Strukturveränderungen durch DEK

Die Bindung von DEK an proteinfreie DNA, wie an SV40 Minichromosomen, verursacht drastische Strukturveränderungen dieser Substrate. Dies konnte über die Sedimentationsanalysen (Abbildung 4.19), die elektronenmikroskopischen Analysen (Abbildung 4.20) und dem Mikrokokkennuklease-Abbau (Abbildung 4.21) von DEK-gebundener DNA und Minichromosomen nachgewiesen werden.

Die Sedimentatiosanalysen zeigen, dass der S-Wert sowohl von DNA, als auch von Minichromosomen in Gegenwart von DEK erhöht ist, wobei der Effekt für die DNA drastischer ist als für die Minichromosomen (Abbildung 4.19, vgl. A und B). Die gesamte DNA ist schon bei geringen DEK-Mengen im Pellet des Gradienten zu finden, was auf sehr große Komplexe hindeutet (Abbildung 4.19, A DEK/DNA = 45).

Der S-Wert der Minichromosomen erhöht sich zwar auch, allerdings nie so stark, dass die Minichromosomen durch den Gradienten in das Pellet sedimentierten (Abbildung 4.19, B). Dies spiegelt auch die Ergebnisse der Bandshiftanalysen wider, denn auch hier konnten bei der Bindung von DEK an proteinfreie DNA große DNA/Protein-Komplexe detektiert werden, die sich hier in den Geltaschen wieder finden. Die Bindung an die Minichromosomen dagegen bildet zwar auch DNA/Protein-Komplexe, die aber bei Weitem nicht so groß sind wie mit DNA, denn hier ist kaum DNA in den Geltaschen zu finden (Abbildung 4.3, A vgl. Spuren 8-9).

DEK sedimentiert immer in den gleichen Fraktionen wie die DNA oder das Chromatin, was beweist, dass DEK tatsächlich auch während der Zentrifugation an sein Substrat gebunden bleibt (Abbildung 4.19, A und B, Westernblotanalyse). Bei einem DEK/DNA-Verhältnis von 90 sind die Substrate gesättigt und es erscheint freies, ungebundenes DEK in den ersten Fraktionen des Gradienten. Dennoch verändern die Minichromosomen bei den Bandshiftanalysen auch mit höheren DEK/DNA-Verhältnissen noch weiter ihre Mobilität (Abbildung 4.3, A Minichromosomen Spuren 6-10). Ein DEK/DNA-Verhältnis von 90 entspricht umgerechnet zwei bis drei DEK-Molekülen pro Nukleosom. Da bekannt ist, dass DEK bevorzugt mit den Histonen H2A/H2B interagiert (Alexiadis et al. 2000), könnte es sein, dass DEK an alle vorhandenen Histone H2A/H2B bindet, alle weiteren Bindungen von DEK, beispielsweise über Protein-Protein-Wechselwirkung, scheinen nicht mehr so stark zu sein als dass sie die Zentrifugationsbedingungen überstehen

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würden. Wenn die Histone bei der Bindung von DEK an Minichromosomen beteiligt sind, würde dies auch den unterschiedlichen Bindungsmodus von proteinfreier DNA und Minichromosomen in den Bandshiftanalysen erklären.

Ebenso wie die Bandshift- und die Sedimentationsanalysen zeigen auch die Daten der Elektronenmikroskopie unterschiedliche Effekte von DEK auf proteinfreie DNA und Chromatin (Abbildung 4.20, vgl A und C). Die Bindung an proteinfreie DNA scheint kooperativ zu sein, denn man findet immer eine Mischpopulation an Molekülen, die auch bei hohen DEK/Verhältnissen immer noch 24 % freie DNA-Moleküle beinhaltet. Die Bindung beginnt an einer oder zwei Stellen auf der DNA mit einem einzelnen oder mehreren DEK-Molekülen zu beginnen (Abbildung 4.20, A b), dann erfolgt wahrscheinlich über Oligomerisierung entweder eine Schleifenbildung (Abbildung 4.20, A c) oder es binden weitere DEK-Moleküle in Folge an die DNA, so dass zwei gegenüberliegend DNA-Stränge miteinander verknüpft werden. Dies kann entweder intra- (Abbildung 4.20, A d) oder intermolekular (Abbildung 4.20, A e) geschehen. Diese intermolekular verbundenden Moleküle gehören wahrscheinlich zu der DNA-Population, die im Bandshift in den Geltaschen und bei den Sedimentationsanalysen im Pellet zu finden ist.

Ein gänzlich anderes Bild zeigt sich bei den Minichromosomen, denn hier werden die Chromatinmoleküle sehr stark kompaktiert und es findet keine intermolekulare Wechselwirkung statt, sondern ausschließlich intramolekulare (Abbildung 4.20, C).

Die Population der Moleküle ist auch viel homogener, so kann wie hier dargestellt für jedes DEK/DNA-Verhältnis ein typisches Molekül abgebildet werden. Mit steigender DEK-Menge erfahren die Minichromosomen eine immer stärkere Kompaktierung, die bei einem DEK/DNA-Verhältnis von 90 bis zu 10% des Umfangs ohne DEK betragen kann (Abbildung 4.20, C vgl. a und e). Wie in Abbildung 4.20, C f zu sehen ist, ist dieser Effekt allein auf DEK und nicht auf technische Probleme beim Spreiten zurückzuführen, denn hier ist das Molekül aus Abbildung 4.20, C e in einer kleineren Vergrößerung dargestellt. In direkter Nachbarschaft befindet sich ein optimal gespreitetes DNA-Molekül, das zur Kontrolle in die Ansätze gegeben wurde. Auch diese Ergebnisse bestätigen die Bandshift- und Sedimentationsanalysen, da hier keine intermolekularen Wechselwirkungen stattfinden, können auch keine großen Komplexe in den Geltaschen oder in den Pellets der Gradienten detektiert werden.

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Beim Mikrokokkennuklease-Abbau ist zunächt festzustellen, dass DEK sowohl die proteinfreie DNA, als auch die Minichromosomen generell unzugänglicher für die Nuklease macht (Abbildung 4.21). Dies konnte für Minichromosomen auch schon mit dem Restriktionsenzym MboI gezeigt werden (Alexiadis et al. 2000). DEK schützt ca.

80 bis 150 bp proteinfreier DNA vor dem Abbau. Da in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass die DNA nicht um DEK gewunden ist (Abbildung 4.16), muss es sich um mehrere DEK-Moleküle handeln, die eng aneinander auf der DNA binden, denn für ein einzelnes DNA-Molekül wäre diese DNA-Länge zu groß. Dies korreliert sehr gut mit den Daten der Elektronenmikrokopie, bei denen man direkt sehen kann, dass die DEK-Moleküle nebeneinander auf der DNA gebunden sind (Abbildung 4.20, A d).

Die Histonoktamere sitzen bei den Minichromosomen in regelmäßigen Abständen auf der DNA. Dies wird durch die diskreten Banden nach dem Mikrokokkennuklease-Verdau deutlich (Abbildung 4.21, Minichromosomen 0), denn jedes Oktamer schützt ca. 146 bp DNA vor dem Abbau. So sind in Abbildung 4.21 ein Nukleosomen-Monomer mit 146 bp und ein Dimer mit ca. 290 bp Länge zu sehen. Bindet nun DEK an diese Minichromosomen, wird die regelmäßige Positionierung der Nukleosomen zerstört (Abbildung 4.21, Minichromosomen 30 und 150), denn es finden sich keine diskreten Banden mehr, sondern eine Mischpopulation von unterschiedlich langen DNA-Fragmenten. Dennoch ist zu erkennen, dass sich die Größe der Monomerbande von ca. 146 bp auf 200 bp erhöht (Abbildung 4.21, Minichromosomen DEK/DNA = 30 und 150). Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass DEK vielleicht an die Ein- und Austrittstelle der DNA bindet.

Interessant in diesem Zusammenhang sind die SMC-Proteine (structural maintenance of chromosomes), dabei handelt es sich um sechs verschiedene Proteine, die sich immer als Dimer mit verschiedenen Nicht-SMC-Proteinen zu großen Komplexen zusammenlagern. Einer dieser Komplexe, das 13S-Kondensin, ist für die mitotische Chromosomenkondensation und die Topoisomerase II-katalysierte Trennung der Schwesterchromatiden während der Anaphase verantwortlich. Der 13S-Kodensinkomplex hat darüber hinaus weitere Funktionen in anderen Zellzyklusphasen, so scheint er durch die Ausbildung von Heterochromatin-ähnlichen Strukturen dazu beizutragen, bestimmte Chromatinbereiche still zu legen.

Dies wirkt sich in vitro wie bei DEK durch eine generelle Unzugänglichkeit für verschiedene Faktoren wie Nukleasen oder Regulatorproteinen aus (Hirano 2000;

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Hirano 2002). Wie DEK führt auch das 13S-Kondensin positive Supercoils in zirkulär geschlossene DNA ein. Allerdings braucht 13S-Kondensin hierfür, im Gegensatz zu DEK, die Energie der ATP-Hydrolyse (Kimura and Hirano 1997; Kimura et al. 1999).

Der Mechanismus, wie die Supercoils eingeführt werden, ist noch nicht genau bekannt. Es wird sowohl ein „Wrapping“- als auch ein „Looping“-Mechanismus diskutiert, wodurch die DNA sehr stark kompaktiert wird. Ein weiteres gemeinsames Merkmal von DEK und 13S-Kondensin ist die bevorzugte Bindung an Kruziform-DNA (Kimura and Hirano 1997) und die Stimulation von intramolekularen Wechselwirkungen innerhalb eines DNA-Moleküls, wie DEK dies bei den Minichromosomen bewirkt (Losada and Hirano 2001). Kohesin, ein weiterer Proteinkomplex aus der SMC-Familie, hat eine Funktion beim Zusammenhalten der Schwesterchromatiden und verhält sich in biochemischen in vitro-Studien eher wie DEK an proteinfreier DNA. Kohesin stimuliert intermolekulare Wechselwirkungen zwischen zwei oder mehreren DNA-Molekülen, führt aber keine Supercoils in die DNA ein (Losada and Hirano 2001).

DEK zeigt in verschiedenen Assays zum einen Ähnlichkeiten zu den HMGB-Proteinen, die als DNA-Chaperone in sämtlichen DNA-Transaktionen als Aktivatoren identifiziert wurden, und zum anderen sind die Strukturveränderungen durch DEK eher in die Richtung der DNA-Kompaktierung und der Inhibition dieser Prozesse einzuordnen. Es ist vorstellbar, dass DEK über posttranslationale Modifikationen reguliert wird und so seine Funktion an bestimmten Stellen am Chromatin ausführen kann, denn sowohl die Lokalisation von DEK wie auch die Menge bleibt während des Zellzykluses konstant.