m, 1H; NH), 8.12 (d, J = 8.5 Hz, 2H; H-2 und H-6 oder H-3 und H-5), 8.05-8.00 (m, 1H; Ar-H), 7.61 (t, J = 4.9 Hz, 1H; H-5‘‘), 7.36-7.17 (m, 2H; Ar-H), 6.75 (dd, J = 9.6, 2.4 Hz, 2H; Ar-H), 6.58 (d, J = 2.4 Hz, 2H; Ar-H), 3.82-3.62 (m, 12H, CH2), 3.58-3.45 (m, 8H; CH2CH3), 3.28 (t, J = 6.0 Hz, 2H, CH2), 2.02-1.82 (m, 8H; CH2), 1.25 (t, J = 6.9 Hz, 12H; CH2CH3) ppm
LC-MS: tR = 8.8 min (EC 125/4 Nucleodur C18, 3 µM von Machery Nagel, 0,4 mL/min, 20-95 % MeCN in 10 min, H2O und MeCN mit 0,1 % HCOOH)
ber.: [M+H]+: 1023,39; gef.: [M+H]+: 1023,35; [M+2H]2+: 512,50
6.1 Chemische Arbeiten 129
6.1.2.5 Komponenten für die kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition 3-Azido-7-hydroxy-2H-chromen-2-on 108[102]
Verbindung 108 wurde analog einer Vorschrift von Sivakumar et al.[102] in 10 % Ausbeute als brauner Feststoff erhalten.
3-Azido-7-(diethylamino)-2H-chromen-2-on 109[102]
Verbindung 109 wurde als brauner Feststoff laut einer Vorschrift von Sivakumar et al.[102]
in 13 % Ausbeute über 3 Stufen erhalten.
3,3',3''-(4,4',4''-(Nitrilotris(methylen))tris(1H-1,2,3-triazol-4,1-diyl))tris(propan-1-ol) 20[56]
Verbindung 20 wurde nach einer Vorschrift von Hong et al.[56] in 32 % Ausbeute über zwei Stufen synthetisiert.
130 Experimenteller Teil