Allgemeine Methoden

3.2.1 Denaturierende Polyacrylamid Gelelektrophorese

SDS Polyacryamid-Gele wurden nach (Laemmli 1970), modifiziert nach Thoma (Thoma et al. 1979), durchgeführt. Die Prozentigkeit und die Laufdauer sind bei den jeweiligen Versuchen angegeben.

3.2.2 Silber Färbung

Die Silberfärbung von Proteingelen wurde nach Wray et al. (Wray et al. 1981) durchgeführt.

Material und Methoden 25

3.2.3 Comassiefärbung

Die Comassiefärbung wurde mit 0,1% Comassie Blue in 40%Methanol/10%

Essigsäure durchgeführt. Die Entfärbung erfolgte mit 40%Methanol/10% Essigsäure.

3.2.4 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Für native PA-Gele wurde als Gel- und Laufpuffer 1xTBE verwendet. Die Prozentigkeiten und Laufzeiten sind bei den jeweiligen Versuchen angegeben. Die Geldicke betrug 1,5 mm, die Länge des Gels war 15 cm, die Spannung betrug 200 V.

3.2.5 Neutrale Agarose Gelelektrophorese

Zur Analyse von DNA Proben wurde die Methode der Agarose Gelelektrophorese angewandt. Gel- und Laufpuffer waren 0,5x TBE. Für die Topologie Untersuchungen wurden 0,8% Gele verwendet, die mit 2 V/cm für 16 h liefen.

3.2.6 Radioaktive Markierungen

3.2.6.1 Markierung mit -³²P dATP

5–10 pmol lineare DNA mit 5´-Überhang wurden mit je 7 mM dGTP, dTTP, dCTP, 20–50 µCi α-³²P dATP (Amersham/Pharmacia) und Klenow-Polymerase (10 u, Biolabs) 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz über eine Sepadex G25-Spin-Säule (Roche) von den nicht eingebauten Nukleotiden gereinigt.

Die cpm wurde im Beckmann-Szintillationszähler nach Cherenkov ermittelt.

3.2.6.2 Markierung mir -³²PATP

Die linearen DNA-Fragmente mit freiem 5´-Ende wurden mit 10 units T4-PNK im 1x PNK Puffer (Biolabs; 70 mM Tris-HCl pH 7,6; 10 mM MgCl2, 5 mM DTT) und 20–50 µCi γ-³²PATP (Amershan/Pharmacia) für 30 min bei 37°C inkubiert. Für die weitere Behandlung siehe 2.4.1.

Material und Methoden 26

3.2.7 DNA-Fällung

Um DNA zu präzipitieren wurde zu den Ansätzen 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumen 100% Ethanol gegeben, gut gemischt und für mindestens 10 min bei –20°C gefällt. Die DNA wurde für 30 min in der Eppendorf-Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit bei 4°C zentrifugiert. Danach erfolgte ein Waschschritt mit 70%-igem Ethanol, die DNA-Pellets wurden im Exikator getrocknet, in 1x Probenpuffer aufgenommen und auf Agarosegelen analysiert.

3.2.8 Proteinfällung nach Wessel-Flügge

Um Proteine zu fällen wurden die Ansätze zuerst auf 1% SDS eingestellt und für 10 min bei 60°C inkubiert um DNA-Protein-Wechselwirkungen zu zerstören. Dann wurden die Proben mit 1 Volumen 100% Methanol p.a. und _ Volumen 100%

Chloroform versetzt. Nach einer 5 minütigen Zentrifugation (Eppendorf-Zentrifuge) befinden sich die Proteine in der Interphase. Die obere wässrige Phase wurde abgenommen und verworfen. Nun wurde nochmals _ Volumen 100% Methanol zugegeben gut gemischt und wieder für 5 min zentrifugiert, die Pellet wurden 30 min bei 60°C getrocknet und dann in 1x Laemmli Probenpuffer aufgenommen und auf PA-Gelen analysiert (Wessel and Flügge 1984).

3.2.9 Westernblot-Analyse

Für die Durchführung eines Westernblots wurden die Proteine zuerst mit einer PA-Gelelektrophorese aufgetrennt, das Gel wurde dann mittels Semidry-Blotter auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Vor dem Transfer wurden die Filterpapiere und die Membran in Semidry-Puffer (48 mM Tris, 39 mM Glycin, 0,037% SDS, 20%

Methanol) getränkt, dann wurde für 1 h bei 0,8 mA/cm² transferiert. Für die Immunfärbung wurde die Membran 1 h in 1x Rotiblock (Roth) abgesättigt und danach 3x 5 min in TBST-Puffer (20 mM Tris HCl pH 7,6, 137 mM NaCl, 0,1% Tween) gewaschen. Dann erfolgte die einstündige Inkubation mit dem primären Antikörper (α-DEK Serum 1:40000 in TBST), die Membran wurde danach wieder 3x 5 min in TBST gewaschen. Die Inkubation mit dem sekundären Antikörper (α-rabbit (Peroxidase-gekoppelt), 1:10000 in TBST/0,5% Milchpulver) erfolgte ebenfalls für eine Stunde. Danach wurde die Membran 3x 10 min in TBST gewaschen. Der

Material und Methoden 27

Nachweis erfolgte mit dem ECL System von Amersham und wurde durch Röntgenfilme dokumentiert.

3.2.10 Southernblot-Analyse

Für den Nachweis von SV40 DNA mit radioaktiv markierten Sonden wurde SV40 DNA mit dem Restriktionsenzym Hinf II geschnitten und mit α-³²PdATP markiert (2.4.1). Zunächst wurde die zu analysierende DNA auf einem Agarosegel aufgetrennt. Das Gel wurde dann 45 min in Puffer 1 (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) und weitere 45 min in Puffer 2 (1 M Tris, 1,5 M NaCl, pH 7) gewaschen. Um die DNA auf eine Nylonmembran zu transferieren wurde die Methode des Kapillartransfers verwendet. Nach dem Transfer in 10x SSC-Puffer (1,5 M NaCl, 150 mM NaCitrat) wurde die Membran 2 min in Puffer 3 (0,1 M Phosphatpuffer pH 7,2, 1mM EDTA) gewaschen und dann für mindestens 10 min bei 80°C getrocknet. Um die DNA auf der Membran zu fixieren wurde sie für 2 min mit UV-Licht bestrahlt. Nun folgten weitere Waschschritte, 2x 10 min in Puffer 4 (0,2 M NaOH, 1 mM EDTA) und 2x 10 min in Puffer 3. Dann wurde die Membran in eine Hybridisierungsröhre überführt und in Hybridisierungspuffer (7 % SDS, 1 % BSA, 10 mM EDTA, 250 mM Phosphatpuffer pH 7, 2) bei 60°C im Ofen geblockt. Die radioaktiv markierte Hinf II DNA wurde mit 10 ml Hybridisierungspuffer gemischt und auf die Membran gegeben. Die Hybridisierung erfolgte bei 60°C über Nacht. Am nächsten Tag wurde die Membran mehrmals in Waschpuffer (20 mM Phosphatpuffer, 1 mM EDTA, 1 % SDS, 150 mM NaCl) gewaschen. Dann wurde eine Autoradiographie durchgeführt.

3.3 Zellkultur

3.3.1 CV1-Zellen

CV1-Zellen (Zellen der afrikanischen grünen Meerkatze) wurden in 145 mm Petrischalen als Monolayerkulturen in DMEM mit 5% FCS bei 37°C, 94%

Luftfeuchtigkeit und 5% CO2 kultiviert. Die Zellen wurden alle 2 – 3 Tage mit Trypsin/EDTA von der Platte gelöst und im Verhältnis 1:5 umgesetzt.

Material und Methoden 28

3.3.2 Hi-5 Zellen und SF9 Zellen

Hi-5 (Eizellen aus Trichoplusia ni) und SF9 (Ovarienzellen aus Spodoptera frugiperda) Zellen wurden in Zellkultur Flaschen (Greiner) als Monolayerkulturen in Grace´s Insect Medium (Gibco BRL) mit 10% FCS bei 28°C kultiviert. Die Zellen wurden alle 2 bis 3 Tage vom Flaschenboden abgeklopft und im Verhältnis 1:5 umgesetzt.

3.4 SV40

3.4.1 Präparation von SV40 DNA

Für eine Präparation wurden 10-20 konfluente CV1 Zellen (145 mm Platten) mit Wildtyp SV40 Virus infiziert. Nach 60 h wurde das Medium abgenommen und die Zellen wurden 3-4x mit PBS gewaschen. Dann wurden die Zellen für 20 min mit Hirt-Lösung (10 mM Tris-HCl pH 7, 5; 10 mM EDTA, 0,6% SDS) bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von _ Volumen 5 M NaCl wurden die Hirtüberstände über Nacht bei 4°C gefällt. Danach folgte eine Zentrifugation bei 20000 rpm, SS34, 1 h. Zu den Überständen wurden 0,6 Volumen 100 % Isopropanol gegeben. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt (9000 rpm, GS3, 15 min) befindet sich die SV40 DNA im Pellet. Das Pellet wurde daraufhin in 11 ml MOPS-Acetat gelöst. Daraufhin wurde eine Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation durchgeführt. Die CsCl Konzentration im Gradienten war 1g/ml. Nach der Zentrifugation (37000 rpm, 50Ti, 60 h, 18°C) wurde nur die Form I-Bande abgezogen, mit NaCl-gesättigtem Isopropanol wurde das CsCl ausgetauscht. Die DNA wurde 1:2 verdünnt und nochmals gefällt. Die DNA-Konzentration wurde anhand eines Standards auf einem Agarosegel geschätzt oder photometrisch bestimmt (Gruss and Knippers 1995).

3.4.2 Präparation von SV40 Minichromosomen

Für die Reinigung von SV40 Minichromosomen wurden 30 konfluente CV1 Zellen (145 mm Platten) mit Wildtyp SV40 Virus infiziert. Nach 38 h wurden die Zellen 2x mit TSS (20 mM Tris pH 7,8, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 250 mM Sucrose) und dann 2x mit LS (20 mM Hepes KOH, pH 7,8, 5 mM KAc, 0,5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT) gewaschen. Die Zellen wurden abgeschabt und in einen 5

Material und Methoden 29

ml Douncer überführt. Nach 6-maligem douncen wurden die Kerne abzentrifugiert (2638 g, 5 min). Die Kerne wurden in 200 µl HS-Puffer (20 mM Hepes KOH, pH 7,8, 500 mM Kalium Acetat, 0,5 mM MgCl2) pro Platte aufgenommen und für 2 h bei 4°C eluiert. Danach wurden die Kerne abzentrifugiert (HB-4, 4000 rpm, 5 min), der Überstand wurde dann nochmals zentrifugiert (SS34, 13000 rpm, 5 min). Dieser zweite Überstand wurde einem RNaseA (100 µg/ml; Roche) Verdau unterzogen. Je 1 ml dieses RNase-behandelten Überstandes wurde über 5%-30%-Sucrosegradienten (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA) gereinigt. Für salzgewaschene Minichromosomen wurden 500 mM NaCl, für native Minichromosomen wurden 150 mM zum Sucrosegradienten-Puffer zugegeben. Nach einer 3-stündigen Zentrifugation (SW40, 39000 rpm, 4°C) wurden die Gradienten fraktioniert. Die Fraktionen, die Minichromosomen enthielten, wurden vereinigt und über Nacht pelletiert (SW55, 55000 rpm, 16 h). Die Konzentration der Minichromosomen wurde mittels Standard auf einem Agarosegel bestimmt (Gruss and Knippers 1995).