6.2 Zellbiologische Arbeiten
6.2.3 Fluoreszenzmikroskopie
Für fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen wurden ein TCS SP5-Mikroskop der Firma Leica mit einem 63 x 1.20 Wasser UV Objektiv bzw. ein LSM 510 Meta der Firma Zeiss mit einem 40 x 1.3-NA-Plan-Neofluar-Öl-DIC-Immersionsobjektiv verwendet. Die Anregungswellenlängen betrugen 405 nm, 488 nm, 543 nm oder 633 nm.
Inkubation der Zellen mit synthetisierten Kohlenhydratderivaten
Für die Herstellung der Stammlösungen an synthetisierten Zuckern wurden entsprechende Mengen jeweils in PBS Puffer gelöst und die Lösungen wurden über einen Spritzenvorsatzfilter mit 0,2 µm Porengröße steril filtriert. Die Konzentration der Stammlösungen betrug 2 mM bzw. 4 mM.
Für fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen wurden die Zellen in ibiTreat µ-Slide 8 well Zellkulturschälchen der Firma ibidi ausgesät. Die Zelldichte betrug dabei 5000-7000 Zellen/ cm2 und das Volumen pro Kammer 270 µL. Bei der Verwendung von HEK293-T-Zellen wurden die Kammern vor dem Aussäen der HEK293-T-Zellen mit Poly-L-Lysin [10 µg/mL] und Fibronectin [4 µg/mL] für 1 h bei 37 °C inkubiert und anschließend zweimal mit PBS gewaschen. Nach Anwachsen der Zellen über Nacht wurde die entsprechende Menge an
136 Experimenteller Teil
Zuckerstammlösung mit dem jeweiligen Medium gemischt und auf die Zellen gegeben, so dass das Endvolumen pro Kammer 300 µL betrug. Die Zellen wurden 2-3 Tage mit diesem Medium kultiviert. Als Kontrolle wurden Zellen ohne zusätzlichen Zucker 2-3 Tage kultiviert.
Ligationsreaktionen mit lebenden Zellen
Nachdem die Zellen für 2 bis 3 Tage mit oder ohne zusätzlichen Zucker kultiviert worden waren, wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden zweimal mit je 300 µL PBS gewaschen und die entsprechende Ligationsreaktion wurde wie im Folgenden beschrieben durchgeführt.
Ligationsreaktionen mit fixierten und permeabilisierten Zellen
Nachdem die Zellen für 2 bis 3 Tage mit oder ohne zusätzlichen Zucker kultiviert worden waren, wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden zweimal für je 5 min mit je 300 µL PBS Puffer gewaschen und die Zellen wurden unter Standardbedingungen fixiert und permeabilisiert und anschließend wurde die Ligationsreaktion durchgeführt.
Diels-Alder-Reaktion mit inversem Elektronenbedarf
Von den Tetrazinkonjugaten wurden Stammlösungen in DMSO [40 mM] bzw. in PBS [5 mM] hergestellt und aliquotiert bei -20 °C aufbewahrt. Direkt vor der Verwendung wurde die entsprechende Menge an Stammlösung mit Medium verdünnt, so dass die gewünschte Endkonzentration erhalten wurde. Die Zellen wurden mit dieser Mischung in der Regel 2 bis 6 h bei 37 °C inkubiert. Dabei betrug das Volumen pro Kammer 300 µL.
Anschließend wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden zweimal für 5 min mit je 300 µL PBS gewaschen. Bei den Ligationsreaktionen mit Tetrazin-Farbstoff-Konjugaten wurden je 300 µL Medium zu den Zellen gegeben und anschließend mit dem Fluoreszenzmikroskop analysiert. Bei den Ligationsreaktionen mit Tetrazin-Biotin-Konjugaten wurde ebenfalls das Medium entfernt, die Zellen wurden zweimal für 5 min mit je 300 µL PBS Puffer gewaschen und es folgte eine Inkubation mit AlexaFluor-647-markiertem Streptavidin. Dies wurde als Stammlösung in PBS [2 mg/mL] von Invitrogen bezogen und in der Regel 1:300 bzw. 1:600 mit Medium verdünnt. Das Volumen betrug 200 µL pro Kammer. Die Zellen wurden damit 20 min bei RT inkubiert, dann wurde zweimal für 5 min mit je 300 µL PBS gewaschen und es wurde jeweils 300 µL Medium zugegeben und mikroskopiert.
6.2 Zellbiologische Arbeiten 137
Kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition
Für die kupferkatalysierte Clickreaktion wurden zwei verschiedene Varianten verwendet.
Entweder wurden alle Komponenten für die Ligation von Invitrogen bezogen (ClickiT-Kit C10269, siehe Tabelle 11) oder die nötigen Komponenten wurden selbst zusammengestellt (siehe Tabelle 12). In beiden Fällen wurden zunächst Reaktionslösungen nach den genannten Schemata hergestellt. Dabei war es wichtig, dass die Komponenten in der angegeben Reihenfolge zusammengegeben wurden. Nach dem Mischen wurden die Lösungen zügig für die Inkubation der Zellen verbraucht.
Tabelle 11 Zusammenstellung der Lösung für die kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition unter Verwendung eines ClickiT-Kits der Firma Invitrogen
Verdünnung ClickiT 1X Reaction buffer (Komponente D) -
CuSO4 (100 mM, Komponente E) 1:1000 488-Alkin bzw.
AlexaFluor-488-Azid (1mM in DMSO)
1:500 (Endkonzentration 2 µM) bzw. 1:250 (Endkonzentration 4 µM)
1X buffer additive (Komponente F) 1:10
Tabelle 12 Zusammenstellung der Lösung für die kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition
Verdünnung
PBS Puffer -
CuSO4 [50 mM in PBS] 1:500 (Endkonzentration 100 µM) bzw.
1:1000 (Endkonzentration 50 µM) Aminoguanidin 112 [1 M in PBS] 1:1000
THPTA 20 [1 M in PBS] 1:4000
Coumarin [40 mM in DMSO] 1:800 (Endkonzentration 50 µM) bzw.
1:400 (Endkonzentration 100 µM) Natriumascorbat [1 M in PBS] 1:100
Kupferfreie Azid Alkin Cycloaddition
Es wurden Stammlösungen von AlexaFluor-488-markiertem Dibo 106 in DMSO [1 mM]
oder von biotinmarkiertem Dibo 107 in PBS Puffer [2 mM] hergestellt und aliquotiert bei -20 °C aufbewahrt. Vor Verwendung wurde die entsprechende Menge mit Medium gemischt, so dass die gewünschte Endkonzentration erhalten wurde. Die Zellen wurden
138 Experimenteller Teil
mit dieser Mischung für 30 min bei RT inkubiert und anschließend zweimal für 5 min mit je 300 µL PBS Puffer gewaschen. Für die Ligation mit biotinmarkiertem Dibo 107 wurde nach der Inkubation zusätzlich 20 min bei RT mit AlexaFluor-647-markiertem Streptavidin [2 mg/mL, 1:300 mit Medium verdünnt] inkubiert und die Zellen anschließend zweimal für 5 min mit PBS gewaschen. Es wurden jeweils 300 µL Medium in die Kammern gegeben und die Zellen wurden fluoreszenzmikroskopisch analysiert.
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A Anhang
A.1 Ausgewählte Spektren
Abbildung 6.2 1H-NMR-Spektrum (CDCl3, 400.1 MHz) von 48
144 Anhang
Abbildung 6.3 13C-NMR-Spektrum (CDCl3, 100.6 MHz) von 48
Abbildung 6.4 1H-NMR-Spektrum (CDCl3, 400.1 MHz) von 49-
A.1 Ausgewählte Spektren 145
Abbildung 6.5 13C-NMR-Spektrum (CDCl3, 100.6 MHz) von 49-
Abbildung 6.6 1H-NMR-Spektrum (CDCl3, 400.1 MHz) von 49-
146 Anhang
Abbildung 6.7 13C-NMR-Spektrum (CDCl3, 100.6 MHz) von 49-
Abbildung 6.8 1H-NMR-Spektrum (CDCl3, 400.1 MHz) von 50-
A.1 Ausgewählte Spektren 147
Abbildung 6.9 13C-NMR-Spektrum (CDCl3, 100.6 MHz) von 50-
Abbildung 6.10 1H-NMR-Spektrum (CDCl3, 400.1 MHz) von 50-
148 Anhang
Abbildung 6.11 13C-NMR-Spektrum (CDCl3, 100.6 MHz) von 50-
Abbildung 6.12 1H-NMR-Spektrum (DMSO-d6, 400.1 MHz) von 37
A.1 Ausgewählte Spektren 149
Abbildung 6.13 13C-NMR-Spektrum (DMSO-d6, 100.6 MHz) von 37
Abbildung 6.14 1H-NMR-Spektrum (CDCl3, 400.1 MHz) von 62
150 Anhang
Abbildung 6.15 13C-NMR-Spektrum (CDCl3, 100.6 MHz) von 62
Abbildung 6.16 1H-NMR-Spektrum (DMSO-d6, 400.1 MHz) von 63
A.1 Ausgewählte Spektren 151
Abbildung 6.17 13C-NMR-Spektrum (DMSO-d6, 100.6 MHz) von 63
Abbildung 6.18 1H-NMR-Spektrum (CDCl3, 400.1 MHz) von 68
152 Anhang
Abbildung 6.19 13C-NMR-Spektrum (CDCl3, 100.6 MHz) von 68
Abbildung 6.20 1H-NMR-Spektrum (CDCl3, 400.1 MHz) von 73
A.1 Ausgewählte Spektren 153
Abbildung 6.21 13C-NMR-Spektrum (CDCl3, 100.6 MHz) von 73
Abbildung 6.22 1H-NMR-Spektrum (CDCl3, 400.1 MHz) von 74
154 Anhang
Abbildung 6.23 13C-NMR-Spektrum (CDCl3, 100.6 MHz) von 74
Abbildung 6.24 1H-NMR-Spektrum (DMSO-d6, 400.1 MHz) von 78
A.1 Ausgewählte Spektren 155
Abbildung 6.25 13C-NMR-Spektrum (DMSO-d6, 100.6 MHz) von 78
Abbildung 6.26 1H-NMR-Spektrum (CDCl3, 400.1 MHz) von 82
156 Anhang
Abbildung 6.27 13C-NMR-Spektrum (CDCl3, 100.6 MHz) von 82
Abbildung 6.28 1H-NMR-Spektrum (CDCl3, 400.1 MHz) von 86
A.1 Ausgewählte Spektren 157
Abbildung 6.29 13C-NMR-Spektrum (CDCl3, 100.6 MHz) von 86
Abbildung 6.30 1H-NMR-Spektrum (CDCl3, 400.1 MHz) von 100
158 Anhang
Abbildung 6.31 13C-NMR-Spektrum (CDCl3, 100.6 MHz) von 100
Abbildung 6.32 1H-NMR-Spektrum (CDCl3, 400.1 MHz) von 101
A.1 Ausgewählte Spektren 159
Abbildung 6.33 13C-NMR-Spektrum (CDCl3, 100.6 MHz) von 101
Abbildung 6.34 1H-NMR-Spektrum (CDCl3, 400.1 MHz) von 102
160 Anhang
Abbildung 6.35 13C-NMR-Spektrum (CDCl3, 100.6 MHz) von 102
Abbildung 6.36 1H-NMR-Spektrum (CDCl3, 400.1 MHz) von 95